Name: in vitro directed evolution of a restriction endonuclease with more stringent specificity
Uploaded: 2020-03-25T15:00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Directed Evolution of a Restriction Endonuclease with More Stringent Specificity at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door de subsidies van het Ministerie van Wetenschap en Hoger Onderwijs (0295/B/PO1/2008/34 aan MB en N301 100 31/3043 aan KS), van het Poolse National Science Centre (NCN) (UMO-2011/02/A/NZ1/00052, UMO-2014/13/B/NZ1/03991 en UMO-2014/14/M/NZ5/00558 naar MB) en op korte termijn EMBO fellowship naar KS (ATSF 277.00-05).

<ol>
	<li>Sch&#246;ttler, S., Wenz, C., Lanio, T., Jeltsch, A., Pingoud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+engineering+of+the+restriction+endonuclease+EcoRV--structure-guided+design+of+enzyme+variants+that+recognize+the+base+pairs+flanking+the+recognition+site.">Protein engineering of the restriction endonuclease EcoRV--structure-guided design of enzyme variants that recognize the base pairs flanking the recognition site.</a> European Journal of Biochemistry. 258 (1), 184-191 (1998).</li><li>Wenz, C., Hahn, M., Pingoud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+variants+of+the+restriction+endonuclease+EcoRV+that+depend+in+their+cleavage+activity+on+the+flexibility+of+sequences+flanking+the+recognition+site.">Engineering of variants of the restriction endonuclease EcoRV that depend in their cleavage activity on the flexibility of sequences flanking the recognition site.</a> Biochemistry. 37 (8), 2234-2242 (1998).</li><li>Samuelson, J. C., Xu, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+restriction+endonuclease+BstYI+to+achieve+increased+substrate+specificity.">Directed evolution of restriction endonuclease BstYI to achieve increased substrate specificity.</a> Journal of Molecular Biology. 319 (3), 673-683 (2002).</li><li>Samuelson, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+a+rare-cutting+restriction+enzyme:+genetic+screening+and+selection+of+NotI+variants.">Engineering a rare-cutting restriction enzyme: genetic screening and selection of NotI variants.</a> Nucleic Acids Research. 34 (3), 796-805 (2006).</li><li>Rimseliene, R., Maneliene, Z., Lubys, A., Janulaitis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+restriction+endonucleases:+using+methylation+activity+of+the+bifunctional+endonuclease+Eco57I+to+select+the+mutant+with+a+novel+sequence+specificity.">Engineering of restriction endonucleases: using methylation activity of the bifunctional endonuclease Eco57I to select the mutant with a novel sequence specificity.</a> Journal of Molecular Biology. 327 (2), 383-391 (2003).</li><li>Morgan, R. D., Luyten, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+engineering+of+type+II+restriction+endonuclease+DNA+binding+and+cleavage+specificity.">Rational engineering of type II restriction endonuclease DNA binding and cleavage specificity.</a> Nucleic Acids Research. 37 (15), 5222-5233 (2009).</li><li>Skowronek, K., Boniecki, M. J., Kluge, B., Bujnicki, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+engineering+of+sequence+specificity+in+R.MwoI+restriction+endonuclease.">Rational engineering of sequence specificity in R.MwoI restriction endonuclease.</a> Nucleic Acids Research. 40 (17), 8579-8592 (2012).</li><li>Czapinska, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+Structure+and+Directed+Evolution+of+Specificity+of+NlaIV+Restriction+Endonuclease.">Crystal Structure and Directed Evolution of Specificity of NlaIV Restriction Endonuclease.</a> Journal of Molecular Biology. 431 (11), 2082-2094 (2019).</li><li>Miller, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+by+in+vitro+compartmentalization.">Directed evolution by in vitro compartmentalization.</a> Nature Methods. 3 (7), 561-570 (2006).</li><li>Zheng, Y., Roberts, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+restriction+endonucleases+using+artificial+cells.">Selection of restriction endonucleases using artificial cells.</a> Nucleic Acids Research. 35 (11), e83 (2007).</li><li>Takeuchi, R., Choi, M., Stoddard, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redesign+of+extensive+protein-DNA+interfaces+of+meganucleases+using+iterative+cycles+of+in+vitro+compartmentalization.">Redesign of extensive protein-DNA interfaces of meganucleases using iterative cycles of in vitro compartmentalization.</a> Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 111 (11), 4061-4066 (2014).</li><li>Howland, J. L., Ausubel, F., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Short Protocols in Molecular Biology. , (1995).</li><li>Wilson, D. S., Keefe, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+8+Unit+8.3:+Random+mutagenesis+by+PCR.">Chapter 8 Unit 8.3: Random mutagenesis by PCR.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (2001).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het selectieprotocol dat hier wordt beschreven, is getest op NlaIV8, een dimeric PD-(D/E)XK-vouwherkenningssequentie die een palindromische doellocatie met centrale NN-basen herkent en een botte eindsnede tussen de NN-bases katalyseert. NlaIV werd geplukt omdat decolleté tussen de NN-bases suggereert dat deze basen dicht bij het eiwit in het complex liggen. In principe kan het protocol worden gebruikt voor elke sequentiespecifieke beperking endonuclease, monomeric of dimeric, van elke vouwgroep, waarbij dubbele strengbreuken van elke stagger worden gekaald, ongeacht of katalytische en specificiteitsdomeinen samenvallen (zoals in het NlaIV-voorbeeld) of afzonderlijk zijn (bijvoorbeeld FokI). Bovendien is het protocol in principe niet alleen nuttig voor het genereren van nieuwe, meer enge enzymspecificiteit, maar kan het ook worden gebruikt om steractiviteiten te elimineren of om high fidelity endonucleases te creëren. Dit alles is echter nog niet getest. Met name gerichte eliminatie van steractiviteit kan ingewikkeld zijn, omdat dezelfde aminozuurresiduen betrokken kunnen zijn bij het binden aan de gewenste en ongewenste basen. De in vitro stappen die in dit protocol worden beschreven, zijn niet beperkt tot de selectie van verkleinde specificiteiten, maar kunnen ook worden gebruikt om anders gewijzigde specifieke kenmerken te selecteren. Er is dan echter een probleem met variant endonucleases: als het spectrum van substraten nieuwe doelen bevat die niet door de ouderlijke endonuclease worden gespleten, is er over het algemeen geen goede manier om cellen te beschermen tegen de schadelijke effecten van deze activiteit. Als de specificiteit van endonuclease daarentegen slechts wordt verkleind, zijn de doelstellingen een subset van de wilde typedoelen, en daarom moet het reeds beschikbare cognate methyltransferase volledig beschermend zijn.
Ons protocol verschilt in verschillende opzichten van veel gerichte evolutieprotocollen. Open leesframediversiteit wordt eenmaal gegenereerd aan het begin van het experiment, niet in elke iteratie. Bovendien wordt het gemaakt door split-and-mix synthese, in plaats van door EP-PCR. Voor NNS-vervangingen van codons, zoals gebruikt in dit werk, zijn er (4 x 4 x 2)6 ~ 1,07 x 109 combinaties voor zes posities. Daarom is een bepaalde variant gemiddeld eenmaal aanwezig in 1,7 fmoles van ESC. Deze capaciteit kan worden verhoogd tot zeven posities door synthese te gebruiken met een mengsel van 20 trinucleotide precursoren die worden aangeboden door Glen Research of door de mutatiefrequentie te verlagen in minder veelbelovende posities met split-and-mix oligonucleotide synthese. Indien mogelijk wordt aanbevolen om de mate van variatie te beperken tot zes posities. Uiteraard vereist een dergelijke mutagenese targeting enige reeds bestaande kennis over ten minste de regio's van de REase die betrokken zijn bij substraatbinding. Het split-and-mix protocol om diversiteit te genereren heeft duidelijke voordelen ten opzichte van EP-PCR. Met behulp van EP-PCR verkregen we ongewijzigde varianten en sequenties met acht vervangingen voor NlaIV ESC's in dezelfde EP-PCR (tabel 4). De bibliotheek van EP-PCR bevat een aanzienlijke fractie van klonen die moeten worden vermeden (wilde type sequenties, meerdere vervangingen, frameshift en onzin mutaties, en mutaties op plaatsen die waarschijnlijk niet van invloed zijn volgorde specificiteit).
Ons protocol verschilt ook van vele andere gerichte evolutieprotocollen door de aanwezigheid van twee opeenvolgende selectiestappen. Positieve selectie zorgt ervoor dat de gewenste activiteit behouden blijft, anders wordt de biotinetag niet verwijderd en kan de coderingsvolgorde worden verwijderd door pull-down. Het is technisch mogelijk dat de toevallige opkomst van een nieuwe, niet-overlappende specificiteit (bijvoorbeeld GCATGC) ook zou kunnen leiden tot het verbreken van de biotinetag, als er een geschikte decolletéplaats aanwezig is in de buurt van het gewenste decolleté, maar niet elders. Dit zou echter hoogst onwaarschijnlijk moeten zijn. Negatieve selectie verwijdert open leesframes die coderen voor enzymen die nog steeds de ongewenste activiteit hebben. Deze stap is niet strikt verplicht, omdat het protocol de uitvoerbibliotheek nog steeds zal verrijken met varianten die in staat zijn om de selectiereeks te splijten, maar niet in staat zijn om zich elders in het ESC te kloven, waardoor het ongeschikt is voor PCR-versterking. De selectieeffectiviteit zal naar verwachting echter lager zijn omdat enzymen met de oorspronkelijke sequentiespecificiteit niet uit de output zullen worden verwijderd en veelbelovende varianten met gewijzigde specificiteit zullen overtreffen, maar ook verminderde enzymatische activiteit. Merk op dat op populatieniveau zowel gewenste als ongewenste doelsequenties kunnen, maar niet hoeven te zijn, ontaarden. In het NlaIV-voorbeeld werd het antidoel gedegenereerde en werd het doel niet gedegenereerde. Zelfs wanneer er sprake is van degeneratie op bevolkingsniveau, is in één druppel slechts één (niet-gedegenereerde) doelstelling of anti-target aanwezig. In ons protocol worden doel- en doelsequenties opnieuw geïntroduceerd bij elke herhaling van de selectiestappen. Daarom moet een open leesframe een enzym coderen dat alle mogelijke doelen kan splijten en niet in staat is om een van de antidoelen te splijten om meerdere selectierondes te overleven. Merk op dat de noodzaak om het antiselectiedoel opnieuw in te voeren bij elke iteratie van het protocol twee opeenvolgende CDR's afdwingt. De eerste PCR maakt gebruik van een primer die uitvalt buiten het anti-doel, zodat decolleté van het anti-doel de PCR-reactie voorkomt. De tweede PCR vereist een primer die verder reikt dan de anti-target, en herintroduceert anti-target, om ervoor te zorgen dat tijdens meerdere rondes van de selectie, elk open leesframe wordt getest tegen alle varianten van de anti-target.
Voor enzymen die kleverige uiteinden genereren, kan een gerelateerd alternatief protocol op basis van een eerder beschreven methode voor isolatie van REase ORF10 worden gebruikt. De uitputting van inactieve varianten door biotine-opvang die in onze experimenten wordt gebruikt, wordt in het alternatieve protocol vervangen door ligatie van de compatibele adapter met een sequentie die wordt gebruikt als primerbindingssite in een selectieve PCR (figuur 9). Alleen SER's die enzymen produceren met de geselecteerde specificiteit genereren ligatie-geschikte uiteinden en zullen daarom worden geselecteerd. De volgorde van het kleverige uiteinde van de tegengeselecteerde reeks moet zodanig zijn ontworpen dat het niet kan deelnemen aan ligatie met adapters. Iteratie van het selectieproces kan eenvoudig worden bereikt door te schakelen tussen twee verschillende adapters en dus twee verschillende reverse primers in selectieve PCR.
Zelfs met nieuwe protocollen, de taak van engineering nieuwe specifieke kenmerken in vitro is nog steeds zeer uitdagend. Voor typische type II REases zijn sequentiespecificiteit en endonunucleolytische activiteit afhankelijk van dezelfde eiwitgebieden. Het is daarom moeilijk om het ene te veranderen zonder het andere te beïnvloeden. Succes wordt waarschijnlijker gemaakt door een strategie die rekening houdt met de voetafdruk van het enzym, de symmetrie van eiwit-DNA-interacties respecteert en voortbouwt op reeds bestaande enzymatische voorkeuren, die vooraf moeten worden bepaald in biochemische experimenten, zoals werd gedaan voor het NlaIV-voorbeeld8.

Sequentie specificiteit engineering is zeer uitdagend voor klasse II REases. In deze klasse van endonucleases zijn sequentieherkenning en katalyse nauw met elkaar verweven, waarschijnlijk als een evolutionaire bescherming tegen het creëren van een endonuclease van bredere specificiteit dan zijn cognate methyltransferase, die gastheer-DNA zou beschadigen. Gerichte evolutie van nieuwe bijzonderheden in cellen wordt verder bemoeilijkt door de noodzaak om gastheer-DNA te beschermen tegen de nieuw ontworpen endonuclease-activiteit. Daarom zijn er slechts een paar succesvolle pogingen van REase engineering gemeld en ze allemaal gebruik maken van de unieke kenmerken van een bepaald enzym1,2,3,4,5,6,7.
Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor specificiteit engineering die kan worden gebruikt om endonuclease varianten die smallere specificiteit dan een ouderlijk enzym dat is gebaseerd op onze succesvolle engineering van een NlaIV endonuclease8te genereren. Voor een dergelijk enzym met een willekeurige herkenningssequentie kan extra specificiteit worden ingevoerd voor basissen in de flanken. Voor ouderlijke enzymen die gedeeltelijk gedegenereerde sequenties herkennen (zoals NlaIV met zijn GGNNCC-doel), kan ook extra specificiteit worden geïntroduceerd binnen de herkenningsreeks. Aangezien extra specificiteit waarschijnlijk eiwit-DNA contacten vereist, moeten de nieuw erkende bases binnen de voetafdruk van de ouderlijke endonuclease op DNA liggen. In principe kunnen selectieschema's worden opgezet voor elke gewenste specialisatie van de herkenningsreeks. Echter, de meeste REases die palindromische en bijna palindrische doelsequenties herkennen zijn functionele dimers die slechts een halve locatie van het palindroom herkennen. Daarom is het onwaarschijnlijk dat de selectie van nieuwe specifieke kenmerken die de symmetrie van eiwitnucleïneinteracties schenden, zal werken. Voor de dimeric NlaIV, bijvoorbeeld, de GGNNCC sequentie kan theoretisch worden beperkt tot GGATCC, maar vernauwing van de specificiteit tot GGAACC zal naar verwachting moeilijker zijn. Onze regeling omvat zowel positieve als negatieve selectie.
Het proces is efficiënter wanneer negatieve selectie ook wordt gebruikt om de specificiteiten te verwijderen die in staat zijn om alle andere sequenties dan de gewenste smallere specificiteit te splijten. Selectie voor GGATCC kan bijvoorbeeld worden gecombineerd met antiselectie tegen GGBVCC (waarbij B een andere basis dan A is en V een andere basis dan T). Wanneer sommige van de mogelijke doelsequenties niet worden gedekt, hangt de uitkomst van het selectieexperiment af van de effectiviteit van positieve en negatieve selectie. In ons NlaIV-werk hebben we gekozen voor GGATCC, en tegen GGSSCC (waar S G of C is), en kregen we een specificiteit die, het negeren van symmetriebrekende doelen, kan worden omschreven als GGWWCC (waar W A of T is), wat suggereert dat in dit specifieke geval negatieve selectie meer belangrijker dan positieve selectie.
Onze aanpak begint met het maken van een expression selection cassette (ESC). Het ESC is gestructureerd in secties. Op de binnenkant kern sectie, zijn er varianten van de open leesframe (ORF) van de REase, onder T7 promotor controle. Dit kerngedeelte van de ESC mag geen cognate site bevatten voor de engineered REase. De kern is ingeklemd tussen twee cognate sites voor wild type REase: een splitsing site voor de ongewenste activiteit (teller geselecteerde volgorde, GGSSCC in dit voorbeeld) en een splitsing site voor de gewenste activiteit (geselecteerde volgorde, GGATCC in het voorbeeld). De laatste stap van de voorbereiding van de ESC in PCR voegt biotine dicht bij de gewenste activiteit aan het 5'-einde en creëert een verscheidenheid aan tegengeselecteerde sequenties (GGSSCC in het voorbeeld). De selectiestrategie is gebaseerd op het gebruik van zorgvuldig ontworpen primers in het ESC-reamplification-protocol na een in vitro transcriptie/vertaal-/selectieprotocol (figuur 1A). De ESC-bibliotheek wordt uitgedrukt in een in vitro gecompartimenteerde transcriptie vertaling water-in-olie emulsie9,10,11. Binnen elke druppel beïnvloedt de specificiteit van het uitgedrukte enzym de toestand van de ESC (figuur 1B, stap I). Voor de beschreven regeling verwijdert de gewenste decolletéactiviteit van het vertaalde eiwit de biotinetag van het DNA, maar heeft het geen invloed op het andere ESC-einde met de door de teller geselecteerde sequentie. Wanneer de emulsie wordt verbroken, worden biotinylated fragmenten verwijderd door streptavidine affinity pulldown, zodat alleen fragmenten van druppels met de gewenste activiteit overblijven (Figuur 1B,stap II). Met deze stap worden inactieve REase-varianten verwijderd. De supernatant fractie van de pull-down stap wordt vervolgens versterkt door PCR. In de eerste PCR reactie primers F2 en R1 worden gebruikt(Figuur 1A,B, stap III). Primer F2 bindt zich aan de ESC-sectie tussen de geselecteerde volgorde en het molecuuluiteinde. Daarom worden Ser's die varianten uitdrukken die in staat zijn om de geselecteerde volgorde van de teller te splijten (en daarom de bindingsplaatsen voor primers F2 en R1 in twee verschillende DNA-moleculen te scheiden) niet versterkt en worden ze dus uit de bibliotheek verwijderd. De primer R1 bindt tussen de geselecteerde site en de kern van het ESC, zodat deze niet wordt beïnvloed door de splitsingsstatus van de geselecteerde site en de decolletésite herstelt voor de gewenste activiteit (GGATCC). De cyclus wordt afgesloten door een tweede PCR (met primers F1 en R2) die biotine toevoegt aan het 5'-uiteinde dicht bij de geselecteerde site en herstelt ontworpen variatie op de geselecteerde teller plaats dicht bij het andere uiteinde van de ESC (Figuur 1B, stap IV). Het resulterende DNA mengsel is klaar voor een nieuwe selectieronde.
Het succes van het selectieprotocol hangt sterk af van de juiste keuze van de nieuwe, strengere doelherkenningsvolgorde en van een zorgvuldig ontwerp van de mutagenesestrategie en de effectieve uitvoering ervan. Omdat het veel gemakkelijker is om te verbeteren op lichte reeds bestaande voorkeuren van de REase dan om ze te overwinnen, raden we aan om te beginnen met een kinetische studie van eventuele reeds bestaande voorkeuren. De noodzaak van zorgvuldig mutagenese ontwerp vloeit voort uit de beperkte omvang van een gemuteerde bibliotheek die kan worden verwerkt door het gepresenteerde protocol (109 klonen in een enkel experiment). Daarom kunnen alle 20 mogelijke aminozuursubstituties effectief in slechts een paar posities worden getest (zie Bespreking). Willekeurige mutagenese, zoals foutgevoelige PCR (EP-PCR) gepresenteerd als een alternatieve methode, zal leiden tot diepgaande onderbemonstering van de bestaande complexiteit. Als er informatie beschikbaar is over mogelijke aminozuurposities die betrokken zijn bij contacten met DNA (of zelfs in de nabijheid van de gedegenereerde nucleotiden in een cognate sequentie) beschikbaar is, moet het zeker worden gebruikt om een paar aminozuren te selecteren voor oligonucleotide geleide verzadigingmutagenese (protocolstappen 1.6-3.10).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1000&#197; CPG Support (dA, dT, dC, dG)</td>
			<td>Biosset</td>
			<td>45-1000-050</td>
			<td>Other vendors can be used as well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ASM-800 DNA/RNA</td>
			<td>Biosset</td>
			<td>800-001-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJET Gel Extraction Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K0691</td>
			<td>Any other kit can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glen-Pak DNA purification cartridge</td>
			<td>Glen Research</td>
			<td>60-5200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIS-Select Nickel Affinity Gel</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET 28a vector</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any other vector with T7 promoter upstream of plycloning site can be used instead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td>Any other high fidelity and highly processive thermophilic polymearse can be used instead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porous steel foil</td>
			<td>Biosset</td>
			<td>40-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid Translation System 
			RTS 100, E.coli HY Kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3 186 148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction endonucleases</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Obviously other vendors, enzymes can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Magnetic Beads</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>S1420S</td>
			<td>Other vendors can be used as well. We have positively tested beds form Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthesis chemicals including phosphoramidities</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td></td>
			<td>Other vendors can be used as well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthesis columns (different sizes)</td>
			<td>Biosset</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EL0011</td>
			<td>Any other ligase can be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro directed evolution of a restriction endonuclease with more stringent specificity

Beperking endonuclease (REase) specificiteit engineering is uiterst moeilijk. Hier beschrijven we een multistep protocol dat helpt bij het produceren van REase-varianten die een strengere specificiteit hebben dan het ouderlijke enzym. Het protocol vereist de oprichting van een bibliotheek van expressie selectie cassettes (EsCs) voor varianten van de REase, idealiter met variabiliteit in posities die waarschijnlijk dna-binding beïnvloeden. De ESC wordt aan de ene kant geflankeerd door een sequentie voor de gewenste beperkingssiteactiviteit en een biotine-tag en aan de andere kant door een beperkingssite voor de ongewenste activiteit en een primerannealing-site. De SER's worden getranscribeerd en vertaald in een water-in-olie emulsie, in omstandigheden die de aanwezigheid van meer dan een DNA-molecuul per druppel onwaarschijnlijk maken. Daarom wordt het DNA in elk cassettemolecuul alleen onderworpen aan de activiteit van het vertaalde, gecodeerde enzym. REase varianten van de gewenste specificiteit verwijderen de biotine tag, maar niet de primer annealing site. Na het breken van de emulsie worden de DNA-moleculen onderworpen aan een biotine pulldown, en alleen die in de supernatant worden behouden. Deze stap zorgt ervoor dat alleen SER's voor varianten die de gewenste activiteit niet hebben verloren, behouden blijven. Deze DNA-moleculen worden vervolgens onderworpen aan een eerste PCR-reactie. Decolleté in de ongewenste volgorde snijdt de primer binding site voor een van de primers. Daarom versterkt PCR alleen SPC's van druppels zonder de ongewenste activiteit. Vervolgens wordt een tweede PCR-reactie uitgevoerd om de beperkingssite opnieuw in te voeren voor de gewenste specificiteit en de biotinetag, zodat de selectiestap kan worden herhaald. Geselecteerde open leesframes kunnen worden overuitgedrukt in bacteriële cellen die ook de cognate methyltransferase van de ouderlijke REase uitdrukken, omdat de nieuw ontwikkelde REase zich richt op slechts een subset van de methyltransferase doellocaties.

Dit protocol is slechts een hulpmiddel om de frequentie van de gewenste varianten van een engineered REase te verhogen door twee ongewenste klassen uit te putten (maar niet te elimineren): inactieve enzymen en endonucleases met ongewijzigde wild typesequentiespecificiteit. Aan de andere kant, omdat het veranderen van REase specificiteit is uiterst moeilijk, het vinden van zelfs een dergelijke variant het produceren van een splitsing patroon dat verschilt van de wilde type enzym in een enkele screening van 24 klonen moet worden beschouwd als een succes. In onze handen konden de beste schermen tot 20% van de veelbelovende varianten identificeren (figuur 8A).
Het positieve resultaat hangt sterk af van de kwaliteit van de bibliotheek (d.w.z. een beperkte frequentie van vervangingen en de willekeurige verdeling ervan) en een efficiënte vangst van de bioateuze populatie bibliotheekleden (stappen 3.6–3.7). Beide problemen kunnen worden gedetecteerd. De kwaliteit van de bibliotheek moet voorafgaand aan de selectie worden gecontroleerd door zoveel mogelijk klonen te rangschikken (>15) of door de bibliotheek rechtstreeks te rangschikken door hoge doorvoervolgorde (stap 3.10, tabel 3). Als een meerderheid van de geselecteerde klonen niet actief zijn, is dit een duidelijke indicatie van het falen van de streptavidin-selectie. Een soortgelijk effect wordt waargenomen in het geval van bibliotheken die veel selectiecycli ondergaan, omdat dergelijke bibliotheken waarschijnlijk worden gedomineerd door inactieve varianten die aan de streptavidin-selectiestap(figuur 8B)zijn ontsnapt. Daarom is het raadzaam om screening na elke selectiecyclus uit te voeren en handmatig geselecteerde veelbelovende varianten verder te ontwikkelen in plaats van afhankelijk te zijn van selectieiteratie.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig1.jpg"> Figuur 1: In vitro selectie van een nieuwe sequentiespecificiteit op basis van NlaIV engineering. (A) De organisatie van de expressie / selectie cassette (ESC) omvat twee erkenning sites voor REase, 1) de geselecteerde volgorde (GGATCC) dicht bij het juiste uiteinde en 2) de teller geselecteerde sequentie (GGSSCC) dicht bij het linkereinde, evenals de T7p en T7t-T7 promotor en T7 terminator. De primer binding sites zijn hieronder weergegeven. Decolleté door wild type en geselecteerde NlaIV varianten worden weergegeven als rode en groene driehoeken respectievelijk. bB) Selectiecyclusstappen: I) Emulsificatie van transcriptie-vertaling-decolletéreactie mixen met de ESC-bibliotheek; II) Alle biotinylated DNA wordt gevangen op magnetische deeltjes bedekt met streptavidine en verwijderd, waardoor codering inactieve varianten; III) EsC's die REases coderen met wilde typeactiviteit (d.w.z. die in staat zijn de GGSSCC-sequentie te splijten) worden geëlimineerd omdat decolleté van de sequentie de bindingsplaatsen voor de voorwaartse en omgekeerde primers scheidt. Daarom vindt er geen versterking van deze SER's plaats; IV) Input voor de volgende selectieronde wordt gecreëerd door toevoeging van biotine aan de rechterkant en herinvoering van variatie van de teller geselecteerde sequenties aan de linkerkant. Herdrukt van Czapinska et al.8 met toestemming van Elsevier. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig2.jpg"> Figuur 2: Voorbereiding van het ESC. Fragment afgeleid van de oorspronkelijke constructie in een expressievector die NlaIV ORF onder controle van de T7 promotor bevat, werd gewijzigd om geschikt te zijn voor expressie/selectie. De NlaIV site stroomafwaarts van de NlaIV ORF werd verwijderd en unieke sites (SalI, EcoRI en Eco52I) die werden gebruikt om geselecteerde posities mutagenize werden geïntroduceerd in de NlaIV ORF als stille mutaties. De uiteindelijke constructie werd versterkt met flankerende primers die twee flankerende NlaIV-sites introduceerden: De tellergeselecteerde sequentie (GGSSCC) aan de linkerkant en geselecteerde reeks (GGATCC) aan de rechterkant. De omgekeerde primer introduceerde ook biotine. Primers die worden gebruikt bij het maken van gemuteerde ECS worden weergegeven als blauwe pijlen en hieronder gelabeld (zie tabel 1B,C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig3.jpg"> Figuur 3: Regeling van split- en mixsynthese. Het voorbeeld verwijst naar MutB primer synthese waar een NNS sequentie werd geïntroduceerd op 0,8 frequentie op vier posities (zie ook tabel 3). Merk op dat chemische synthese wordt uitgevoerd van 3 ' tot 5 ', maar alle sequenties worden weergegeven in canonieke 5 '-3' oriëntatie (dat wil zeggen, het gaat van rechts naar links in dit schema). Wilde typesequenties op mutagene posities worden in het groen weergegeven, terwijl NNS mutagene sequenties in het rood zijn. De SalI-herkenningssite die later wordt gebruikt om mutaties in SER's te introduceren, wordt onderstreept. Punten van mengen en splitsen stappen (2 en 4) zijn aangegeven. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig4.jpg"> Figuur 4: Gebruik van unieke beperking enzym sites in oligonucleotide gerichte mutagenese. De strategie voor mutatieintroductie wordt getoond op een voorbeeld van de bouw van bibliotheken A-C (zie stappen 3.1–3.7). Herdrukt van Czapinska et al.8 met toestemming van Elsevier. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig5.jpg"> Figuur 5: Endonucleolytisch decolleté in in vitro transcriptie-vertaling. (A) Splitsing van een testsubstraat in optimale REase buffer: 1) Substraat, 612 bp PCR product met één NlaIV herkenningsplaats; 2) Decolletéproducten, 355 bp en 257 bp.B) Decolleté in een in vitro transcriptie-vertalingreactie (met 0,5 μg ESC): 1–2) 15 μL aliquots van in vitro transcriptievertaling zonder substraat (regel 2: reactie aangevuld met 1,5 mM MgCl2); 3–4) 15 μL aliquots van in vitro transcriptie-vertaling met 1 μg testsubstraat; (regel 4: reactie aangevuld met 1,5 mM MgCl2). S-DNA grootte marker (pBR322 verteerd met MspI). Monsters werden opgelost in 6% native PAGE. DNA was bevlekt met ethidium bromide. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig6.jpg"> Figuur 6: Producten van de eerste PCR in de selectiecyclus. Zie figuur 1B, stap III; protocolstap 5.10. Kolomsets 1 en 2 zijn aliquots van twee verschillende bibliotheken geladen in drievoud. S-DNA formaat standaard (lambda DNA verteerd met HindIII en EcoRI). Pijl geeft de positie van de volledige esc (1.050 bp) aan. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig7.jpg"> Figuur 7: NlaIV-varianten gezuiverd voor verdere screening in minischaal. Zie stap 6.3.11. Elke lijn bevat een 10 μL aliquot van een andere variant. S-eiwit moleculairgewicht standaard. Moleculaire massa van NaIV REase subunit is 29,9 kDa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig7large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig8.jpg"> Figuur 8: Voorbeelden van screening van NlaIV-varianten voor sequentiespecificiteitswijziging. Zie stap 6.4.2. (A) Succesvolle screening met een hoge frequentie van veelbelovende varianten. S = DNA-maatmarker, lambda-DNA met HindIII en EcoRI; wild type (wt) = lambda DNA gespleten met wild type NlaIV; λ = lambda DNA substraat, niet gespleten; andere kolommen=varianten met een zeer lage activiteit. Varianten zijn gelabeld ! = veelbelovende varianten die een decolletépatroon produceren dat verschilt van het wilde type enzym; ? = varianten die ook de voorkeur voor de volgorde hebben gewijzigd. (B) Mislukte screening, met een meerderheid van de varianten inactief en een variant met blijkbaar ongewijzigd decolleté patroon. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig8large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig9.jpg"> Figuur 9: Alternatieve selectie door ligatie. Dit alternatief kan worden gebruikt voor alle REases genereren kleverige uiteinden. Hier presenteren we een voorbeeldprotocol voor een selectieschema voor MwoI-enzym (niet gepubliceerd). I) Geselecteerde volgorde (gelegen aan de rechterkant van de ESC) met gedefinieerde residuen in rood en geselecteerde variatie van de cognate sequentie weergegeven in het blauw. Tussen haakjes wordt onder de geselecteerde volgorde aan de linkerkant van het ESC afgebeeld; II) Product van MwoI-decolleté; III) Na beëindiging van in vitro transcriptie/ vertaling worden producten gezuiverd en wordt ligatie uitgevoerd met overtollige adapter. Alleen de decolletéproducten die in de geselecteerde volgorde zijn gespleten, kunnen deelnemen aan ligatie. Daarom worden inactieve varianten geëlimineerd en is de pulldown-stap niet nodig. Het decolletéproduct in de geselecteerde volgorde van de toonbank (aan de linkerkant van het ESC, niet weergegeven) kan niet aan deze ligatie deelnemen omdat het uitstekende uiteinde van de adapter niet complementair is aan de geselecteerde volgorde van de teller; IV) Selectieve PCR maakt gebruik van dezelfde strategie als in het hoofdprotocol om varianten te elimineren met de wilde type gedegenereerde sequentie specificiteit (F1 primer binding distaal aan de teller geselecteerde site), terwijl inactieve varianten worden geëlimineerd door de selectieve omgekeerde primer die niet kan binden aan de onbladde (en dus niet gewijzigd door adapter ligatie) rechterkant. In de volgende cyclus kan het proces worden herhaald met behulp van een adapter die identiek is aan het decolletéproduct van de voorgaande stap (d.w.z. de "klovencassette" in paneel III) en een geschikte selectieve omgekeerde inleiding. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig9large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
Tabel 1: Primers gebruikt in NlaIV engineering. De volgorde van de beperkingssites die in de opmerkingen worden genoemd, wordt onderstreept. Kleine letters geven sequenties aan die geen aanvullingen hebben in de DNA-sjablonen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/table1.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).</a>
Tabel 2: Voorwaarden voor PCR-reacties die in het protocol moeten worden gebruikt. Tm = primer smelttemperatuur (als Tm is verschillend voor de primers, de lagere Tm moet worden gebruikt). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/table2.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).</a>
Tabel 3: Resultaten van kwaliteitscontrole van twee mutagene primers gesynthetiseerd met split-and-mix strategie. Mutagenized codons worden aangegeven met [XXX]. Een lager indexnummer geeft de positie van een gecodeerd aminozuur aan. Aangepast van Czapinska et al.8 met toestemming van Elsevier. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/table3.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).</a>
Tabel 4: Resultaten van EP-PCR. Belangrijkste parameters afgeleid van sequentieanalyse van 22 klonen van ECS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/table4.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Directed Evolution of a Restriction Endonuclease with More Stringent Specificity at JoVE.com

In Vitro Directed Evolution of a Restriction Endonuclease with More Stringent Specificity

De endonucleases van de beperking met nieuwe opeenvolgingsspecificiteit kunnen van enzymen worden ontwikkeld die een gedeeltelijk gedegenereerde opeenvolging erkennen. Hier bieden we een gedetailleerd protocol dat we met succes gebruikt om de volgorde specificiteit van NlaIV enzym te veranderen. De belangrijkste ingrediënten van het protocol zijn de in vitro compartimentering van de transcriptie/vertaalreactie en selectie van varianten met nieuwe sequentiespecifiekekenmerken.

In Vitro Gerichte Evolutie van een beperking Endonuclease met strengere specificiteit

Restriction endonuclease (REase) specificity engineering is extremely difficult. Here we describe a multistep protocol that helps to produce REase ...

Ons protocol maakt het mogelijk om restrictieenzymen te maken met gewijzigde, strengere sequentiespecificiteiten met behulp van in vitro compartimentering en een unieke selectiestrategie in gerichte evolutie. Potentieel is het vrij universeel, aangezien het op om het even welke beperking van toepassing zou moeten zijn endonuclease en de selectie naar om het even welke striktere versie van een originele cognateopeenvolging kan worden geleid. Als nieuw gecreëerde varianten worden uitgedrukt door in vitro transcriptie-vertaling, is het protocol niet alleen geschikt voor het beperken van specificiteit, maar ook voor het wijzigen van specificiteit.Om sites voor subsaturatie mutagenesis te beslissen, kies mutagenesis frequenties op basis van het hypothetische belang van de sites, waarbij grenzen aan de algehele complexiteit van de bibliotheek in het achterhoofd. Om de synthese te beginnen, voeg kolommen die zijn verpakt met nieuwe hars in de synthesizer. Synthetiseer oligonucleotiden in alle kolommen tot aan de triplet, onmiddellijk voorafgaand aan de tweede subsaturatie mutagenesis site tellen van de drie-prime einde.Synthetiseren, het verlaten van een vijf-prime trityl groep aan het eind. De beschermende groep wordt verwijderd aan het begin van de volgende synthesecyclus. Open de synthesekolommen en vercentrifugeer kort in droge 1,5 milliliter buizen om de hars te verzamelen.Trek de CPG synthese ondersteuning en meng door vortexing. Herscheiden van de gemengde CPG hars in nieuwe synthese kolommen. Vermijd de invoering van vochtigheid, omdat het de totale opbrengst zal verminderen.Zet de synthese voort, vanaf de subsaturatie mutagenesis site triplet. Wijs kolommen toe aan gerandomiseerde NNS-drieling of wild-type drieling volgens de gewenste mutagenesisfrequentie. Als er extra subsaturatielocaties aanwezig zijn, gaat u alleen verder met de triplet die voorafgaat aan de volgende subsaturatiemutagenesissite.Als er niet meer subsaturatie sites zijn stroomafwaarts aanwezig, vul de synthese, waardoor een vijf-prime trityl groep aan het einde. Gebruik brede boring pipet tips om een olie oppervlakteactieve mengsel te bereiden door het toevoegen van 225 microliter van Span 80 en 25 microliter van Tween 80 tot vijf milliliter minerale olie in een 15 milliliter conische buis. Meng grondig door zachte inversie 15 keer.Het mengsel bij deze stap moet doorschijnend zijn. Breng voor elke bibliotheek 950 microliter van het olie-oppervlakteactieve mengsel over op een cryogene flacon met twee milliliter ronde bodem. Label met een bibliotheeknaam en overdracht naar ijs.Doe een kleine cilindrische roerbar in elke flacon. Bereid een in vitro transcriptie-vertaling reactie mengsel volgens de suggesties van de fabrikant. Vul het mengsel aan met magnesiumchloride tot een uiteindelijke concentratie van 1,5 millimolar.Doe 50 microliter aliquots van het reactiemengsel in 1,5 milliliter buizen op ijs. Voeg 1,7 femtomoles van de bibliotheek toe aan het reactiemengsel op ijs. Bereid water-in-olie emulsie achtereenvolgens voor elke bibliotheek door eerst het plaatsen van een klein bekerglas gevuld met ijs op een magnetische roerder met de roersnelheid ingesteld op 1150 RPM.Breng vervolgens een cryogene flacon met 950 microliter olieafdrijvingsmengsel en een kleine roerstaaf over naar een ijskoud bekerglas op de magneetroerder. Controleer of de roerbar draait. Voeg vijf 10-microliter aliquots van de in vitro bibliotheek transcriptie-vertaling mengsel over een periode van twee minuten in 30 seconden intervallen en blijven roeren voor een extra minuut.Breng de flacon met de emulsie over naar een ijscontainer. Op dit punt moet de vloeistof ondoorzichtig zijn, niet doorschijnend. Ga dan verder met de volgende bibliotheek.Nadat alle bibliotheken zijn verwerkt, start de incubatie van alle bibliotheken volgens de aanbevelingen van de kitfabrikant. Breng de flesjes op de temperatuur optimaal voor de ontworpen endonuclease voor een extra twee uur voordat ze op ijs voor ten minste 10 minuten. Breng de emulsies van de cryogene flesjes over in buizen van 1,5 milliliter.Voeg een microliter van 5 molaire EDTA toe. En centrifugeren ze op 13.000 keer g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Als u na het centrifugeren de waterolie-interface niet duidelijk zien, bevriest u het mengsel voor de aspiratie van de bovenste oliefase.Verplaats de bovenste oliefase met een pipet en gooi het weg. Voer onmiddellijk extractie uit door 150 microliter fenolchloroform en 100 microliter van 10 millimolar Tris-HCl toe te voegen aan de waterige fase. Vortex en voer dan fasescheiding uit via 30-seconden centrifugatie op 13.000 keer g.Verzamel de bovenste waterige fase. Precipitate het DNA door toevoeging van 15 microliters van drie-molaire natriumacetaat, 2,5 tot vijf microgram glycogeen, en 375 microliter ethanol. Na het uitbroeden van de monsters bij min-20 graden Celsius gedurende een uur, centrifuge gedurende 15 minuten op 13.000 keer g, vier graden Celsius.Gooi de supernatant weg en was de pellet kort met een milliliter koude 70%-ethanol. Droog de DNA glycogeen pellet in een snelheid vac of luchtdroger voor langer dan vijf minuten. Los vervolgens de pellet op in 50 microliter van 10 millimolar Tris-HCl.Voeg vervolgens vijf microliters van streptavidin magnetische kralen, bereid volgens de instructies van de fabrikant. Meng gedurende een uur bij kamertemperatuur, bij voorkeur in een carrouselmixer of door zachte vortexing. Breng de buizen naar een magnetische standaard om de kralen te scheiden.Verzamel vervolgens de vloeistof verrijkt in DNA zonder biotine. Dit protocol is een hulpmiddel om de frequentie van de gewenste varianten van engineered restriction endonucleases te verhogen door inactieve enzymen en endonucleases uit te putten met ongewijzigde wild-type sequentiespecificiteit. Succesvolle screening kan tot 20% van de veelbelovende varianten identificeren.Varianten worden aangeduid als veelbelovende varianten als ze produceren een decolleté patroon onderscheiden van de wilde-type enzym. Varianten die mogelijk de voorkeur voor volgorde hebben gewijzigd, worden ook gelabeld. Hier getoond is een mislukte screening met de meerderheid van variantie inactief en een variant met schijnbaar ongewijzigd decolleté patroon.In dit geval worden de bibliotheken waarschijnlijk gedomineerd door inactieve varianten die ontsnapten aan de streptavidin-selectiestap. Het is van cruciaal belang om de geselecteerde en tegengekozen sequenties zorgvuldig te ontwerpen en de diversiteit van de bibliotheek te beperken door mutagenesis-strategie die vervangingen genereert in slechts een paar geselecteerde posities. De beste geselecteerde varianten moeten grondig worden gekarakteriseerd voor binding en decolleté kinetiek op voorkeur en niet splijtde sequenties op basis van de resultaten van de eerste screening.In onze testcase werden mutagenesissites geselecteerd op basis van een homologiemodel. Verrassend, een kristalstructuur later bleek dat sommige veranderde residuen zijn waarschijnlijk niet in direct contact met DNA.

Research

JoVE Journal

Genetics

Design and Use of a Low Cost, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution of Bacteria Under Antibiotic Drug Selection

Ontwerp en gebruik van een Low Cost, Automatiseren Morbidostat voor Adaptive evolutie van bacteriën onder antibioticum selectie

We describe a low cost, configurable morbidostat for characterizing the evolutionary pathway of antibiotic resistance. The morbidostat is a bacterial ...

Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat

Procedure voor Adaptive Laboratorium Evolutie van micro-organismen met behulp van een Chemostat

Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) ...

Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development

Genoom bewerken en Directed Differentiatie van hPSCs voor ondervragen Lineage Determinanten in Human eilandjes Development

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding ...

Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans

Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans

Kwantificering van informatie gecodeerd door Gene Expression niveaus tijdens levensduur modulatie onder breed-scala dieet beperking in C. elegans

Sensory systems allow animals to detect, process, and respond to their environment. Food abundance is an environmental cue that has profound effects on ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generatie van een gen-verstoord Streptococcus mutans stam zonder Gene klonen

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Testing the Role of Multicopy Plasmids in the Evolution of Antibiotic Resistance

De rol van zelfkopiërende plasmiden testen in de ontwikkeling van resistentie tegen antibiotica

Multicopy plasmids are extremely abundant in prokaryotes but their role in bacterial evolution remains poorly understood. We recently showed that the ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Genoom-brede Surveillance van transcriptie fouten in eukaryote organismen

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

Productie van Gene verwijderingen in Escherichia coli door P1 transductie met accijnsplichtige antibioticaresistentie Cassettes

A first approach to study the function of an unknown gene in bacteria is to create a knock-out of this gene. Here, we describe a robust and fast protocol ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

Met behulp van In Vitro en In cel vorm te onderzoeken klein molecuul veroorzaakte structurele veranderingen van de Pre-mRNA

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Using Sniper-Cas9 to Minimize Off-target Effects of CRISPR-Cas9 Without the Loss of On-target Activity Via Directed Evolution

Met behulp van Sniper-Cas9 te minimaliseren Off-target effecten van CRISPR-Cas9 zonder verlies van On-target activiteit Via gerichte evolutie

The development of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated protein 9 (Cas9) into therapeutic modalities requires the ...