Name: in vitro directed evolution of a restriction endonuclease with more stringent specificity
Uploaded: 2020-03-25T15:00:00
Duration: 9 min 16 s
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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des Ministeriums für Wissenschaft und Hochschulbildung (0295/B/PO1/2008/34 bis MB und N301 100 31/3043 an KS), des Polnischen Nationalen Wissenschaftszentrums (NCN) (UMO-2011/02/A/NZ1/00052) unterstützt. UMO-2014/13/B/NZ1/03991 und UMO-2014/14/M/NZ5/00558 bis MB) und durch kurzfristigeem EMBO-Stipendium an KS (ATSF 277.00-05).

<ol>
	<li>Sch&#246;ttler, S., Wenz, C., Lanio, T., Jeltsch, A., Pingoud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+engineering+of+the+restriction+endonuclease+EcoRV--structure-guided+design+of+enzyme+variants+that+recognize+the+base+pairs+flanking+the+recognition+site.">Protein engineering of the restriction endonuclease EcoRV--structure-guided design of enzyme variants that recognize the base pairs flanking the recognition site.</a> European Journal of Biochemistry. 258 (1), 184-191 (1998).</li><li>Wenz, C., Hahn, M., Pingoud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+variants+of+the+restriction+endonuclease+EcoRV+that+depend+in+their+cleavage+activity+on+the+flexibility+of+sequences+flanking+the+recognition+site.">Engineering of variants of the restriction endonuclease EcoRV that depend in their cleavage activity on the flexibility of sequences flanking the recognition site.</a> Biochemistry. 37 (8), 2234-2242 (1998).</li><li>Samuelson, J. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+a+rare-cutting+restriction+enzyme:+genetic+screening+and+selection+of+NotI+variants.">Engineering a rare-cutting restriction enzyme: genetic screening and selection of NotI variants.</a> Nucleic Acids Research. 34 (3), 796-805 (2006).</li><li>Rimseliene, R., Maneliene, Z., Lubys, A., Janulaitis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+restriction+endonucleases:+using+methylation+activity+of+the+bifunctional+endonuclease+Eco57I+to+select+the+mutant+with+a+novel+sequence+specificity.">Engineering of restriction endonucleases: using methylation activity of the bifunctional endonuclease Eco57I to select the mutant with a novel sequence specificity.</a> Journal of Molecular Biology. 327 (2), 383-391 (2003).</li><li>Morgan, R. D., Luyten, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+engineering+of+type+II+restriction+endonuclease+DNA+binding+and+cleavage+specificity.">Rational engineering of type II restriction endonuclease DNA binding and cleavage specificity.</a> Nucleic Acids Research. 37 (15), 5222-5233 (2009).</li><li>Skowronek, K., Boniecki, M. J., Kluge, B., Bujnicki, J. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+by+in+vitro+compartmentalization.">Directed evolution by in vitro compartmentalization.</a> Nature Methods. 3 (7), 561-570 (2006).</li><li>Zheng, Y., Roberts, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+restriction+endonucleases+using+artificial+cells.">Selection of restriction endonucleases using artificial cells.</a> Nucleic Acids Research. 35 (11), e83 (2007).</li><li>Takeuchi, R., Choi, M., Stoddard, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redesign+of+extensive+protein-DNA+interfaces+of+meganucleases+using+iterative+cycles+of+in+vitro+compartmentalization.">Redesign of extensive protein-DNA interfaces of meganucleases using iterative cycles of in vitro compartmentalization.</a> Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 111 (11), 4061-4066 (2014).</li><li>Howland, J. L., Ausubel, F., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Short Protocols in Molecular Biology. , (1995).</li><li>Wilson, D. S., Keefe, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+8+Unit+8.3:+Random+mutagenesis+by+PCR.">Chapter 8 Unit 8.3: Random mutagenesis by PCR.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (2001).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Das hier beschriebene Auswahlprotokoll wurde für NlaIV8getestet, eine dimerische PD-(D/E)XK-Falzerkennungssequenz, die eine palindromische Zielstelle mit zentralen NN-Basen erkennt und einen stumpfen Endschnitt zwischen den NN-Basen katalysiert. NlaIV wurde gepflückt, weil die Spaltung zwischen den NN-Basen darauf hindeutet, dass diese Basen in der Nähe des Proteins im Komplex liegen. Prinzipiell könnte das Protokoll für jede sequenzspezifische Restriktionsendonuklease, monomeric oder dimeric, jeder Falzgruppe verwendet werden, wodurch Doppelstrangbrüche von jedem Staffelr katalysiert werden, unabhängig davon, ob katalytische und spezifizistische Domänen übereinstimmen (wie im NlaIV-Beispiel) oder getrennt sind (z. B. FokI). Darüber hinaus ist das Protokoll im Prinzip nicht nur für die Erzeugung neuer, engerer Enzymspezifität nützlich, sondern könnte auch verwendet werden, um Staraktivitäten zu eliminieren oder High-Fidelity-Endonukleasen zu erstellen. All dies wurde jedoch noch nicht getestet. Insbesondere kann die gezielte Eliminierung der Sternaktivität kompliziert sein, da dieselben Aminosäurerückstände an der Bindung an die gewünschten und unerwünschten Basen beteiligt sein könnten. Die in diesem Protokoll beschriebenen In-vitro-Schritte beschränken sich nicht auf die Auswahl eingeengter Spezifitäten, sondern könnten auch zur Auswahl anders veränderter Spezifitäten verwendet werden. Allerdings gibt es dann ein Problem mit variantenenden Endonukleasen: Wenn das Spektrum der Substrate neue Ziele enthält, die nicht durch die elterliche Endonuklease gespaltet werden, gibt es im Allgemeinen keine gute Möglichkeit, Zellen vor den schädlichen Auswirkungen dieser Aktivität zu schützen. Im Gegensatz dazu sind die Ziele, wenn die Endonuklease-Spezifität nur eingeengt wird, eine Teilmenge der Wildtyp-Ziele, und daher sollte die bereits verfügbare Cognate-Methyltransferase vollständig schützend sein.
Unser Protokoll unterscheidet sich in mehrfacher Hinsicht von vielen gerichteten Evolutionsprotokollen. Offene Leserahmenvielfalt wird einmal zu Beginn des Experiments generiert, nicht in jeder Iteration. Darüber hinaus wird es durch Split-and-Mix-Synthese und nicht durch EP-PCR erstellt. Für NNS-Substitutionen von Codons, wie sie in dieser Arbeit verwendet werden, gibt es (4 x 4 x 2)6 x 1,07 x 109 Kombinationen für sechs Positionen. Daher ist jede variante im Durchschnitt einmal in 1,7 Fmoles des ESC vorhanden. Diese Kapazität kann auf sieben Positionen erhöht werden, indem eine Synthese mit einer Mischung aus 20 Tridemoactid-Vorläufern verwendet wird, die von Glen Research angeboten wird, oder durch Verringerung der Mutationshäufigkeit in weniger vielversprechenden Positionen mit Split-and-Mix-Oligonukleotid-Synthese. Wenn möglich, wird empfohlen, das Ausmaß der Variation auf sechs Positionen zu begrenzen. Offensichtlich erfordert eine solche Mutagenese-Targeting einige bereits vorhandene Kenntnisse über zumindest die Regionen der REase, die an der Substratbindung beteiligt sind. Das Split-and-Mix-Protokoll zur Erzeugung von Diversität hat gegenüber EP-PCR deutliche Vorteile. Mit EP-PCR erhielten wir unveränderte Varianten und Sequenzen mit acht Substitutionen für NlaIV-ESCs in derselben EP-PCR (Tabelle 4). Die Bibliothek von EP-PCR enthält einen wesentlichen Bruchteil von Klonen, die vermieden werden sollten (wilde Typsequenzen, Mehrfachersetzungen, Frameshift- und Nonsense-Mutationen und Mutationen an Orten, an denen die Sequenzspezifität wahrscheinlich nicht beeinflusst wird).
Unser Protokoll unterscheidet sich auch von vielen anderen gerichteten Evolutionsprotokollen durch zwei sequenzielle Auswahlschritte. Eine positive Auswahl stellt sicher, dass die gewünschte Aktivität beibehalten wird, da sonst das Biotin-Tag nicht entfernt wird und die Codierungssequenz durch Pull-down entfernt werden kann. Es ist technisch möglich, dass die zufällige Entstehung einer neuartigen, nicht überlappenden Spezifität (z.B. GCATGC) auch zur Abtrennung des Biotin-Tags führen könnte, wenn eine geeignete Spaltungsstelle in der Nähe der gewünschten Spaltung vorhanden ist, aber nicht anderswo. Dies dürfte jedoch höchst unwahrscheinlich sein. Negative Auswahl entfernt offene Leserahmen, die für Enzyme kodieren, die noch die unerwünschte Aktivität haben. Dieser Schritt ist nicht zwingend vorgeschrieben, da das Protokoll die Ausgabebibliothek immer noch mit Varianten anreichert, die in der Lage sind, die Auswahlsequenz zu spalten, aber nicht an anderer Stelle im ESC spalten können, wodurch sie für die PCR-Verstärkung ungeeignet ist. Es wird jedoch erwartet, dass die Auswahlwirksamkeit geringer ist, da Enzyme mit der ursprünglichen Sequenzspezifität nicht aus dem Output entfernt werden und vielversprechende Varianten mit veränderter Spezifität, aber auch verminderter enzymatischer Aktivität übertreffen. Beachten Sie, dass auf der Bevölkerungsebene sowohl gewünschte als auch unerwünschte Zielsequenzen degenerieren können, aber nicht sein müssen. Im NlaIV-Beispiel wurde das Antiziel degeneriert und das Ziel nicht degeneriert. Selbst wenn es Eine Degenerierung auf Bevölkerungsebene gibt, ist in einem einzigen Tröpfchen nur ein (nicht degeneriertes) Ziel oder Antiziel vorhanden. In unserem Protokoll werden Ziel- und Antizielsequenzen bei jeder Wiederholung der Selektionsschritte wieder eingeführt. Daher muss ein offener Leserahmen ein Enzym kodieren, das in der Lage ist, alle möglichen Ziele zu spalten, und nicht in der Lage ist, eines der Anti-Ziele zu spalten, um mehrere Auswahlrunden zu überleben. Beachten Sie, dass die Notwendigkeit, das Antiauswahlziel bei jeder Iteration des Protokolls erneut einzuführen, zwei sequenzielle PCRs erzwingt. Die erste PCR verwendet eine Grundierung, die außerhalb des Anti-Ziels anneals, so dass Spaltung des Anti-Ziel verhindert die PCR-Reaktion. Die zweite PCR erfordert eine Grundierung, die über das Anti-Ziel hinausreicht, und führt das Anti-Ziel wieder ein, um sicherzustellen, dass während mehrerer Auswahlrunden jeder offene Leserahmen mit allen Varianten des Anti-Ziels getestet wird.
Für Enzyme, die klebrige Enden erzeugen, kann ein verwandtes Alternativprotokoll verwendet werden, das auf einer zuvor beschriebenen Methode zur Isolierung von REase ORF10 basiert. Die Erschöpfung inaktiver Varianten durch Biotinerfassung, die in unseren Experimenten verwendet wird, wird im Alternativprotokoll durch Ligation des kompatiblen Adapters durch eine Sequenz ersetzt, die als Primerbindungsstelle in einer selektiven PCR verwendet wird (Abbildung 9). Nur ESCs, die Enzyme mit der ausgewählten Spezifität produzieren, erzeugen ligationsfähige Enden und werden daher ausgewählt. Die Reihenfolge des klebrigen Endes der ausgewählten Zählersequenz muss so gestaltet sein, dass sie nicht an der Ligation mit Adaptern teilnehmen kann. Die Iteration des Auswahlprozesses kann leicht erreicht werden, indem zwischen zwei verschiedenen Adaptern und damit zwei verschiedenen Reverse primern in selektiver PCR gewechselt wird.
Auch mit neuen Protokollen ist die Aufgabe, neue Besonderheiten in vitro zu erarbeiten, immer noch eine große Herausforderung. Bei typischen Typ-II-REases hängen Sequenzspezifität und endonukleolytische Aktivität von denselben Proteinregionen ab. Es ist daher schwierig, das eine zu ändern, ohne das andere zu beeinträchtigen. Der Erfolg wird durch eine Strategie wahrscheinlicher, die den Fußabdruck des Enzyms berücksichtigt, die Symmetrie von Protein-DNA-Wechselwirkungen respektiert und auf bereits bestehenden enzymatischen Präferenzen aufbaut, die im Voraus in biochemischen Experimenten bestimmt werden sollten, wie dies für das NlaIV-Beispiel8geschehen ist.

Sequenzspezifitäts-Engineering ist für REases der Klasse II eine große Herausforderung. In dieser Klasse von Endonukleasen sind Sequenzerkennung und Katalyse eng miteinander verflochten, höchstwahrscheinlich als evolutionärer Schutz gegen die Schaffung einer Endonuklease von breiterer Spezifität als ihre cognate Methyltransferase, die die Wirts-DNA schädigen würde. Die gezielte Evolution neuer Spezifitäten in Zellen wird durch die Notwendigkeit, die Wirts-DNA vor der neu entwickelten Endonuklease-Aktivität zu schützen, noch komplizierter. Daher gibt es nur wenige erfolgreiche Versuche von REase Engineering berichtet und alle von ihnen nutzen die einzigartigen Eigenschaften eines bestimmten Enzyms1,2,3,4,5,6,7.
Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für Spezifitäts-Engineering zur Verfügung, das verwendet werden kann, um Endonuklease-Varianten zu generieren, die eine engere Spezifität haben als ein Elternenzym, das auf unserer erfolgreichen Konstruktion einer NlaIV Endonuklease8basiert. Für jedes solche Enzym mit einer beliebigen Erkennungssequenz kann eine zusätzliche Spezifität für Basen in den Flanken eingeführt werden. Bei Elternenzymen, die teilweise degenerierte Sequenzen erkennen (wie NlaIV mit ihrem GGNNCC-Ziel), kann auch eine zusätzliche Spezifität innerhalb der Erkennungssequenz eingeführt werden. Da zusätzliche Spezifität wahrscheinlich Protein-DNA-Kontakte erfordern, sollten die neu erkannten Basen innerhalb des Fußabdrucks der elterlichen Endonuklease auf DNA liegen. Grundsätzlich können Für jede gewünschte Spezialisierung der Erkennungssequenz Auswahlschemata eingerichtet werden. Die meisten REases, die palindromische und fast palindromische Zielsequenzen erkennen, sind jedoch funktionelle Dimere, die nur eine halbe Stelle des Palindroms erkennen. Daher ist es unwahrscheinlich, dass die Auswahl neuer Spezifitäten, die die Symmetrie von Protein-Nukleinwechselwirkungen verletzen, funktioniert. Für die dimerische NlaIV beispielsweise kann die GGNNCC-Sequenz theoretisch auf GGATCC eingegrenzt werden, aber die Verengung der Spezifität auf GGAACC dürfte schwieriger sein. Unser Schema beinhaltet sowohl eine positive als auch eine negative Auswahl.
Das Verfahren ist effizienter, wenn die negative Auswahl auch verwendet wird, um die Spezifitäten zu entfernen, die alle Sequenzen außer der bevorzugten engeren Spezifität spalten können. Beispielsweise könnte die Auswahl für GGATCC mit einer Antiauswahl gegen GGBVCC kombiniert werden (wobei B eine andere Basis als A und V eine andere Basis als T ist). Wenn einige der möglichen Zielsequenzen nicht abgedeckt sind, hängt das Ergebnis des Auswahlexperiments von der Wirksamkeit der positiven und negativen Selektion ab. In unserer NlaIV-Arbeit haben wir uns für GGATCC und gegen GGSSCC (wobei S G oder C) entschieden hat, und eine Spezifität erhalten, die unter Ignorieren von Symmetriebruchzielen als GGWWCC (wobei W A oder T ist) beschrieben werden könnte, was darauf hindeutet, dass in diesem speziellen Fall die negative Selektion als positive Auswahl.
Unser Ansatz beginnt mit der Erstellung einer Ausdrucksauswahlkassette (ESC). Der ESC ist in Abschnitte gegliedert. Im Innenkernbereich gibt es Varianten des offenen Leserahmens (ORF) der REase unter T7-Promoter-Steuerung. Dieser Kernabschnitt des ESC kann keinen Cognate-Standort für die entwickelte REase enthalten. Der Kern ist zwischen zwei Kognatenstellen für Wildtyp REase eingeklemmt: eine Spaltungsstelle für die unerwünschte Aktivität (in diesem Beispiel die zählergenaue Sequenz GGSSCC) und eine Spaltungsstelle für die gewünschte Aktivität (ausgewählte Sequenz, GGATCC im Beispiel). Der letzte Schritt der Vorbereitung des ESC in PCR fügt Biotin nahe an der gewünschten Aktivität am 5' Ende hinzu und erzeugt eine Vielzahl von gegeneinander ausgewählten Sequenzen (GGSSCC im Beispiel). Die Auswahlstrategie beruht auf der Verwendung sorgfältig ausgearbeiteter Primer im ESC-Reamplifikationsprotokoll nach einem In-vitro-Transkriptions-/Übersetzungs-/Auswahlprotokoll (Abbildung 1A). Die ESC-Bibliothek wird in einer in vitro unterteilten Transkriptionsübersetzung Wasser-in-Öl-Emulsion9,10,11ausgedrückt. Innerhalb jedes Tröpfchens wirkt sich die Spezifität des exprimierten Enzyms auf den Zustand des ESC aus (Abbildung 1B, Schritt I). Für die beschriebene Anordnung entfernt die gewünschte Spaltaktivität des übersetzten Proteins das Biotin-Tag der DNA, wirkt sich aber nicht auf das andere ESC-Ende mit der gegendien ausgewählten Sequenz aus. Wenn die Emulsion gebrochen ist, werden biotinylierte Fragmente durch Streptavidin-Affinitätspulldown entfernt, so dass nur Fragmente aus Tröpfchen mit der gewünschten Aktivität übrig bleiben(Abbildung 1B, Schritt II). In diesem Schritt werden inaktive REase-Varianten entfernt. Der überstande Teil des Pull-Down-Schritts wird dann durch PCR verstärkt. In den ersten PCR-Reaktionsprimern Werden F2 und R1 verwendet(Abbildung 1A,B, Schritt III). Primer F2 bindet an den ESC-Abschnitt zwischen der gegendien ausgewählten Sequenz und dem Molekülende. Daher werden ESCs, die Varianten exprimieren, die in der Lage sind, die gegensätzliche ausgewählte Sequenz zu trennen (und damit die Bindungsstellen für die Primer F2 und R1 in zwei verschiedene DNA-Moleküle zu trennen), nicht verstärkt und somit aus der Bibliothek entfernt. Der Primer R1 bindet zwischen dem ausgewählten Standort und dem Kern des ESC, so dass er nicht vom Spaltungsstatus des ausgewählten Standorts beeinflusst wird, und stellt die Spaltungsstelle für die gewünschte Aktivität (GGATCC) wieder her. Der Zyklus wird durch eine zweite PCR (mit primer F1 und R2) geschlossen, die Biotin am 5'-Ende in der Nähe des ausgewählten Standorts hinzufügt und die entworfene Variation an der gegenläufigen Stelle in der Nähe des entgegengesetzten Endes des ESC wiederherstellt(Abbildung 1B,Schritt IV). Die resultierende DNA-Mischung ist bereit für eine weitere Auswahlrunde.
Der Erfolg des Auswahlprotokolls hängt stark von der richtigen Wahl der neuen, strengeren Zielerkennungssequenz und von der sorgfältigen Gestaltung der Mutagenese-Strategie und ihrer effektiven Umsetzung ab. Da es viel einfacher ist, leichte bereits bestehende Präferenzen der REase zu verbessern, als sie zu überwinden, empfehlen wir, mit einer kinetischen Studie aller bereits bestehenden Präferenzen zu beginnen. Die Notwendigkeit einer sorgfältigen Mutagenese-Konstruktion ergibt sich aus der begrenzten Größe einer mutierten Bibliothek, die durch das vorgestellte Protokoll verarbeitet werden kann (109 Klone in einem einzigen Experiment). Somit können alle 20 möglichen Aminosäuresubstitutionen in wenigen Positionen effektiv getestet werden (siehe Diskussion). Eine zufällige Mutagenese, wie z. B. fehleranfällige PCR (EP-PCR), die als alternative Methode vorgestellt werden, wird zu einer tiefgreifenden Unterstichprobe der bestehenden Komplexität führen. Wenn Informationen über mögliche Aminosäurepositionen im Zusammenhang mit DNA-Kontakten (oder sogar in unmittelbarer Nähe zu den degenerierten Nukleotiden in einer Cognate-Sequenz) vorliegen, sollte dies sicherlich verwendet werden, um einige Aminosäuren für oligonukleotidgeführte Sättigungsmutagenese auszuwählen (Protokollschritte 1.6-3.10).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1000&#197; CPG Support (dA, dT, dC, dG)</td>
			<td>Biosset</td>
			<td>45-1000-050</td>
			<td>Other vendors can be used as well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ASM-800 DNA/RNA</td>
			<td>Biosset</td>
			<td>800-001-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJET Gel Extraction Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K0691</td>
			<td>Any other kit can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glen-Pak DNA purification cartridge</td>
			<td>Glen Research</td>
			<td>60-5200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIS-Select Nickel Affinity Gel</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET 28a vector</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any other vector with T7 promoter upstream of plycloning site can be used instead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td>Any other high fidelity and highly processive thermophilic polymearse can be used instead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porous steel foil</td>
			<td>Biosset</td>
			<td>40-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid Translation System 
			RTS 100, E.coli HY Kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3 186 148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction endonucleases</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Obviously other vendors, enzymes can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Magnetic Beads</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>S1420S</td>
			<td>Other vendors can be used as well. We have positively tested beds form Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthesis chemicals including phosphoramidities</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td></td>
			<td>Other vendors can be used as well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthesis columns (different sizes)</td>
			<td>Biosset</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EL0011</td>
			<td>Any other ligase can be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro directed evolution of a restriction endonuclease with more stringent specificity

Restriktionsendonuklease (REase) Spezifitätstechnik ist extrem schwierig. Hier beschreiben wir ein mehrstufiges Protokoll, das hilft, REase-Varianten zu produzieren, die eine strengere Spezifität als das elternde Enzym aufweisen. Das Protokoll erfordert die Erstellung einer Bibliothek von Expressionsauswahlkassetten (ESCs) für Varianten des REase, idealerweise mit Variabilität in Positionen, die die DNA-Bindung beeinflussen können. Der ESC wird auf der einen Seite durch eine Sequenz für die gewünschte Einschränkungs-Site-Aktivität und ein Biotin-Tag und auf der anderen Seite durch eine Restriktionsstelle für die unerwünschte Aktivität und eine Primer-Glühstelle flankiert. Die ESCs werden transkribiert und in eine Wasser-in-Öl-Emulsion übersetzt, unter Bedingungen, die das Vorhandensein von mehr als einem DNA-Molekül pro Tröpfchen unwahrscheinlich machen. Daher wird die DNA in jedem Kassettenmolekül nur der Aktivität des übersetzten, kodierten Enzyms unterworfen. REase-Varianten der gewünschten Spezifität entfernen das Biotin-Tag, aber nicht die Primer-Glühen-Site. Nach dem Bruch der Emulsion werden die DNA-Moleküle einem Biotin-Pulldown unterzogen, und nur die im Überstand bleiben erhalten. Dieser Schritt stellt sicher, dass nur ESCs für Varianten beibehalten werden, die nicht die gewünschte Aktivität verloren haben. Diese DNA-Moleküle werden dann einer ersten PCR-Reaktion unterzogen. Cleavage in der unerwünschten Sequenz schneidet die Primerbindungsstelle für einen der Primer ab. Daher verstärkt PCR nur ESCs aus Tröpfchen ohne die unerwünschte Aktivität. Anschließend wird eine zweite PCR-Reaktion durchgeführt, um die Restriktionsstelle für die gewünschte Spezifität und das Biotin-Tag wieder einzuführen, so dass der Selektionsschritt wiederholt werden kann. Ausgewählte offene Leserahmen können in Bakterienzellen überexprimiert werden, die auch die cognate Methyltransferase der elterlichen REase ausdrücken, da die neu entwickelte REase nur eine Teilmenge der Methyltransferase-Zielstellen anvisiert.

Dieses Protokoll ist nur ein Werkzeug, um die Häufigkeit der gewünschten Varianten eines konstruierten REase zu erhöhen, indem zwei unerwünschte Klassen erschöpft (aber nicht beseitigt) werden: inaktive Enzyme und Endonukleasen mit unveränderter Wildtypsequenzspezifität. Da es andererseits äußerst schwierig ist, die Spezifität von REase zu ändern, sollte es als Erfolg angesehen werden, selbst eine solche Variante zu finden, die ein Spaltmuster erzeugt, das sich vom Wildtyp-Enzym in einem einzigen Screening von 24 Klonen unterscheidet. In unseren Händen konnten die besten Bildschirme bis zu 20% der vielversprechenden Varianten identifizieren (Abbildung 8A).
Das positive Ergebnis hängt stark von einer Bibliotheksqualität (d. h. einer begrenzten Häufigkeit von Substitutionen und deren zufälliger Verteilung) und einer effizienten Erfassung der biotinylierten Population von Bibliotheksmitgliedern ab (Schritte 3.6–3.7). Beide Probleme können erkannt werden. Die Bibliotheksqualität sollte vor der Auswahl überprüft werden, indem so viele Klone wie möglich sequenziert werden (>15) oder durch direkte Sequenzierung der Bibliothek durch Hohe Durchsatzsequenzierung (Schritt 3.10, Tabelle 3). Wenn die Mehrheit der ausgewählten Klone nicht aktiv ist, ist dies ein klarer Hinweis auf einen Fehler der Streptavidin-Erfassungsauswahl. Ein ähnlicher Effekt wird bei Bibliotheken beobachtet, die viele Auswahlzyklen durchlaufen, da solche Bibliotheken höchstwahrscheinlich von inaktiven Varianten dominiert werden, die dem Auswahlschritt für streptavidin-Erfassungsschritte entkommen sind (Abbildung 8B). Daher ist es ratsam, das Screening nach jedem Auswahlzyklus durchzuführen und manuell ausgewählte vielversprechende Varianten weiterzuentwickeln, anstatt sich auf die Auswahliteration zu verlassen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig1.jpg"> Abbildung 1: In-vitro-Auswahl einer neuen Sequenzspezifität auf Der Grundlage des NlaIV-Engineerings. (A) Die Organisation der Ausdrucks-/Auswahlkassette (ESC) umfasst zwei Erkennungsstellen für REase, 1) die ausgewählte Sequenz (GGATCC) nahe dem rechten Ende und 2) die Counter selected Sequence (GGSSCC) nahe dem linken Ende sowie den T7p- und T7t-T7-Promoter und den T7-Terminator. Die Primerbindungsstellen sind unten dargestellt. Cleavage nach Wildtyp und ausgewählten NlaIV-Varianten werden jeweils als rote bzw. grüne Dreiecke dargestellt. (B) Auswahlzyklusschritte: I) Emulgierung von Transkriptions-Übersetzungs-Spaltungsreaktionen mit der ESC-Bibliothek; II) Die gesamte biotinylierte DNA wird auf magnetischen Partikeln erfasst, die mit Streptavidin beschichtet sind, und entfernt, wodurch inaktive Varianten entfernt werden; III) ESCs, die REases mit Wildtypaktivität kodieren (d. h. solche, die die GGSSCC-Sequenz spalten können) werden eliminiert, da die Spaltung der Sequenz die Bindungsstellen für die Vorwärts- und Rückwärtsgrundierung trennt. Daher findet keine Verstärkung dieser ESCs statt; IV) Die Eingabe für die nächste Auswahlrunde wird durch Zugabe von Biotin am rechten Ende und Wiedereinführung der Variation der gegenden ausgewählten Sequenzen am linken Ende erstellt. Nachdruck von Czapinska et al.8 mit Genehmigung von Elsevier. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig2.jpg"> Abbildung 2: Vorbereitung des ESC. Fragmente, die aus dem ursprünglichen Konstrukt in einem Expressionsvektor abgeleitet wurden, der NlaIV ORF unter der Kontrolle des T7-Promotors enthielt, wurden modifiziert, um für den Ausdruck/die Auswahl geeignet zu sein. Der NlaIV-Standort flussabwärts vom NlaIV ORF wurde entfernt und einzigartige Standorte (SalI, EcoRI und Eco52I), die zur Mutagenisierung ausgewählter Positionen verwendet wurden, wurden im NlaIV ORF als stille Mutationen eingeführt. Das letzte Konstrukt wurde mit flankierenden Primern verstärkt, die zwei flankierende NlaIV-Standorte einführten: Die Zählerauswahl (GGSSCC) auf der linken Seite und die ausgewählte Sequenz (GGATCC) auf der rechten Seite. Die Umgekehrte Grundierung führte auch Biotin ein. Primer, die bei der Erstellung von mutiertem ECS verwendet werden, werden als blaue Pfeile dargestellt und unten beschriftet (siehe Tabelle 1B,C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig3.jpg"> Abbildung 3: Schema der Split- und Mixsynthese. Das Beispiel bezieht sich auf die MutB-Primersynthese, bei der eine NNS-Sequenz mit einer Frequenz von 0,8 an vier Positionen eingeführt wurde (siehe auch Tabelle 3). Beachten Sie, dass die chemische Synthese von 3' bis 5' durchgeführt wird, aber alle Sequenzen in kanonischer 5'-3' Ausrichtung dargestellt werden (d. h. sie verläuft in diesem Schema von rechts nach links). Wildtypsequenzen an mutagenisierten Positionen werden grün dargestellt, während NNS-erbgutverändernde Sequenzen rot sind. Die SalI-Erkennungsseite, die später zur Einführung von Mutationen in ESCs verwendet wird, wird unterstrichen. Misch- und Spaltschritte (2 und 4) sind angegeben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig4.jpg"> Abbildung 4: Verwendung einzigartiger Restriktionsenzyme bei der gezielten Mutagenese von Oligonukleotid. Die Strategie der Mutationseinführung wird an einem Beispiel für den Aufbau von Bibliotheken A-C gezeigt (siehe Schritte 3.1–3.7). Nachdruck von Czapinska et al.8 mit Genehmigung von Elsevier. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig5.jpg"> Abbildung 5: Endonukleolytische Spaltung in in vitro Transkription-Translation. (A) Spaltung eines Prüfsubstrats in optimalem REase-Puffer: 1) Substrat, 612 bp PCR-Produkt mit einer einzigen NlaIV-Erkennungsstelle; 2) Cleavage-Produkte, 355 bp und 257 bp. (B) Cleavage in einer In-vitro-Transkriptions-Translation-Reaktion (mit 0,5 g ESC): 1–2) 15 L Aliquots der In-vitro-Transkriptionstranslation ohne Substrat (Zeile 2: Reaktion ergänzt mit 1,5 mM MgCl2); 3–4) 15 L Aliquots der In-vitro-Transkriptionstranslation mit 1 g Testsubstrat; (Zeile 4: Reaktion ergänzt durch 1,5 mM MgCl2). S-DNA-Größenmarker (pBR322 mit MspI verdaut). Die Stichproben wurden in 6% nativer PAGE aufgelöst. Die DNA wurde mit Ethidiumbromid gefärbt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig6.jpg"> Abbildung 6: Produkte der ersten PCR im Auswahlzyklus. Siehe Abbildung 1B, Schritt III; Protokollschritt 5.10. Die Spaltensätze 1 und 2 sind Aliquots von zwei verschiedenen Bibliotheken, die in dreifacher Ausfertigung geladen werden. S-DNA-Größenstandard (Lambda-DNA mit HindIII und EcoRI verdaut). Pfeil zeigt position des ESC in voller Länge (1.050 bp) an. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig7.jpg"> Abbildung 7: NlaIV-Varianten für weitere Screenings im Mini-Maßstab gereinigt. Siehe Schritt 6.3.11. Jede Linie enthält ein 10-L-Aliquot einer anderen Variante. S-Protein Molekulargewichtsstandard. Die Molekularmasse der Untereinheit NaIV REase beträgt 29,9 kDa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig8.jpg"> Abbildung 8: Beispiele für das Screening von NlaIV-Varianten zur Änderung der Sequenzspezifität. Siehe Schritt 6.4.2. (A) Erfolgreiches Screening mit hoher Frequenz vielversprechender Varianten. S = DNA-Größenmarker, Lambda-DNA mit HindIII und EcoRI verkleben; Wildtyp (wt) = Lambda-DNA mit Wildtyp NlaIV spaltend; • = Lambda-DNA-Substrat, nicht geklammert; andere Spalten=Varianten mit sehr geringer Aktivität. Varianten sind beschriftet ! = vielversprechende Varianten, die ein Spaltmuster erzeugen, das sich vom Wildtyp-Enzym unterscheidet; ? = Varianten, die möglicherweise auch die Sequenzpräferenz geändert haben. (B) Erfolgloses Screening, mit einer Mehrheit von Varianten inaktiv und einer Variante mit scheinbar unverändertem Spaltmuster. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig8large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig9.jpg"> Abbildung 9: Alternative Auswahl nach Ligation. Diese Alternative kann für alle REases verwendet werden, die klebrige Enden erzeugen. Hier stellen wir ein Beispielprotokoll für ein Selektionsschema für MwoI-Enzym (unveröffentlicht) vor. I) Ausgewählte Sequenz (am rechten Ende des ESC) mit definierten Rückständen in Rot und ausgewählter Variation der in Blau dargestellten Cognate-Sequenz. In Klammern unterhalb der vom Zähler ausgewählten Sequenz, die am linken Ende des ESC platziert werden soll, wird angezeigt; II) Produkt der MwoI-Spaltung; III) Nach Beendigung der In-vitro-Transkription/Übersetzung werden die Produkte gereinigt und die Ligation mit überschüssigem Adapter durchgeführt. Nur die Dekolleté-Produkte, die in der ausgewählten Sequenz gespaltet wurden, können an der Ligation teilnehmen. Daher werden inaktive Varianten eliminiert, und der Pulldownschritt ist nicht erforderlich. Das Spaltprodukt in der gegensätzlich ausgewählten Sequenz (am linken Ende des ESC, nicht dargestellt) kann nicht an dieser Ligation teilnehmen, da das hervorstehende Ende des Adapters nicht komplementär zur ausgewählten Sequenz des Zählers ist; IV) Selektive PCR verwendet die gleiche Strategie wie im Hauptprotokoll, um Varianten mit der wilden Art degenerierte Sequenzspezifität (F1-Primerbindung distal an die gegendienmarkierte ausgewählte Stelle) zu beseitigen, während inaktive Varianten durch die selektive Reverse Primer eliminiert werden, die nicht an das uncleaved (und daher nicht durch Adapterligation geändert) rechte Ende binden kann. Im nächsten Zyklus kann der Prozess iteriert werden, indem ein Adapter verwendet wird, der mit dem Spaltprodukt des vorhergehenden Schritts identisch ist (d. h. die "Spaltenkassette" in Panel III), und eine geeignete selektive Reverseprimer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig9large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Tabelle 1: Primer, die in der NlaIV-Konstruktion verwendet werden. Die Sequenzen der in den Kommentaren genannten Einschränkungsseiten werden unterstrichen. Kleine Buchstaben zeigen Sequenzen an, die keine Ergänzungen in den DNA-Vorlagen haben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/table1.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle anzuzeigen (Rechtsklick zum Herunterladen).</a>
Tabelle 2: Bedingungen der PCR-Reaktionen, die im Protokoll verwendet werden sollen. Tm = Grundschmelztemperatur (wenn Tm für die Primer unterschiedlich ist, sollte das untere Tm verwendet werden). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/table2.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle anzuzeigen (Rechtsklick zum Herunterladen).</a>
Tabelle 3: Ergebnisse der Qualitätsprüfung von zwei mutagenen Primern, die mit Split-and-Mix-Strategie synthetisiert wurden. Mutagenisierte Codons werden mit [XXX] angezeigt. Eine niedrigere Indexzahl gibt die Position einer codierten Aminosäure an. Angepasst von Czapinska et al.8 mit Genehmigung von Elsevier. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/table3.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle anzuzeigen (Rechtsklick zum Herunterladen).</a>
Tabelle 4: Ergebnisse der EP-PCR. Hauptparameter aus der Sequenzanalyse von 22 Clones von ECS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/table4.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle anzuzeigen (Rechtsklick zum Herunterladen).</a>

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In Vitro Directed Evolution of a Restriction Endonuclease with More Stringent Specificity

Restriktionsendonukleasen mit neuer Sequenzspezifität können aus Enzymen entwickelt werden, die eine teilweise degenerierte Sequenz erkennen. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Verfügung, das wir erfolgreich verwendet haben, um die Sequenzspezifität des NlaIV-Enzyms zu verändern. Wesentliche Bestandteile des Protokolls sind die In-vitro-Kompartimentisierung der Transkriptions-/Übersetzungsreaktion und die Auswahl von Varianten mit neuen Sequenzspezifitäten.

In Vitro gerichtete Evolution einer Restriktionsendonuklease mit strengerer Spezifität

Restriction endonuclease (REase) specificity engineering is extremely difficult. Here we describe a multistep protocol that helps to produce REase ...

Unser Protokoll ermöglicht die Schaffung von Restriktionsenzymen mit veränderten, strengeren Sequenzspezifitäten durch In-vitro-Kompartimentisierung und eine einzigartige Selektionsstrategie in der gerichteten Evolution. Potenziell ist es ziemlich universell, da es auf jede Einschränkung Endonuklease anwendbar sein sollte und Auswahl kann auf jede strengere Version einer ursprünglichen Cognate-Sequenz gerichtet werden. Werden neu erstellte Varianten durch In-vitro-Transkription-Übersetzung ausgedrückt, eignet sich das Protokoll nicht nur zur Eingrenzung der Spezifität, sondern auch zur Änderung der Spezifität.Um Standorte für die Subsättigungsmutagenese zu bestimmen, wählen Sie Mutagenese-Frequenzen entsprechend der hypothetischen Bedeutung der Standorte, wobei die Grenzen der Gesamtkomplexität der Bibliothek im Auge behalten werden. Um mit der Synthese zu beginnen, legen Sie Spalten, die mit neuem Harz verpackt wurden, in den Synthesizer ein. Synthetisieren Sie Oligonukleotide in allen Spalten bis zum Triplet, unmittelbar vor der zweiten Subsättigung mutagenese Stelle Zählen aus dem Drei-Prim-Ende.Synthesize, so dass eine Fünf-Prim-Trityl-Gruppe am Ende. Die Schutzgruppe wird zu Beginn des nächsten Synthesezyklus entfernt. Öffnen Sie die Synthesesäulen und zentrieren Sie kurz in trockene 1,5-Milliliter-Rohre, um das Harz zu sammeln.Ziehen Sie die CPG-Synthese-Unterstützung und mischen Sie durch Wirbel. Das gemischte CPG-Harz in neue Synthesesäulen umteilen. Vermeiden Sie die Einführung von Feuchtigkeit, da es den Gesamtertrag verringert.Setzen Sie die Synthese fort, beginnend mit dem Subsättigungs-Mutagenese-Standort-Triplet. Weisen Sie randomisierten NNS-Triples oder Wildtyp-Triples entsprechend der gewünschten Mutagenesehäufigkeit Spalten zu. Wenn zusätzliche Subsättigungsstellen vorhanden sind, fahren Sie nur mit dem Triplet vor dem nächsten Subsättigungsmutagenese-Standort fort.Wenn keine Subsättigungsstellen mehr nachgelagert vorhanden sind, schließen Sie die Synthese ab, sodass am Ende eine Fünf-Prim-Trityl-Gruppe übrig bleibt. Verwenden Sie breitbohrungspipettenspitzen, um ein Öltensidgemisch zu zuzubereiten, indem Sie 225 Mikroliter Span 80 und 25 Mikroliter Tween 80 bis fünf Milliliter Mineralöl in einem 15 Milliliter konischen Rohr hinzufügen. Mischen Sie gründlich durch sanfte Inversion 15 Mal.Die Mischung bei diesem Schritt sollte durchscheinend sein. Übertragen Sie für jede Bibliothek 950 Mikroliter des Öltensidgemisches in eine zwei Milliliter runde untere kryogene Durchstechflasche. Etikett mit einem Bibliotheksnamen und Übertragung auf Eis.Legen Sie einen kleinen zylindrischen Rührstab in jede Durchstechflasche. Bereiten Sie ein In-vitro-Transkriptions-Translation-Reaktionsgemisch nach den Vorschlägen des Herstellers vor. Die Mischung mit Magnesiumchlorid auf eine Endkonzentration von 1,5 Millimolar ergänzen.50 Mikroliter Aliquots des Reaktionsgemisches in 1,5 Milliliter-Röhren auf Eis geben. 1,7 Femtomolen der Bibliothek in das Reaktionsgemisch auf Eis geben. Bereiten Sie die Wasser-in-Öl-Emulsion nacheinander für jede Bibliothek vor, indem Sie zunächst einen kleinen Becher, der mit Eis gefüllt ist, auf einen magnetischen Rührer stellen, wobei die Rührgeschwindigkeit auf 1150 RPM eingestellt ist.Dann eine kryogene Durchstechflasche mit 950 MikroliterÖltensidmischung und einem kleinen Rührstab in ein eiskaltes Becherglas am Magnetrührer geben. Überprüfen Sie, ob sich der Rührstab dreht. Fügen Sie fünf 10-Mikroliter-Aliquots der In-vitro-Bibliotheks-Transkriptions-Übersetzungsmischung über einen Zeitraum von zwei Minuten in 30 Sekunden hinzu und rühren Sie für eine weitere Minute weiter.Die Durchstechflasche mit der Emulsion in einen Eisbehälter geben. An dieser Stelle sollte die Flüssigkeit undurchsichtig und nicht durchscheinend sein. Fahren Sie dann mit der nächsten Bibliothek fort.Nachdem alle Bibliotheken verarbeitet sind, beginnen Sie die Inkubation aller Bibliotheken gemäß den Empfehlungen des Kitherstellers. Übertragen Sie die Fläschchen für weitere zwei Stunden auf die für die entwickelte Endonuklease optimale Temperatur, bevor Sie sie für mindestens 10 Minuten auf Eis legen. Übertragen Sie die Emulsionen aus den kryogenen Durchstechflaschen in 1,5 Milliliter-Röhren.Fügen Sie einen Mikroliter von 5 Molaren EDTA. Und zentrifugieren Sie sie bei 13.000 mal g für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Wenn Sie nach dem Zentrieren die Wasser-Öl-Schnittstelle nicht klar sehen können, frieren Sie das Gemisch vor der Aspiration der oberen Ölphase ein.Bewegen Sie die obere Ölphase mit einer Pipette und entsorgen Sie. Führen Sie sofort die Extraktion durch, indem Sie 150 Mikroliter Phenolchloroform und 100 Mikroliter 10 Millimolar Tris-HCl in die wässrige Phase aufnehmen. Wirbel und führen Sie dann Phasentrennung über 30-Sekunden-Zentrifugation bei 13.000 mal g.Sammeln Sie die obere wässrige Phase. Niederschlagen Sie die DNA, indem Sie 15 Mikroliter dreimolares Natriumacetat, 2,5 bis fünf Mikrogramm Glykogen und 375 Mikroliter Ethanol hinzufügen. Nach der Inkubation der Proben bei minus 20 Grad Celsius für eine Stunde, Zentrifuge für 15 Minuten bei 13.000 mal g, vier Grad Celsius.Den Überstand entsorgen und das Pellet kurz mit einem Milliliter kaltem 70%Ethanol waschen. Trocknen Sie das DNA-Glykogenpellet länger als fünf Minuten in einem Geschwindigkeitsvakuum oder Lufttrockner. Dann lösen Sie das Pellet in 50 Mikroliter von 10 Millimolar Tris-HCl.Als nächstes fügen Sie fünf Mikroliter Streptavidin magnetische Perlen, nach den Anweisungen des Herstellers vorbereitet. Eine Stunde bei Raumtemperatur mischen, vorzugsweise in einem Karussellmischer oder durch sanftes Wirbeln. Übertragen Sie die Rohre auf einen magnetischen Ständer, um die Perlen zu trennen.Dann sammeln Sie die in der DNA angereicherte Flüssigkeit ohne Biotin. Dieses Protokoll ist ein Werkzeug, um die Häufigkeit der gewünschten Varianten von technischen Restriktionsendonukleasen zu erhöhen, indem inaktive Enzyme und Endonukleasen mit unveränderter Wildtyp-Sequenzspezifität aufgebraucht werden. Erfolgreiches Screening kann bis zu 20% der vielversprechenden Varianten identifizieren.Varianten werden als vielversprechende Varianten gekennzeichnet, wenn sie ein Spaltmuster erzeugen, das sich vom Wildtyp-Enzym unterscheidet. Varianten, die möglicherweise die Sequenzeinstellung geändert haben, werden ebenfalls beschriftet. Hier ist ein erfolgloses Screening mit der Mehrheit der Varianz inaktiv und eine Variante mit scheinbar unverändertem Spaltmuster zu sehen.In diesem Fall werden die Bibliotheken höchstwahrscheinlich von inaktiven Varianten dominiert, die dem Streptavidin-Erfassungsschritt entgangen sind. Es ist wichtig, die ausgewählten und gegenausgewählten Sequenzen sorgfältig zu gestalten und die Bibliotheksvielfalt durch eine Mutagenese-Strategie zu begrenzen, die Substitutionen nur an wenigen ausgewählten Positionen erzeugt. Die besten ausgewählten Varianten sollten für die Bindungs- und Spaltungskinetik auf bevorzugten und nicht auf den Ergebnissen des ersten Screenings basierenden Sequenzen gründlich charakterisiert werden.In unserem Testfall wurden Mutagenese-Sites nach einem Homologiemodell ausgewählt. Überraschenderweise zeigte eine Kristallstruktur später, dass einige veränderte Rückstände höchstwahrscheinlich nicht in direktem Kontakt mit der DNA stehen.

Research

JoVE Journal

Genetics

Design and Use of a Low Cost, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution of Bacteria Under Antibiotic Drug Selection

Design und die Verwendung eines Low Cost, Automatisierte Morbidostat für Adaptive Evolution der Bakterien unter Antibiotikums Selection

We describe a low cost, configurable morbidostat for characterizing the evolutionary pathway of antibiotic resistance. The morbidostat is a bacterial ...

Forschung

Genetik

Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat

Verfahren für Adaptive Labor Entwicklung von Mikroorganismen Mit einem Chemostat

Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) ...

Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development

Genome Editing und gerichteten Differenzierung von hPSCs zur Abfrage Lineage Bestimmungsfaktoren im Bereich Human Pancreatic Entwicklung

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding ...

Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans

Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans

Quantifizierung der Information kodiert durch Gene Expression Ebenen während der Lebensdauer Modulation unter breiter Palette diätetische Einschränkung in C. elegans

Sensory systems allow animals to detect, process, and respond to their environment. Food abundance is an environmental cue that has profound effects on ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation von einem Gen gestört Streptococcus Mutans Belastung ohne Gene Klonen

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Testing the Role of Multicopy Plasmids in the Evolution of Antibiotic Resistance

Testen die Rolle des Multicopy Plasmide in der Entwicklung von Antibiotika-Resistenzen

Multicopy plasmids are extremely abundant in prokaryotes but their role in bacterial evolution remains poorly understood. We recently showed that the ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Genomweite Überwachung der Übertragungsfehler in Eukaryonten

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

Herstellung von Gen-Deletionen in Escherichia coli durch P1 Transduktion mit verbrauchsteuerpflichtigen Antibiotikaresistenz Kassetten

A first approach to study the function of an unknown gene in bacteria is to create a knock-out of this gene. Here, we describe a robust and fast protocol ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

Mit In-vitro- und In der Zelle Form zu untersuchen, kleines Molekül induzierte Pre-mRNA Strukturveränderungen

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Using Sniper-Cas9 to Minimize Off-target Effects of CRISPR-Cas9 Without the Loss of On-target Activity Via Directed Evolution

Verwendung von Sniper-Cas9, Off-Target Auswirkungen von CRISPR-Cas9 ohne den Verlust der Zielaktivität durch gerichtete Evolution

The development of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated protein 9 (Cas9) into therapeutic modalities requires the ...