Name: in vitro directed evolution of a restriction endonuclease with more stringent specificity
Uploaded: 2020-03-25T15:00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Directed Evolution of a Restriction Endonuclease with More Stringent Specificity at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי המענקים של משרד המדע והשכלה גבוהה (0295/B/PO1/2008/34 כדי MB ו N301 100 31/3043 ל KS), מן המרכז הלאומי המדע הפולני (NCN) (מו-2011/02/A/NZ1/00052, מו-מ-2014/13/B/NZ1/03991 והמו-2014/14/מ/NZ5/00558 למגה) ועל ידי לטווח קצר מלגת EMBO ל KS (ATSF 277.00-05).

<ol>
	<li>Sch&#246;ttler, S., Wenz, C., Lanio, T., Jeltsch, A., Pingoud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+engineering+of+the+restriction+endonuclease+EcoRV--structure-guided+design+of+enzyme+variants+that+recognize+the+base+pairs+flanking+the+recognition+site.">Protein engineering of the restriction endonuclease EcoRV--structure-guided design of enzyme variants that recognize the base pairs flanking the recognition site.</a> European Journal of Biochemistry. 258 (1), 184-191 (1998).</li><li>Wenz, C., Hahn, M., Pingoud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+variants+of+the+restriction+endonuclease+EcoRV+that+depend+in+their+cleavage+activity+on+the+flexibility+of+sequences+flanking+the+recognition+site.">Engineering of variants of the restriction endonuclease EcoRV that depend in their cleavage activity on the flexibility of sequences flanking the recognition site.</a> Biochemistry. 37 (8), 2234-2242 (1998).</li><li>Samuelson, J. C., Xu, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+restriction+endonuclease+BstYI+to+achieve+increased+substrate+specificity.">Directed evolution of restriction endonuclease BstYI to achieve increased substrate specificity.</a> Journal of Molecular Biology. 319 (3), 673-683 (2002).</li><li>Samuelson, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+a+rare-cutting+restriction+enzyme:+genetic+screening+and+selection+of+NotI+variants.">Engineering a rare-cutting restriction enzyme: genetic screening and selection of NotI variants.</a> Nucleic Acids Research. 34 (3), 796-805 (2006).</li><li>Rimseliene, R., Maneliene, Z., Lubys, A., Janulaitis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+restriction+endonucleases:+using+methylation+activity+of+the+bifunctional+endonuclease+Eco57I+to+select+the+mutant+with+a+novel+sequence+specificity.">Engineering of restriction endonucleases: using methylation activity of the bifunctional endonuclease Eco57I to select the mutant with a novel sequence specificity.</a> Journal of Molecular Biology. 327 (2), 383-391 (2003).</li><li>Morgan, R. D., Luyten, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+engineering+of+type+II+restriction+endonuclease+DNA+binding+and+cleavage+specificity.">Rational engineering of type II restriction endonuclease DNA binding and cleavage specificity.</a> Nucleic Acids Research. 37 (15), 5222-5233 (2009).</li><li>Skowronek, K., Boniecki, M. J., Kluge, B., Bujnicki, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+engineering+of+sequence+specificity+in+R.MwoI+restriction+endonuclease.">Rational engineering of sequence specificity in R.MwoI restriction endonuclease.</a> Nucleic Acids Research. 40 (17), 8579-8592 (2012).</li><li>Czapinska, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+Structure+and+Directed+Evolution+of+Specificity+of+NlaIV+Restriction+Endonuclease.">Crystal Structure and Directed Evolution of Specificity of NlaIV Restriction Endonuclease.</a> Journal of Molecular Biology. 431 (11), 2082-2094 (2019).</li><li>Miller, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+by+in+vitro+compartmentalization.">Directed evolution by in vitro compartmentalization.</a> Nature Methods. 3 (7), 561-570 (2006).</li><li>Zheng, Y., Roberts, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+restriction+endonucleases+using+artificial+cells.">Selection of restriction endonucleases using artificial cells.</a> Nucleic Acids Research. 35 (11), e83 (2007).</li><li>Takeuchi, R., Choi, M., Stoddard, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redesign+of+extensive+protein-DNA+interfaces+of+meganucleases+using+iterative+cycles+of+in+vitro+compartmentalization.">Redesign of extensive protein-DNA interfaces of meganucleases using iterative cycles of in vitro compartmentalization.</a> Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 111 (11), 4061-4066 (2014).</li><li>Howland, J. L., Ausubel, F., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Short Protocols in Molecular Biology. , (1995).</li><li>Wilson, D. S., Keefe, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+8+Unit+8.3:+Random+mutagenesis+by+PCR.">Chapter 8 Unit 8.3: Random mutagenesis by PCR.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (2001).</li></ol>

. למחברים אין מה לגלות

פרוטוקול הבחירה המתואר כאן נבדק עבור NlaIV8, a dimeric-(D/E) רצף זיהוי קיפול xk המכיר אתר היעד palindromic עם בסיסי nn מרכזי ומזרז לחתוך קצה קהה בין בסיסי nn. NlaIV נבחר כי המחשוף בין בסיסי NN מציע כי בסיסים אלה קרובים לחלבון במתחם. בעיקרון, הפרוטוקול יכול לשמש עבור כל מגבלה מסוימת ההגבלה endonuclease, monomeric או dimeric, של כל קבוצה לקפל, לזרז הפסקות הגדיל כפול של כל היתקלות, ללא קשר אם מחשבים קטליטיים וספציפיות חופפים (כמו בדוגמה NlaIV) או נפרדים (למשל, FokI). יתר על כן, הפרוטוקול בעיקרון הוא שימושי לא רק עבור הדור של הפרט החדש, האנזים הצר יותר, אבל יכול לשמש גם כדי לחסל את הפעילות כוכב, או כדי ליצור מחדש בנאמנות באיכות גבוהה. עם זאת, כל זה עדיין לא נבדק. בפרט, חיסול ממוקד של פעילות כוכב עשוי להיות מסובך, כי אותו שאריות חומצות אמינו יכול להיות מעורב בכריכה לבסיסים הרצוי ולא רצויים. בצעדי החוץ-מבחנה המתוארים בפרוטוקול זה אינם מוגבלים לבחירה של מצמצמי הצורה, אך ניתן להשתמש בה גם לבחירת משתנים ששונו אחרת. עם זאת, יש אז בעיה עם משתנה endונוקלסים: אם הספקטרום של מצעים כולל מטרות הרומן לא ביקע על ידי endonucחכירה הורים, יש בכלל אין דרך טובה להגן על התאים מפני ההשפעות המזיקות של פעילות זו. לעומת זאת, אם endonuclease ספציפיות רק לצמצם, המטרות הן תת-קבוצה של מטרות סוג פראי, ולכן הזמין כבר קנצוני מתילאז צריך להיות מגונן לחלוטין.
הפרוטוקול שלנו שונה בכמה כבוד מפרוטוקולי אבולוציה מכוונים רבים. מסגרת קריאה פתוחה מגוון מופק פעם אחת בתחילת הניסוי, לא בכל איטרציה. כמו-כן, היא נוצרת על-ידי סינתזה מפוצלת ומיקס, ולא על-ידי EP-PCR. עבור החלפות NNS של codons, כמו בשימוש בעבודה זו, יש (4 x 4 x 2)6 ~ 1.07 x 109 שילובים עבור שישה מיקומים. לכן, כל משתנה נתון קיים בממוצע פעם אחת ב-1.7 שומות של ESC. קיבולת זו יכולה להיות מוגברת לשבעה תנוחות באמצעות סינתזה עם תערובת של 20 מקדמי טריאוקלאואות מראש כי הוא מוצע על ידי גלן מחקר או על ידי הפחתת תדר מוטציה בתנוחות פחות מבטיח עם מפוצל ו-mix הסינתזה של מיקס. במידת האפשר, מומלץ להגביל את מידת הווריאציה לשישה תנוחות. כמובן, מיקוד כזה דורש ידע מראש על לפחות האזורים של ושהה המעורבים בכריכה מצע. הפרוטוקול המפוצל והמיקס להפקת גיוון הוא בעל יתרונות ברורים בהשוואה ל-EP-PCR. באמצעות EP-PCR, הצלחנו להשיג משתנים ורצפים ללא שינוי הנושאים שמונה החלפות עבור NlaIV ESCs באותו EP-PCR (שולחן 4). הספרייה מ-EP-PCR מכילה חלקיק משמעותי של שיבוטים שיש להימנע מהם (רצפים סוג פראי, החלפות מרובות, מוטציות frameshift ושטויות, ומוטציות במקומות סביר להשפיע על הספציפיות הרצף).
הפרוטוקול שלנו גם שונה מפרוטוקולים רבים אחרים של אבולוציה מכוונות על ידי נוכחות של שני שלבי בחירה רציפים. בחירה חיובית מוודא שהפעילות הרצויה נשמרת, אחרת התג ביוטין אינו מוסר, וניתן להסיר את רצף הקידוד על-ידי משיכה למטה. זה אפשרי מבחינה טכנית כי הופעתה של רומן, ספציפיות לא חופפים (g., gcatgc) יכול להוביל לניתוק של תג ביוטין גם, אם אתר מחשוף מתאים נמצא ליד המחשוף הרצוי, אבל לא במקום אחר. עם זאת, זה צריך להיות מאוד לא סביר. בחירה שלילית מסירה מסגרות קריאה פתוחות הקוד עבור אנזימים שעדיין יש להם פעילות בלתי רצויה. צעד זה אינו חובה בלבד, כי הפרוטוקול עדיין להעשיר את ספריית הפלט עם משתנים כי הם מסוגלים לדבוק רצף הבחירה אבל לא מסוגל לקליב במקום אחר ב ESC, ולכן הרינדור זה לא מתאים הגברה PCR. עם זאת, יעילות הבחירה צפויה להיות נמוכה יותר משום אנזימים עם ספציפיות הרצף המקורי לא יוסרו מן הפלט ויהיה להתמודד עם משתנים מבטיחים עם ספציפיות שונה, אבל גם ירידה פעילות אנזימטית. שים לב כי ברמת האוכלוסייה, שניהם הרצוי ובלתי רצויות רצפי היעד יכול, אבל לא צריך להיות, מנוון. בדוגמה NlaIV, האנטי-מטרה היה מנוון והמטרה לא מנוונת. גם כאשר יש התנוונות ברמת האוכלוסייה, ב-droplet אחת בלבד (לא מנוונת) יעד או אנטי יעד קיים. בפרוטוקול שלנו, רצפי היעד והאנטי-יעד מוצגים מחדש בכל חזרה על צעדי הבחירה. לכן, מסגרת הקריאה פתוח חייב לקודד אנזים מסוגל לעזוב את כל המטרות האפשריות, ולא יכול לדבוק כל האנטי מטרות, כדי לשרוד סיבובים בחירה מרובים. שים לב כי הצורך להציג מראש את היעד האנטי-בחירה בכל איטראציה של הפרוטוקול כופה שני בדיקות רציפים. ה-PCR הראשון משתמש בפריימר המספח מחוץ למטרה, כך שמחשוף האנטי-מטרות ימנע את תגובת ה-PCR. ה-PCR השני דורש כיוון שמגיע מעבר ליעד, ומציג מחדש את אנטי-היעד, כדי לוודא שבמהלך מספר סבבים של בחירה, כל מסגרת קריאה פתוחה נבדקת כנגד כל המשתנים של האנטי-מטרות.
עבור אנזימים היוצרים קצוות דביקים, פרוטוקול חלופי קשור המבוסס על שיטה שתוארה בעבר לבידוד של ושהה ORF10 ניתן להשתמש. דלדול של משתנים לא פעילים על ידי לכידת ביוטין המשמש בניסויים שלנו מוחלף בפרוטוקול האלטרנטיבי על ידי הארכה של מתאם תואם עם רצף המשמש כאתר כריכה פריימר ב-PCR סלקטיבי (איור 9). רק ESCs שמייצרים אנזימים עם הספציפיות שנבחרו יוצרים קצוות בעלי יכולת הארכה ולכן ייבחרו. יש לתכנן את הרצף של הקצה הדביק של המונה שנבחר באמצעות מונה באופן שאינו יכול להשתתף במתאם עם מתאמים. איטרציה של תהליך הבחירה ניתן להשיג בקלות על ידי מעבר בין שני מתאמים שונים וכתוצאה מכך שני התחל הפוכה שונה ב-PCR סלקטיבי.
אפילו עם פרוטוקולים חדשים, המשימה של הנדסת רומן הנדסה בתוך מבחנה עדיין מאוד מאתגר. עבור הקצאות מסוג II, ספציפיות לרצף ופעילות למען המין הרגיל תלויות באותם אזורי חלבון. לכן קשה לשנות אחד מבלי להשפיע על האחר. הצלחה היא הסבירות יותר על ידי אסטרטגיה הלוקחת בחשבון את טביעת הרגל של האנזים, מכבדת את הסימטריה של אינטראקציות חלבונים-DNA, ובונה על העדפות אנזימטיות קיימת, אשר צריך להיקבע מראש בניסויים ביוכימיים, כפי שנעשה עבור NlaIV דוגמה8.

הנדסת הסדרה ספציפיות מאתגר מאוד עבור class II מרינרס. בכיתה זו של end, הכרה רצף ומזרז הם שזורים היטב, כנראה כהגנה אבולוציונית מפני יצירת endonucחכירה של ספציפיות יותר מאשר קנצוני מתילאז, אשר נזק DNA מארח. האבולוציה בבימויו של בתאי המינים החדשים בתאים הוא מסובך יותר על ידי הצורך להגן על הדנ א מארח נגד פעילות endonuclease החדש הנדסה. לכן, יש רק כמה ניסיונות מוצלחים של ושהה הנדסה דיווחו וכולם לנצל את התכונות הייחודיות של אנזים מסוים1,2,3,4,5,6,7.
כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט עבור הנדסה ספציפיות שניתן להשתמש בהם כדי ליצור משתנים endonuclease כי יש ספציפיות יותר מאשר אנזים הורים המבוסס על הנדסה מוצלחת שלנו endonuclease8. עבור כל אנזים כזה עם רצף הכרה שרירותי, ניתן להציג ספציפיות נוספות עבור בסיסים באגפים. עבור אנזימים הורים המכירים רצפים מנוונת חלקית (כגון NlaIV עם היעד שלה GGNNCC), פרטים נוספים יכולים גם להיות מוצגים בתוך רצף ההוקרה. כמו ספציפיות יותר סביר להניח שידרוש אנטי-DNA חלבונים, הבסיסים שזוהו לאחרונה צריך לשקר בתוך טביעת הרגל של endonuclease הורים ב-DNA. בעיקרון, ניתן להגדיר סכימות בחירה עבור כל התמחות רצויה של רצף ההוקרה. עם זאת, רוב הקצאה כי מזהה palin, וכמעט palin, רצפים היעד הם דימרים פונקציונלי המכירים רק חצי האתר של הפאלאינדרום. מכאן, מבחר של הקשר החדש שמפר את סימטריה של אינטראקציות גרעין החלבון סביר לעבוד. עבור dimeric NlaIV, למשל, את הרצף GGNNCC יכול תיאורטית להיות מצטמצם כדי GGATCC אבל צמצום ספציפיות למטה GGAACC צפוי להיות קשה יותר. המזימה שלנו כרוכה בבחירה חיובית ושלילית.
התהליך יעיל יותר כאשר בחירה שלילית משמש גם כדי להסיר את specificities מסוגל לקליב את כל הרצפים מלבד ספציפיות צר המועדף. לדוגמה, בחירה עבור GGATCC יכולה להיות משולבת עם בחירה בניגוד ל-GGBVCC (כאשר B הוא כל בסיס אחר מ-A, ו-V הוא כל בסיס אחר מ-T). כאשר חלק מרצפי היעד האפשריים אינם מכוסים, תוצאת ניסוי הבחירה תלויה באפקטיביות של בחירה חיובית ושלילית. בעבודה NlaIV שלנו, בחרנו GGATCC, ו נגד GGSSCC (כאשר S הוא G או C), והשיג ספציפיות, התעלמות מטרות שבירת סימטריה, ניתן לתאר כ-GGATCC (כאשר W הוא A או T), הרומז כי במקרה מסוים זה, בחירה שלילית היה יותר חשוב מבחירה חיובית.
הגישה שלנו מתחילה ביצירת קלטת בחירת ביטוי (ESC). ESC מובנה במקטעים. בחלק הליבה הפנימי, יש משתנים של מסגרת הקריאה הפתוחה (ORF) של ושהה, תחת T7 פקד יזם. אזור ליבה זה של ESC אינו יכול להכיל כל אתר קנצוני עבור ושהה הנדסה. הליבה דחוקה בין שני אתרי קנצוני לסוג פראי ושהה: אתר מחשוף לפעילות בלתי רצויה (מונה הרצף שנבחר, ggsCC בדוגמה זו) ואתר מחשוף עבור הפעילות הרצויה (רצף נבחר, ג 'טאלידיעהבדוגמה). השלב האחרון של הכנת ESC ב-PCR מוסיף ביוטין קרוב לפעילות הרצויה בסוף 5 ' ויוצר מגוון של רצפים שנבחרו מונה (ggsscc בדוגמה). אסטרטגיית הבחירה מתבססת על השימוש בעיצוב התחל בקפידה בפרוטוקול ESC לאחר הגברה בפרוטוקול שעתוק/תרגום/בחירה (איור 1א). ספריית ESC מתבטאת בתרגום שעתוק מחוץ למים ב-תחליב שמנים,9,10,11. בתוך כל droplet, הספציפיות של האנזים המבוטא משפיעה על מצב ה-ESC (איור 1ב, שלב I). עבור ההסדר המתואר, פעילות המחשוף הרצוי של החלבון המתורגם מסיר את תג ביוטין של ה-DNA, אך אינו משפיע על הקצה השני של ESC עם המונה ברצף שנבחר. כאשר אמולסיה שבורה, שברים biotinylated מוסרים על ידי streptavidin זיקה היורד, כך רק שברי מתוך טיפות עם הפעילות הרצויה להישאר (איור 1B, צעד שני). שלב זה מסיר משתני ושהה לא פעילים. חלק הסופרפוזיציה של השלב המתעלה מוגבר על ידי ה-PCR. ב-PCR הראשון תגובת התחל F2 ו R1 משמשים (איור 1A, B, שלב III). פריימר F2 מאגד את המקטע ESC בין מונה שנבחר לבין סוף המולקולה. לכן, ESCs מביע משתנים המסוגלים לעזוב את הדלפק ברצף שנבחר (ולכן, להפריד את אתרי הכריכה עבור התחל F2 ו R1 לשתי מולקולות DNA שונות) אינם מוגבר ומוסרים כך מהספריה. R1 פריימר נקשר בין האתר שנבחר לבין הליבה של ESC כך שהוא לא מושפע ממצב המחשוף של האתר הנבחר ומשחזר את אתר המחשוף עבור הפעילות הרצויה (GGATCC). המחזור סגור על ידי ה-PCR השני (עם התחל F1 ו-R2) המוסיפה ביוטין בקצה 5 הקרוב לאתר שנבחר ומשחזרת וריאציה מעוצבת באתר שנבחר הדלפק קרוב לקצה הנגדי של ESC (איור 1ב, שלב IV). תערובת ה-DNA שתיווצר מוכנה לסיבוב נוסף של בחירה.
הצלחת פרוטוקול הבחירה תלויה מאוד בבחירה הנכונה של רצף זיהוי המטרה החדש והקפדני ביותר ובתכנון קפדני של אסטרטגיית המוטגנזה ויישומו האפקטיבי. מכיוון שזה הרבה יותר קל לשפר את ההעדפות הקיימת מראש ושהה מאשר להתגבר עליהם, אנו ממליצים להתחיל עם מחקר קינטי של כל ההעדפות הקיימים. הצורך בעיצוב מוטארסיס קפדני נובע מהגודל המוגבל של ספריית מוטציות שניתן לעבד על-ידי הפרוטוקול המוצג (109 שיבוטים בניסוי אחד). משום כך ניתן לבדוק ביעילות את כל 20 ההחלפות של חומצת אמינו בכמה תנוחות (ראה דיון). מוטגנזה אקראית, כגון ה-PCR הנוטה לשגיאות (EP-PCR) המוצג כשיטה חלופית, יוביל לחשיפה מעמיקה של המורכבות הקיימת. אם מידע כלשהו על משרות חומצות אמינו פוטנציאליות המעורבים במגעים עם ה-DNA (או אפילו ממוקם בסמיכות לנוקלאוטידים מנוונת ברצף קנצוני) זמין, זה בהחלט צריך לשמש כדי לבחור כמה חומצות אמינו עבור oligen, הגאות מונחה מוטאוזיס רוויה (שלבים 1.6-3.10).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1000&#197; CPG Support (dA, dT, dC, dG)</td>
			<td>Biosset</td>
			<td>45-1000-050</td>
			<td>Other vendors can be used as well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ASM-800 DNA/RNA</td>
			<td>Biosset</td>
			<td>800-001-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJET Gel Extraction Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K0691</td>
			<td>Any other kit can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glen-Pak DNA purification cartridge</td>
			<td>Glen Research</td>
			<td>60-5200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIS-Select Nickel Affinity Gel</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET 28a vector</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any other vector with T7 promoter upstream of plycloning site can be used instead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td>Any other high fidelity and highly processive thermophilic polymearse can be used instead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porous steel foil</td>
			<td>Biosset</td>
			<td>40-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid Translation System 
			RTS 100, E.coli HY Kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3 186 148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction endonucleases</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Obviously other vendors, enzymes can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Magnetic Beads</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>S1420S</td>
			<td>Other vendors can be used as well. We have positively tested beds form Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthesis chemicals including phosphoramidities</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td></td>
			<td>Other vendors can be used as well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthesis columns (different sizes)</td>
			<td>Biosset</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EL0011</td>
			<td>Any other ligase can be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro directed evolution of a restriction endonuclease with more stringent specificity

הגבלה endonuclease (ושהה) ההנדסה הספציפיות היא קשה מאוד. כאן נתאר פרוטוקול רב-שלבים המסייע בהפקת משתני ושהה המחמירים יותר מאשר האנזים ההורה. הפרוטוקול דורש יצירת ספריה של קלטות בחירת ביטויים (ESCs) עבור משתנים של ושהה, באופן אידיאלי עם שינויים במיקומים הצפויים להשפיע על איגוד ה-DNA. ESC מוקף בצד אחד על-ידי רצף עבור פעילות אתר ההגבלה הרצויה ותגית ביוטין ובצד השני על-ידי אתר הגבלה עבור הפעילות הבלתי רצויה ואתר ריפוי מתחל. ESCs משועתק ומתורגם ב תחליב מים בשמן, בתנאים הופכים את הנוכחות של יותר ממולקולה DNA אחת לכל droplet סביר. לכן, ה-DNA בכל מולקולה קלטת נתון רק לפעילות של האנזים מתורגם, מקודד. ושהה משתנים של הספציפיות הרצוי להסיר את תג ביוטין אבל לא את האתר ריפוי פריימר. לאחר שבירת אמולסיה, מולקולות ה-DNA הם חשופים ביוטין הנפתח, ורק אלה בסופרנטנט נשמרים. שלב זה מבטיח כי רק ESCs עבור משתנים שלא איבדו את הפעילות הרצויה נשמרים. מולקולות הדנ א האלה. נתונים לתגובת ה-PCR הראשונה המחשוף ברצף הבלתי רצוי חותך את אתר הכריכה הפריימר עבור אחד התחל. לכן, ה-PCR מגביר רק מטיפות ללא פעילות בלתי רצויה. תגובת ה-PCR השנייה מבוצעת לאחר מכן כדי להציג מחודש את אתר ההגבלה עבור הפירוט הרצוי ואת תג ביוטין, כך שניתן יהיה לשוב ולשוב בשלב הבחירה. מסגרות קריאה פתוח שנבחרו יכול להיות מבוטא יתר על התאים חיידקי כי גם לבטא את קנצוני מתילאז של ושהה הורים, כי התפתחו החדש ושהה מטרות רק תת קבוצה של אתרי היעד מתילאז.

פרוטוקול זה הוא רק כלי כדי להגדיל את התדירות של הגרסאות הרצויות של ושהה הנדסה על ידי מכלה (אך לא חיסול) שתי מחלקות לא רצויות: אנזימים לא פעילים והטיות בלתי משתנה עם סוג פראי הרצף ספציפיות. מצד שני, כי שינוי ספציפיות ושהה הוא מאוד קשה, מציאת אפילו אחד כזה גרסה להפקת דפוס המחשוף כי הוא שונה מן האנזים סוג פראי בהקרנה אחת של 24 שיבוטים צריך להיחשב הצלחה. בידינו המסכים הטובים ביותר יכולים לזהות עד 20% מווריאנטים המבטיחים (איור 8א).
התוצאה החיובית תלויה באיכות הספרייה (כלומר, תדירות מוגבלת של החלפות וההפצה האקראית שלהם) ולכידה יעילה של האוכלוסייה הביוטימית של חברי הספרייה (שלבים 3.6 – 3.7). ניתן לזהות את שתי הבעיות. איכות הספרייה יש לבדוק לפני הבחירה על ידי רצף כמו שיבוטים רבים ככל האפשר (> 15) או על ידי רצף ישיר של הספרייה על ידי רצף תפוקה גבוהה (שלב 3.10, שולחן 3). אם רוב המשובטים שנבחרו אינם פעילים, זהו אינדיקציה ברורה של כישלון של בחירת לכידת streptavidin. השפעה דומה נצפתה במקרה של ספריות העוברות מחזורי בחירה רבים, כיוון שספריות כאלה שלטו כנראה במשתנים לא פעילים שנמלטו משלב הבחירה הstreptavidin (איור 8ב). לכן, מומלץ להריץ הקרנה אחרי כל מחזור בחירה ולפתח משתנים מבטיחים שנבחרו ידנית ולא להסתמך על איטרציה בחירה.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig1.jpg"> איור 1: בחירה בתחום החוץ של הרצף החדש המבוסס על הנדסת NlaIV. (א) הארגון של הביטוי/קלטת הבחירה (ESC) כולל שני אתרי זיהוי עבור ושהה, 1) הרצף הנבחר (GGATCC) קרוב לקצה הימני ו-2) המונה הנבחר (GGSSCC) קרוב לקצה השמאלי, כמו גם את T7p ו T7t-T7 יזם ו T7 שליחות קטלנית. אתרי הכריכה הפריימר מוצגים להלן. פצילות מסוג פראי ומשתני NlaIV נבחרים מוצגים כמשולשים אדומים וירוקים בהתאמה. (ב) צעדי מחזור בחירה: I) אמולסיה של שעתוק-תרגום-מחשוף מתערבב עם ספריית ESC; II) כל ה-DNA biotinylated נלכד על חלקיקים מגנטיים מצופה streptavidin והוסרו, ובכך הסרת קידוד לא פעיל משתנים; III) הקידוד הקצאה מראש עם פעילות מסוג פראי (כלומר, אלה המסוגלים לקליב רצף GGSSCC) מסולקים משום שהמחשוף של הרצף מפריד בין אתרי הכריכה לבין התחל הקדמי והפוך. לכן, אין הגברה של ESCs אלה מתרחשת; IV) הכניסה לסיבוב הבחירה הבא נוצרת על-ידי הוספת ביוטין בקצה הימני ומציגה מחדש את הווריאציה של רצפי המונה שנבחרו בקצה השמאלי. הודפס מתוך Czapinska ואח '8 עם אישור משאר וייה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig2.jpg"> איור 2: הכנת ESC. קטע שנגזר מהבנייה המקורית בווקטור ביטוי המכיל את NlaIV ORF תחת שליטה במקדם T7 השתנה כדי להתאים לביטוי/בחירה. האתר NlaIV במורד מתוך NlaIV ORF הוסר ואתרים ייחודיים (סאלי, EcoRI ו Eco52I) ששימשו מוטציות מיקומים נבחרים הוצגו NlaIV ORF כמוטציות שקט. המבנה הסופי היה מוגבר עם היסוד האגפים שהציג שני אתרי NlaIV מאגפים: המונה הרצף שנבחר (GGSSCc) בצד שמאל וברצף שנבחר (Ggב-cc) בצד ימין. ההילוך ההפוך הציג גם biotin. צבעי היסוד המשמשים ליצירת ECS מוטציה מוצגים כחיצים כחולים ומסומנים להלן (ראו טבלה 1B, C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig3.jpg"> איור 3: ערכת הסינתזה של פיצול וערבוב. הדוגמה מתייחסת ל-MutB פריימר סינתזה שבו רצף NNS הוצג בתדר 0.8 בארבע עמדות (ראה גם שולחן 3). שימו לב כי סינתזה כימית מבוצעת מ 3 ' כדי 5 ' אבל כל הרצפים מוצגים הקאנוני 5 ' -3 ' כיוון (כלומר, הוא ממשיך מימין לשמאל בערכה זו). רצפי סוג פראי בתנוחות מוטנטים מוצגים בירוק בעוד רצפי מוטנטים NNS הם באדום. אתר הזיהוי של סאלי, המשמש מאוחר יותר להחדיר מוטציות ב-ESCs, מסומן בקו תחתון. נקודות ערבוב ושלבים מתפצלים (2 ו-4) מצוינים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig4.jpg"> איור 4: שימוש באתרי אנזים של הגבלה ייחודית בשימוש באתרים המיועדים להגבלת הזרם. האסטרטגיה של הקדמה מוטציה מוצגת בדוגמה של בניית ספריות A-C (ראה שלבים 3.1 – 3.7). הודפס מתוך Czapinska ואח '8 עם אישור משאר וייה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig5.jpg"> איור 5: מחשוף מפני חרדה באמצעות שעתוק מחוץ למבחנה-תרגום. (א) פצילות של מצע מבחן במאגר ושהה אופטימלי: 1) מצע, 612 bp PCR המוצר עם אתר NlaIV זיהוי יחיד; 2) מוצרי הפצילות, 355 bp ו 257 bp. (ב) הפצילות ב תמלול שעתוק-תרגום התגובה (המכיל 0.5 μg של ESC): 1 – 2) 15 μl התגובה של תרגום מחוץ לתחום של תמלול ללא מצע (קו 2: תגובת בתוספת עם 1.5 MM MgCl2); 3 – 4) 15 μL של שעתוק מחוץ למבחנה-תרגום עם 1 μg של מצע הבדיקה; (קו 4: התגובה שיושלם עם 1.5 mM MgCl2). S-DNA סמן גודל (pBR322 מתעכל עם MspI). הדגימות נפתרו ב-6% מקורי הדף. הדנ א היה מוכתם. באתידיום ברומיד <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig6.jpg"> איור 6: המוצרים של ה-PCR הראשון במחזור הבחירה. ראה איור 1B, שלב III; שלב 5.10 הפרוטוקול. מערכות העמודות 1 ו-2 הן שגרות של שתי ספריות שונות הטעונות בטרילקאט. S-DNA גודל סטנדרטי (למדא DNA מתעכל עם HindIII ו EcoRI). חץ מציין את מיקומו של ESC באורך מלא (1,050 bp). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig7.jpg"> איור 7: משתני NlaIV מטוהרים להקרנה נוספת בקנה מידה מיני. ראה שלב 6.3.11. כל שורה מכילה 10 מיקרומטר μL של משתנה אחר. משקל מולקולרי S-חלבון. מסה מולקולרית של ושהה יחידת המשנה NaIV הוא 29.9 kDa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig8.jpg"> איור 8: דוגמאות להקרנה של משתני NlaIV עבור שינוי ספציפיות של רצף. ראה שלב 6.4.2. (א) הקרנה מוצלחת עם תדירות גבוהה של גרסאות מבטיחות. S = דנ א בגודל סמן, DNA למדא ביקבד עם HindIII ו EcoRI; פראי סוג (wt) = למדא DNA ביקבד עם סוג פראי NlaIV; λ = למדא DNA מצע, לא ביקע; עמודות אחרות = משתנים בעלי פעילות נמוכה מאוד. משתנים מתויגים! = גרסאות מבטיחות המייצרים דפוס מחשוף נבדל מן האנזים סוג פראי;? = משתנים שייתכן גם ששינו את העדפת הרצף. (ב) הקרנה לא מוצלחת, עם רוב המשתנים לא פעילים וגרסה אחת עם דפוס מחשוף לכאורה ללא שינה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig8large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig9.jpg"> איור 9: בחירה חלופית באמצעות הארכה. ניתן להשתמש בחלופה זו עבור כל הקצאות משוב היוצרות קצוות דביקים. כאן אנו מציגים פרוטוקול לדוגמה עבור ערכת בחירה עבור האנזים MwoI (לא פורסם). I) רצף נבחר (הממוקם בקצה הימני של ESC) עם שאריות מוגדרים המופיעים בווריאציה האדומה והנבחרת של רצף הקנצוני המוצג בכחול. בסוגריים מתחת לרצף הנבחר של המונה להיות ממוקם בקצה השמאלי של ESC מוצג; II) מוצר של מחשוף MwoI; III) לאחר סיום הביצוע בתמלול/תרגום מחוץ לרשת, המוצרים מטוהרים ומתבצעים באמצעות מתאם עודף. רק מוצרי המחשוף שהיו ביקכו ברצף הנבחר יכולים להשתתף בהארכה. לכן, משתנים לא פעילים מסולקים, והצעד הנפתח אינו נחוץ. מוצר המחשוף ברצף הנבחר של המונה (בקצה השמאלי של ESC, לא מוצג) אינו יכול להשתתף בפעולה זו מאחר שהקצה הבולט של המתאם אינו משלים את הרצף הנבחר של המונה; IV) ה-PCR הסלקטיבי משתמש באותה אסטרטגיה כמו בפרוטוקול העיקרי כדי למנוע משתנים בעלי סוג פראי של רצף מנוון (מחייב F1 הכריכה מעבר לאתר שנבחר) ואילו משתנים בלתי פעילים מסולקים על ידי פריימר הפוכה סלקטיבית שאינה יכולה לאגד את הבלתי ניתן לביטול (ולכן לא שונה על ידי מתאם במחזור הבא ניתן לחזור על-ידי שימוש במתאם הזהה למוצר המחשוף של השלב הקודם (כלומר, "קלטת הברתה" בלוח III), והיפוך בררני סלקטיבי מתאים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig9large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
שולחן 1: תחל בשימוש בהנדסה NlaIV. רצפים של אתרי ההגבלה שהוזכרו בהערות מסומנים בקו תחתון. אותיות קטנות מציינות רצפים שאין להם משלים בתבניות ה-DNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/table1.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג טבלה זו (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד).</a>
טבלה 2: תנאים של תגובות ה-PCR לשימוש בפרוטוקול. Tm = פריימר טמפרטורת ההיתוך (אם Tm שונה עבור התחל, את Tm התחתון צריך לשמש). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/table2.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג טבלה זו (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד).</a>
שולחן 3: תוצאות בדיקת איכות של שני מוטניים התחל מסונתז עם אסטרטגיה מפוצל ומיקס. בעלי מוטניים מסומנים באמצעות [XXX]. מספר אינדקס נמוך יותר מציין את מיקומו של חומצת אמינו מקודדת. הותאם מ-Czapinska ואח '8 באישור מאחר וייה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/table3.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג טבלה זו (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד).</a>
שולחן 4: תוצאות EP-PCR. הפרמטרים העיקריים נגזר ניתוח רצף של 22 שיבוטים של ECS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/table4.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג טבלה זו (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד).</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Directed Evolution of a Restriction Endonuclease with More Stringent Specificity at JoVE.com

In Vitro Directed Evolution of a Restriction Endonuclease with More Stringent Specificity

ניתן לפתח את הגבלת הגבלות עם ספציפיות רצף חדש מאנזימים המספרים על רצף מנוון באופן חלקי. כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט כי השתמשנו בהצלחה כדי לשנות את הספציפיות הרצף של האנזים NlaIV. מרכיבי המפתח של הפרוטוקול הם ממדר החוץ של התגובה שעתוק/תרגום ומבחר של משתנים עם משתני רצף חדש.

האבולוציה בבימויו של הגבלת מגבלות על הגבלה עם ספציפיות יותר מחמירות

Restriction endonuclease (REase) specificity engineering is extremely difficult. Here we describe a multistep protocol that helps to produce REase ...

הפרוטוקול שלנו מאפשר יצירת אנזימי הגבלה עם ספציפיות רצף שונה ומוחר יותר באמצעות מידור במבחנה ואסטרטגיית בחירה ייחודית באבולוציה מכוונת. באופן פוטנציאלי זה די אוניברסלי, כפי שהוא צריך להיות ישים לכל endonuclease הגבלה הבחירה יכולה להיות מופנית כלפי כל גרסה מחמירה יותר של רצף קוגנט המקורי. אם גרסאות חדשות שנוצרו מתבטאות בתרגום תמלול במבחנה, הפרוטוקול מתאים לא רק לצמצום הספציפיות, אלא גם לשינוי הספציפיות.כדי להחליט על אתרים עבור mutagenesis תת-קטגוריה, בחר תדרי mutagenesis על פי החשיבות ההיפותטית של האתרים, תוך שמירה על מגבלות על מורכבות הספרייה הכוללת בחשבון. כדי להתחיל את הסינתזה, הוסף עמודות שנארזו עם שף חדש לתוך הסינתיסייזר. לסנתז אוליגונוקלאוטידים בכל העמודים עד לשלישייה, מיד לפני האתר השני של מוטגנציה תת-אזורית סופר מקצה שלושת הפריים.לסנתז, עוזב קבוצת trityl חמישה ראשונים בסוף. קבוצת ההגנה תוסר בתחילת מחזור הסינתזה הבא. פתח את עמודי הסינתזה וצנטריפוגה לזמן קצר לתוך צינורות יבשים 1.5 מיליליטר כדי לאסוף את הרף.משוך את התמיכה בסינתזה CPG וערבב על ידי מערבולת. חלק מחדש את שף CPG המעורב לעמודות סינתזה חדשות. הימנע החדרת לחות כי זה יקטין את התשואה הכוללת.המשך את הסינתזה, החל משלישיית אתר המוטגנס של תת-האתר. הקצה עמודות לשלישיות NNS אקראיות או לשלישייה מסוג פראי בהתאם לתדר המוטגנסיס הרצוי. אם קיימים אתרי תת-אזור נוספים, המשך רק לשלישייה שלפני אתר mutagenesis תת-אזור הבא.אם לא קיימים יותר אתרי תת-אזור במורד הזרם, השלם את הסינתזה, והשאיר קבוצת trityl של חמישה ראשונים בסוף. השתמש טיפים פיפטה נשא רחב להכין תערובת פעילי שטח שמן על ידי הוספת 225 microliters של Span 80 ו 25 microliters של Tween 80 כדי חמישה מיליליטר של שמן מינרלי בצינור חרוט 15 מיליליטר. מערבבים היטב על ידי היפוך עדין 15 פעמים.התערובת בשלב זה צריכה להיות שקופה. עבור כל ספרייה, להעביר 950 microliters של תערובת פעילי שטח שמן לבקבוקון קריוגני עגול שני מיליליטר תחתון. תווית עם שם ספרייה והעברה לקרח.שים בר ערבוב גלילי אחד קטן לתוך כל בקבוקון. הכן תערובת תגובת תמלול-תרגום במבחנה בהתאם להצעות היצרן. משלימים את התערובת עם מגנזיום כלורי לריכוז סופי של 1.5 מילימולר.לוותר על 50 aliquots microliter של תערובת התגובה לתוך 1.5 צינורות מיליליטר על קרח. מוסיפים 1.7 femtomoles של הספרייה לתערובת התגובה על הקרח. הכינו אמולסיה של מים בשמן ברציפות לכל ספרייה על ידי הנחת תחילה מקור קטן מלא בקרח על ערבוב מגנטי עם המהירות המרגשת שנקבעה ל-1150 סל"ד.לאחר מכן להעביר בקבוקון קריוגני עם 950 microliters של תערובת פעילי שמן ובר ערבוב קטן לתוך מקור קר כקרח על המערבב המגנטי. תבדקו שהבר המרגש מסתובב. הוסיפו חמישה אליקוטים של 10 מיקרוליטר של תערובת התרגום לתעתיק בספרייה במבחנה במשך שתי דקות במרווחים של 30 שניות והמשיכו לבחוש במשך דקה נוספת.מעבירים את הבקבוקון עם ההמולסה למיכל קרח. בשלב זה, הנוזל צריך להיות אטום, לא שקוף. לאחר מכן, המשך בספריה הבאה.לאחר שכל הספריות מעובדות, התחל את הדגירה של כל הספריות על פי המלצות יצרן הערכה. מעבירים את הבקבוקונים לטמפרטורה אופטימלית עבור אנדונוקלאז מהונדס במשך שעתיים נוספות לפני הנחת אותם על קרח לפחות 10 דקות. מעבירים את האמולסיות מהבקבוקונים הקריוגניים לצינורות 1.5 מיליליטר.הוסף מיקרוליטר אחד של EDTA 5 טוחן. וצנטריפוגה אותם ב 13, 000 פעמים g במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. אם לאחר צנטריפוגה אתה לא יכול לראות את ממשק שמן מים בבירור, להקפיא את התערובת לפני השאיפה של שלב השמן העליון.להזיז את שלב השמן העליון עם פיפטה ולהשליך. מיד לבצע מיצוי על ידי הוספת 150 microliters של פנול כלורופורם ו 100 microliters של 10 מילימולרים טריס-HCl לשלב הממימי. מערבולת ולאחר מכן לבצע הפרדת פאזה באמצעות צנטריפוגה של 30 שניות ב 13, 000 פעמים גרם.לאסוף את השלב הממימי העליון. לזרז את ה-DNA על ידי הוספת 15 microliters של אצטט נתרן שלוש טוחנות, 2.5 עד 5 מיקרוגרם של גליקוגן, ו 375 microliters של אתנול. לאחר דגירה הדגימות במינוס 20 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת, צנטריפוגה במשך 15 דקות ב 13, 000 פעמים g, ארבע מעלות צלזיוס.השליכו את העל-טבעי ושטפו בקצרה את גלולה עם מיליליטר אחד של קר 70%אתנול. יבש את גלולת הגליקוגן DNA בvac מהירות או מייבש אוויר במשך יותר מחמש דקות. ואז להמיס את גלולה ב 50 microliters של 10 מילימולר טריס-HCl.לאחר מכן, להוסיף חמישה microliters של חרוזים מגנטיים סטרפטבידין, מוכן על פי הוראות היצרן. מערבבים במשך שעה בטמפרטורת החדר, רצוי במיקסר קרוסלה או על ידי מערבולת עדינה. מעבירים את הצינורות לעמוד מגנטי כדי להפריד את חרוזים.ואז לאסוף את הנוזל מועשר DNA ללא ביוטין. פרוטוקול זה הוא כלי להגדלת התדירות של גרסאות רצויות של אנדונוקלאזות הגבלה מהונדסות על ידי דלדול אנזימים לא פעילים אנדונוקלאזות עם ספציפיות רצף מסוג בר ללא שינוי. הקרנה מוצלחת יכולה לזהות עד 20% מהגרסאות המבטיחות.גרסאות מסומנות כגרסאות מבטיחות אם הן מייצרות תבנית מחשוף הנבדלת מהאנזים הפראי. משתנים שעשויים לשנות את העדפת הרצף מסומנים גם הם בתווית. מוצג כאן הוא הקרנה לא מוצלחת עם רוב השונות לא פעיל גרסה אחת עם דפוס מחשוף ללא הפרעה לכאורה.במקרה זה, הספריות נשלטות ככל הנראה על ידי גרסאות לא פעילות שנמלטו מצעד הבחירה של לכידת סטרפטבידין. זה קריטי לעצב בקפידה את הרצפים שנבחרו נגד נבחר ולהגביל את גיוון הספרייה על ידי אסטרטגיית mutagenesis המייצרת תחליפים רק כמה עמדות נבחרות. הגרסאות הטובות ביותר שנבחרו צריכות להיות מאופיינות ביסודיות לקינטיקה מחייבת ומחשוף על רצפים מועדפים ולא מחשוף המבוססים על התוצאות מההקרנה הראשונית.במקרה הבדיקה שלנו, אתרי mutagenesis נבחרו על בסיס מודל הומולוגיה. באופן מפתיע, מבנה גבישי הראה מאוחר יותר כי כמה שאריות שהשתנו ככל הנראה אינן במגע ישיר עם DNA.

Research

JoVE Journal

Genetics

Design and Use of a Low Cost, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution of Bacteria Under Antibiotic Drug Selection

עיצוב ושימוש בעלות נמוכה, אוטומטי Morbidostat עבור Adaptive אבולוציה מהירה של חיידקים תחת אנטיביוטי והתרופות בחירה

We describe a low cost, configurable morbidostat for characterizing the evolutionary pathway of antibiotic resistance. The morbidostat is a bacterial ...

Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat

נוהל מסתגל מעבדת האבולוציה של מיקרואורגניזמים שימוש Chemostat

Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) ...

Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development

הגנום עריכה בימוי בידול של hPSCs עבור חקירת גורמים המשפיעים Lineage בהתפתחות האנושית הלבלב

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding ...

Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans

Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans

כימות של מידע מקודד על ידי גנים ביטוי רמות במהלך תוחלת החיים אפנון תחת הגבלת תזונה מגוון רחב C . elegans

Sensory systems allow animals to detect, process, and respond to their environment. Food abundance is an environmental cue that has profound effects on ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

מהדור ג'ין-שיבשו סטרפטוקוקוס mutans זן בלי ג'ין שיבוט

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Testing the Role of Multicopy Plasmids in the Evolution of Antibiotic Resistance

בוחן את התפקיד של פלסמידים Multicopy באבולוציה של עמידות לאנטיביוטיקה

Multicopy plasmids are extremely abundant in prokaryotes but their role in bacterial evolution remains poorly understood. We recently showed that the ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

מעקב ברמת הגנום של שגיאות תיעתוק היצורים האיקריוטים

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

הפקת ג'ין מחיקות ב- Escherichia coli מאת P1 התמרה חושית עם קלטות עמידות לאנטיביוטיקה ניתן לניתוח

A first approach to study the function of an unknown gene in bacteria is to create a knock-out of this gene. Here, we describe a robust and fast protocol ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

שימוש בחוץ גופית וצורה בתא לחקור מולקולה קטנה המושרה שינויים מבניים Pre-mRNA

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Using Sniper-Cas9 to Minimize Off-target Effects of CRISPR-Cas9 Without the Loss of On-target Activity Via Directed Evolution

באמצעות צלף-Cas9 כדי למזער את ההשפעות את המטרה של CRISPR-Cas9 ללא אובדן פעילות--היעד באמצעות אבולוציה מכוונת

The development of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated protein 9 (Cas9) into therapeutic modalities requires the ...