Name: in vitro directed evolution of a restriction endonuclease with more stringent specificity
Uploaded: 2020-03-25T15:00:00
Duration: 9 min 16 s
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この研究は、ポーランド国立科学センター(NCN)(UMO-2011/02/A/NZ1/00052)から、科学高等教育省(0295/B/PO1/2008/34~MB、N301 100 31/3043からKS)からの助成金によって支えられ、 UMO-2014/13/B/NZ1/03991およびUMO-2014/14/M/NZ5/00558からMB)およびKSへの短期EMBOフェローシップ(ATSF 277.00-05)。

<ol>
	<li>Sch&#246;ttler, S., Wenz, C., Lanio, T., Jeltsch, A., Pingoud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+engineering+of+the+restriction+endonuclease+EcoRV--structure-guided+design+of+enzyme+variants+that+recognize+the+base+pairs+flanking+the+recognition+site.">Protein engineering of the restriction endonuclease EcoRV--structure-guided design of enzyme variants that recognize the base pairs flanking the recognition site.</a> European Journal of Biochemistry. 258 (1), 184-191 (1998).</li><li>Wenz, C., Hahn, M., Pingoud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+variants+of+the+restriction+endonuclease+EcoRV+that+depend+in+their+cleavage+activity+on+the+flexibility+of+sequences+flanking+the+recognition+site.">Engineering of variants of the restriction endonuclease EcoRV that depend in their cleavage activity on the flexibility of sequences flanking the recognition site.</a> Biochemistry. 37 (8), 2234-2242 (1998).</li><li>Samuelson, J. C., Xu, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+restriction+endonuclease+BstYI+to+achieve+increased+substrate+specificity.">Directed evolution of restriction endonuclease BstYI to achieve increased substrate specificity.</a> Journal of Molecular Biology. 319 (3), 673-683 (2002).</li><li>Samuelson, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+a+rare-cutting+restriction+enzyme:+genetic+screening+and+selection+of+NotI+variants.">Engineering a rare-cutting restriction enzyme: genetic screening and selection of NotI variants.</a> Nucleic Acids Research. 34 (3), 796-805 (2006).</li><li>Rimseliene, R., Maneliene, Z., Lubys, A., Janulaitis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+restriction+endonucleases:+using+methylation+activity+of+the+bifunctional+endonuclease+Eco57I+to+select+the+mutant+with+a+novel+sequence+specificity.">Engineering of restriction endonucleases: using methylation activity of the bifunctional endonuclease Eco57I to select the mutant with a novel sequence specificity.</a> Journal of Molecular Biology. 327 (2), 383-391 (2003).</li><li>Morgan, R. D., Luyten, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+engineering+of+type+II+restriction+endonuclease+DNA+binding+and+cleavage+specificity.">Rational engineering of type II restriction endonuclease DNA binding and cleavage specificity.</a> Nucleic Acids Research. 37 (15), 5222-5233 (2009).</li><li>Skowronek, K., Boniecki, M. J., Kluge, B., Bujnicki, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+engineering+of+sequence+specificity+in+R.MwoI+restriction+endonuclease.">Rational engineering of sequence specificity in R.MwoI restriction endonuclease.</a> Nucleic Acids Research. 40 (17), 8579-8592 (2012).</li><li>Czapinska, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+Structure+and+Directed+Evolution+of+Specificity+of+NlaIV+Restriction+Endonuclease.">Crystal Structure and Directed Evolution of Specificity of NlaIV Restriction Endonuclease.</a> Journal of Molecular Biology. 431 (11), 2082-2094 (2019).</li><li>Miller, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+by+in+vitro+compartmentalization.">Directed evolution by in vitro compartmentalization.</a> Nature Methods. 3 (7), 561-570 (2006).</li><li>Zheng, Y., Roberts, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+restriction+endonucleases+using+artificial+cells.">Selection of restriction endonucleases using artificial cells.</a> Nucleic Acids Research. 35 (11), e83 (2007).</li><li>Takeuchi, R., Choi, M., Stoddard, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redesign+of+extensive+protein-DNA+interfaces+of+meganucleases+using+iterative+cycles+of+in+vitro+compartmentalization.">Redesign of extensive protein-DNA interfaces of meganucleases using iterative cycles of in vitro compartmentalization.</a> Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 111 (11), 4061-4066 (2014).</li><li>Howland, J. L., Ausubel, F., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Short Protocols in Molecular Biology. , (1995).</li><li>Wilson, D. S., Keefe, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+8+Unit+8.3:+Random+mutagenesis+by+PCR.">Chapter 8 Unit 8.3: Random mutagenesis by PCR.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (2001).</li></ol>

著者らは開示するものは何もない。

ここで説明した選択プロトコルは、NN基地の中央を有するパリンドローム標的部位を認識し、NN基地間の鈍い端部切り線を触媒する二量体PD-(D/E)XK折り返し認識シーケンスであるNlaIV8について試験された。Nn塩基間の切断は、これらの塩基が複合体中のタンパク質に近いということを示唆しているので、NlaIVが選ばれた。原則として、このプロトコルは、触媒ドメインと特異性ドメインが一致するか(例えば、FokI)であるかにかかわらず、任意の折りたたみグループの任意のシーケンス固有の制限エンドヌクレアーゼ、単量体または二量体に使用することができる。さらに、原則としてこのプロトコルは、新しい、より狭い酵素特異性の生成に有用であるだけでなく、星の活性を排除したり、高忠実度のエンドヌクレアーゼを作成するためにも使用することができる。しかし、このすべてはまだテストされていません。特に、同じアミノ酸残基が所望および望ましくない塩基への結合に関与する可能性があるため、スター活性の標的排除は複雑であり得る。このプロトコルで説明されているin vitroステップは、限定的に絞られた特異性の選択に限定されるものではなく、それ以外の変更された特異性を選択するためにも使用することができる。しかし、その後、変異型エンドヌクレアーゼに問題がある:基質のスペクトルが親エンドヌクレアーゼによって切断されない新しい標的を含む場合、一般的には、この活性の有害な影響から細胞を保護する良い方法はない。対照的に、エンドヌクレアーゼ特異性が絞り込まれるだけなら、標的は野生型の標的のサブセットであり、したがって既に利用可能な結合メチルトランスフェーゼは完全に保護されるべきである。
私たちのプロトコルは、多くの指向進化プロトコルとは異なります。オープンリーディングフレームの多様性は、実験の開始時に一度生成され、すべての反復処理では生成されません。さらに、EP-PCRではなく、スプリットアンドミックス合成によって作成されます。コドンのNNS置換については、本研究で用いられているように、6つの位置に対して(4 x 4 x 2)6~1.07 x 109の組み合わせがある。したがって、任意のバリアントは、ESCの1.7 fmolesに一度平均で存在します。この容量は、グレンリサーチが提供する20のトリヌクレオチド前駆体の混合物との合成を使用するか、またはスプリットアンドミックスオリゴヌクレオチド合成であまり有望な位置で突然変異頻度を減少させることによって、7つの位置に増加させることができます。可能であれば、変動の範囲を6桁に制限することをお勧めします。明らかに、このような変異誘発標的化は、基質結合に関与する少なくともREaseの領域に関するいくつかの既存の知識を必要とする。多様性を生成するスプリットアンドミックスプロトコルは、EP-PCRと比較して明らかな利点を有します。EP-PCRを用いて、同じEP-PCRでNlaIV ESCに対して8個の置換を行う不変の変異体と配列を得た(表4)。EP-PCRのライブラリには、避けるべきクローンのかなりの部分(野生のタイプ配列、複数の置換、フレームシフトとナンセンス突然変異、および配列特異性に影響を与える可能性が低い場所での突然変異)が含まれています。
また、我々のプロトコルは、2つの逐次選択ステップの存在によって、他の多くの指向進化プロトコルとは異なる。正の選択は、望ましい活性が保持されていることを確認し、そうでなければビオチンタグは除去されず、コード配列はプルダウンによって除去することができる。技術的には、新しい、重複しない特異性(GCATGCなど)の偶然の出現は、適切な切断部位が所望の切断の近くに存在するが、他の場所に存在しない場合、ビオチンタグの切断につながる可能性がある。しかし、これは可能性が非常に低いはずです。負の選択は、まだ望ましくない活性を持つ酵素をコードするオープンリーディングフレームを削除します。この手順は、選択シーケンスを切断できるが、ESCの他の場所で切断することができないバリアントを使用して出力ライブラリを強化するため、厳密には必須ではありません。しかし、元の配列特異性を持つ酵素は出力から除去されず、特異性が変化する有望な変異体より、酵素活性も低下するため、選択効果は低くなると予想されます。母集団レベルでは、望ましいターゲットシーケンスと望ましくないターゲットシーケンスの両方が退化する必要はない点に注意してください。NlaIVの例では、アンチターゲットは退化し、ターゲットは非退化した。人口レベルで縮退がある場合でも、単一の液滴では1つの(非退化)標的または抗標的のみが存在する。私たちのプロトコルでは、ターゲットとアンチターゲットシーケンスは、選択ステップの繰り返しごとに再導入されます。したがって、オープンリーディングフレームは、複数の選択ラウンドを生き残るために、可能なすべてのターゲットを切断し、抗標的のいずれを切断することができない酵素をコードする必要があります。プロトコルの各反復で、選択解除対象を再導入する必要がある場合は、2 つのシーケンシャルな PCR が適用されます。最初のPCRは、抗標的の外側にアニールするプライマーを使用し、抗標的の切断がPCR反応を防止するようにする。2 番目の PCR では、アンチ ターゲットを超えて到達するプライマーを必要とし、アンチ ターゲットを再導入し、複数の選択ラウンド中に、各オープンリーディング フレームがアンチ ターゲットのすべてのバリアントに対してテストされることを確認します。
粘着末端を生成する酵素の場合、REase ORF10の分離のための前述の方法に基づく関連代替プロトコルを使用することができる。我々の実験で使用されるビオチン捕捉による不活性変異体の枯渇は、選択的PCRにおいてプライマー結合部位として使用される配列を有する適合アダプタのライゲーションによって代替プロトコルに置き換えられる(図9)。選択した特異性を有する酵素を産生するESCのみがライゲーション可能な末端を生成し、選択されます。カウンターの末端の付着の配列は、アダプタとの結紮に関与できないように設計されなければならない。選択プロセスの反復は、2つの異なるアダプタと結果として選択的PCRにおける2つの異なるリバースプライマーを切り替えることによって容易に達成することができる。
新しいプロトコルがあっても、インビトロでの新しい特異性のエンジニアリングのタスクはまだ非常に困難です。典型的なII型のリーズでは、配列特異性および内核分解活性は同じタンパク質領域に依存する。したがって、他方に影響を与えずに1つを変更することは困難です。成功は、酵素のフットプリントを考慮に入れ、タンパク質とDNA相互作用の対称性を尊重し、NlaIV例8で行われたように、生化学的実験で事前に決定されるべき既存の酵素好みに基づいて構築される戦略によってより可能性が高い。

シーケンス特異性工学はクラスIIの安楽のための非常に挑戦的である。エンドヌクレアーゼのこのクラスでは、配列認識と触媒は密接に絡み合っており、おそらく宿主DNAに損傷を与える同卵性メチルトランスレセファーゼよりも広い特異性のエンドヌクレアーゼの作成に対する進化的保護手段として、細胞内の新しい特異性の指向進化は、新たに設計されたエンドヌクレアーゼ活性に対して宿主DNAを保護する必要性によってさらに複雑化する。したがって、報告されたREaseエンジニアリングの成功した試みはほんの少しあり、それらのすべては、特定の酵素11、2、3、4、5、6、72,3,4,5,6,7のユニークな機能を利用しています。
ここでは、NlaIVエンドヌクレアーゼ8の成功したエンジニアリングに基づく親酵素よりも狭い特異性を有するエンドヌクレアーゼ変異体を生成するために使用できる特異性工学のための詳細なプロトコルを提供する。任意の認識配列を有する任意の酵素に対して、側面の塩基に対して余分な特異性を導入することができる。部分的に縮退配列を認識する親酵素(GGNNCC標的を有するNlaIVなど)に対して、認識配列内に追加の特異性を導入することもできる。余分な特異性はタンパク質とDNAの接触を必要とする可能性が高いので、新たに認識された塩基はDNA上の親エンドヌクレアーゼの足跡内にあるべきである。原則として、選択スキームは、認識順序の任意の所望の特殊化のために設定することができます。しかし、パリンドロームおよびほぼパリンドロミック標的配列を認識するほとんどのREasesは、パリンドロームの半分の部位のみを認識する機能的なダイマーである。したがって、タンパク質核相互作用の対称性に違反する新しい特異性の選択は機能しそうにない。例えば、ダイマーNlaIVの場合、GGNNCC配列は理論的にはGGATCCに絞り込むことができますが、GGAACCに対する特異性の絞り込みはより困難であると予想されます。私たちのスキームは、正と負の両方の選択を伴います。
このプロセスは、ネガティブ選択が好ましい狭い特異性以外のすべての配列を切断することができる特異性を除去するためにも使用される場合に、より効率的である。例えば、GGATCC の選択は GGBVCC に対する選択の反対と組み合わせることができる (B は A 以外のベース、V は T 以外の任意のベース)。可能なターゲットシーケンスの一部がカバーされない場合、選択実験の結果は、正と負の選択の有効性に依存します。NlaIVの研究では、GGATCCに選択し、GGSSCC(SはGまたはCである)に対して選択し、対称破断ターゲットを無視してGGWWCC(WはAまたはT)と表現できる特異性を得たが、この特定のケースでは否定的な選択がより多かることを示唆している。肯定的な選択よりも重要です。
このアプローチは、式選択カセット (ESC) の作成から始まります。ESC はセクションで構成されています。内部コアセクションには、T7プロモーター制御下で、REaseのオープンリーディングフレーム(ORF)の変種があります。ESC のこのコアセクションには、設計された REase の同一のサイトを含めることはできません。コアは、野生型のREaseの2つの同卵部位の間に挟まれる:望ましくない活動のための切断部位(この例では選択された配列、GGSSCC)および所望の活動のための切断部位(選択された配列、GGATCC例)。PCRでESCを調製する最終ステップは、5'の終わりに所望の活性に近いビオチンを追加し、様々なカウンター選択配列(例ではGGSSCC)を作成します。選択戦略は、in vitro転写/翻訳/選択プロトコルの後にESC再増幅プロトコルで慎重に設計されたプライマーを使用することによるものである(図1A)。ESCライブラリは、インビトロ区画化転写変換水油エマルジョン99、10、1110,11で表現されています。各液滴内では、発現酵素の特異性はESCの状態に影響を及ぼす(図1B、ステップI)。記載された配列については、翻訳されたタンパク質の所望の切断活性は、DNAのビオチンタグを除去するが、カウンター選択配列を有する他のESC末端には影響を及ぼさない。エマルジョンが壊れると、ビオチン化フラグメントはストレプトアビジンアフィニティープルダウンによって除去され、所望の活性を有する液滴からの断片のみが残るようにする(図1B、ステップII)。この手順では、非アクティブな REase バリアントを削除します。プルダウンステップの上清分は、次いでPCRによって増幅されます。第1のPCR反応プライマーF2およびR1には、(図1A,B,ステップIII)が用いられる。プライマーF2は、選択されたカウンター配列と分子末端との間のESCセクションに結合する。したがって、選択されたカウンター配列を切断することができる変異体を発現するESC(したがって、プライマーF2とR1の結合部位を2つの異なるDNA分子に分離する)は増幅されず、したがってライブラリから除去される。プライマーR1は、選択された部位とESCのコアとの間に結合して、選択された部位の切断状態の影響を受けないようにし、所望の活性(GGATCC)の切断部位を復元する。サイクルは、選択した部位に近い5'末端にビオチンを追加し、ESCの反対側の端に近いカウンター選択部位で設計されたバリエーションを復元する第2のPCR(プライマーF1およびR2付き)によって閉じられる(図1B、ステップIV)。得られたDNA混合物は、別の選択ラウンドの準備ができています。
選択プロトコルの成功は、新しい、より厳格な標的認識シーケンスの適切な選択と変異生成戦略とその効果的な実装の慎重な設計に強く依存します。REaseのわずかな既存の好みを克服するよりも、はるかに簡単に改善できるため、既存の好みの運動学的研究から始めることをお勧めします。慎重な変異生成設計の必要性は、提示されたプロトコル(1回の実験で109クローン)で処理することができる変異型ライブラリの限られたサイズから生じる。したがって、20個のアミノ酸置換の可能性は、わずか数箇所で有効にテストすることができます(議論参照)。代わりの方法として提示されるエラーを起こしやすいPCR(EP-PCR)のようなランダムな変異誘発は、既存の複雑さの深いアンダーサンプリングにつながる。DNAとの接触に関与する潜在的なアミノ酸位置に関する情報(または同離配列中の縮退ヌクレオチドに近接している場合)が利用可能である場合、オリゴヌクレオチド誘導飽和変異体に対していくつかのアミノ酸を選択するために使用されるべきである(プロトコルステップ1.6-3.10)。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1000&#197; CPG Support (dA, dT, dC, dG)</td>
			<td>Biosset</td>
			<td>45-1000-050</td>
			<td>Other vendors can be used as well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ASM-800 DNA/RNA</td>
			<td>Biosset</td>
			<td>800-001-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJET Gel Extraction Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K0691</td>
			<td>Any other kit can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glen-Pak DNA purification cartridge</td>
			<td>Glen Research</td>
			<td>60-5200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIS-Select Nickel Affinity Gel</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET 28a vector</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any other vector with T7 promoter upstream of plycloning site can be used instead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td>Any other high fidelity and highly processive thermophilic polymearse can be used instead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porous steel foil</td>
			<td>Biosset</td>
			<td>40-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid Translation System 
			RTS 100, E.coli HY Kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3 186 148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction endonucleases</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Obviously other vendors, enzymes can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Magnetic Beads</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>S1420S</td>
			<td>Other vendors can be used as well. We have positively tested beds form Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthesis chemicals including phosphoramidities</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td></td>
			<td>Other vendors can be used as well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthesis columns (different sizes)</td>
			<td>Biosset</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EL0011</td>
			<td>Any other ligase can be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro directed evolution of a restriction endonuclease with more stringent specificity

制限エンドヌクレアーゼ(REase)特異度工学は極めて困難である。ここでは、親酵素よりも厳密な特異性を持つ REase バリアントを生成するのに役立つマルチステップ プロトコルについて説明します。このプロトコルでは、DNA結合に影響を及ぼす可能性のある位置の変動性を持つ、REaseのバリアントに対する発現選択カセット(ESC)のライブラリの作成が必要です。ESCは、所望の制限部位活性とビオチンタグの配列によって一方の側に並び、他方では望ましくない活性およびプライマーアニーリング部位に対する制限部位によって横たわっている。ESCは、液滴当たり複数のDNA分子が存在する可能性が低い条件で、油中水エマルジョンで転写および翻訳されます。したがって、各カセット分子中のDNAは、翻訳された、コードされた酵素の活性のみに供される。所望の特異性のREase変異体は、ビオチンタグを除去するが、プライマーアニール部位を除去しない。エマルジョンを破壊した後、DNA分子はビオチンプルダウンを受け、上清内のものだけが保持されます。このステップでは、目的のアクティビティを失っていないバリアントの ESC のみが保持されます。これらのDNA分子は、次いで、最初のPCR反応を受ける。望ましくない配列の切断は、プライマーの1つに対するプライマー結合部位を遮断する。したがって、PCRは望ましくない活性を持たない液滴からのESCのみを増幅する。次いで、第2のPCR反応を行い、所望の特異性およびビオチンタグに対する制限部位を再導入し、選択ステップを繰り返すことができるようにする。選択されたオープンリーディングフレームは、新たに進化したREaseがメチルトランスレーゼ標的部位のサブセットのみを標的とするため、親のREaseの同結合メチルトランスフェラーゼを発現する細菌細胞で過剰発現することができる。

このプロトコルは、不活性酵素と不変の野生型配列特異性を持つエンドヌクレアーゼの2つの不要なクラスを枯渇させることによって、設計されたREaseの望ましい変異体の頻度を増加させるだけのツールです。一方、REase特異性の変化は極めて困難であるため、24クローンの単一スクリーニングにおいて野生型酵素とは異なる切断パターンを産生するそのような変異体を1つでも見つけることは成功と考えるべきである。私たちの手の中で最高の画面は有望な変種の最大20%を識別することができた(図8A)。
肯定的な結果は、ライブラリの品質(すなわち、置換の頻度とランダム分布の制限)と図書館メンバーのビオチン化された集団の効率的な捕獲(ステップ3.6-3.7)に強く依存する。両方の問題を検出できます。ライブラリの品質は、可能な限り多くのクローンをシーケンシング(>15)、または高スループットのシーケンス処理によるライブラリの直接シーケンスによって、選択前にチェックする必要があります(ステップ3.10、表3)。選択したクローンの大部分がアクティブでない場合、これはストレプトアビジンのキャプチャ選択の失敗を明確に示す。多くの選択サイクルを経るライブラリの場合も同様の効果が見られるが、そのようなライブラリはストレプトアビジン捕獲選択ステップを逃れた非アクティブな変異体によっておそらく支配されている可能性が高いからである(図8B)。したがって、選択サイクルのたびにスクリーニングを実行し、選択反復に依存するのではなく、手動で選択した有望なバリアントをさらに開発することをお勧めします。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig1.jpg"> 図1:NlaIV工学に基づく新しい配列特異性のインビトロ選択。(A)式/選択カセット(ESC)の組織には、REaseの2つの認識部位、1)選択したシーケンス(GGATCC)が右端に近い、2)左側に近いカウンター選択シーケンス(GGSSCC)、T7pおよびT7t-T7プロモーターおよびT7ターミネーターが含まれる。プライマー結合部位を以下に示す。野生型および選択されたNlaIV変異体による切断は、それぞれ赤と緑の三角形として示される。(B) 選択サイクルステップ: I) ESCライブラリと転写翻訳-切断反応の乳化が混入する;II)すべてのビオチン化されたDNAは、ストレプトアビジンでコーティングされた磁性粒子上で捕捉され、除去され、非活性変異体のコードを除去する。III)ESCは野生型活性を有するREases(すなわち、GGSSCC配列を切断することができるもの)は、配列の切断が前方および逆プライマーの結合部位を分離するので排除される。したがって、これらのESCの増幅は起こりません。IV) 次の選択ラウンドの入力は、右端にビオチンを添加し、左端に選択されたカウンターシーケンスのバリエーションを再導入することによって作成されます。ツァピンスカら8世からエルゼビアの許可を得て転載。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig1large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig2.jpg"> 図2:ESCの準備T7プロモーターの制御下でNlaIV ORFを含む発現ベクター中の元の構築物から導出された断片は、発現/選択に適するように改変した。NlaIV ORFから下流のNlaIVサイトが削除され、選択した位置を変異させるために使用されたユニークなサイト(SalI、EcoRIおよびEco52I)がサイレント突然変異としてNlaIV ORFに導入されました。最終的な構造は、2つの側面NlaIVサイトを導入した横向きプライマーで増幅された:左側に選択された配列(GGSSCC)と右側の選択されたシーケンス(GGATCC)のカウンター。逆プライマーはまた、ビオチンを導入しました。変異ECSの作成に使用されるプライマーは、青色の矢印で示され、下にラベルが付いています(表1B,Cを参照)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig3.jpg"> 図3:分割と混合合成のスキーム。この例は、4つの位置で0.8周波数でNNSシーケンスが導入されたMutBプライマー合成を指します(表3も参照)。化学合成は3'から5'まで行われるが、全ての配列は正規5'-3'の向きで示されている(すなわち、このスキームでは右から左へ進む)。変異原性の位置における野生型配列は緑色で示され、NNS変異原性配列は赤色である。後にESCに変異を導入するために使用されるSalI認識部位には下線が引かれている。混合および分割ステップのポイント(2および4)が示されている。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig3large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig4.jpg"> 図4:オリゴヌクレオチド標的突然変異誘発における独特の制限酵素部位の使用。変異導入の戦略は、ライブラリA-Cの構築例に示されています(ステップ3.1~3.7を参照)。ツァピンスカら8世からエルゼビアの許可を得て転載。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig4large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig5.jpg"> 図5:インビトロ転写翻訳における内核分解性切断。(A)最適な REase バッファーにおけるテスト基質の切断: 1) 基質、単一の NlaIV 認識部位を持つ 612 bp PCR 産物;2) 切断生成物, 355 bp および 257 bp. (B) in vitro転写変換反応における切断 (ESCの0.5 μgを含む): 1-2) 15 μL のインビトロ転写翻訳のアリコート(ライン2:1.5 mM MgCl2を補った)3–4) 1μGの試験基板を用いたインビトロ転写翻訳の15 μLアリコート;(ライン 4: 1.5 mM MgCl2を補った反応。S-DNAサイズマーカー(mspIで消化されたpBR322)。サンプルは6%ネイティブPAGEで解決されました。DNAを臭化エチジウムで染色した。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig5large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig6.jpg"> 図6:選択サイクルにおける最初のPCRの製品。図 1B、ステップ III を参照してください。プロトコルステップ5.10。列セット 1 と 2 は、三重にロードされた 2 つの異なるライブラリのアリコートです。S-DNAサイズ標準(ヒンドIIIおよびエコリオンで消化されたラムダDNA)。矢印は、全長 ESC (1,050 bp) の位置を示します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig6large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig7.jpg"> 図7:ミニスケールでさらなるスクリーニングのために精製されたNlaIV変異体。ステップ 6.3.11 を参照してください。各行には、異なるバリアントの 10 μL アリコートが含まれています。Sタンパク質分子量標準。NaIV REaseサブユニットの分子質量は29.9 kDaである。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig7large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig8.jpg"> 図8:配列特異性変化のためのNlaIVバリアントのスクリーニング例ステップ 6.4.2 を参照してください。(A) 有望な変異体の高頻度でのスクリーニングに成功した。S = DNA サイズ マーカー、ヒンダ III とエコRI と切断されたラムダ DNA;野生型 (wt) = ラムダ DNA は野生型 NlaIV で切断;λ=λDNA基質、切断されない;その他の列=非常に低いアクティビティを持つバリアント。バリアントにはラベルが付いています!=野生型酵素とは異なる切断パターンを生成する有望な変異体; ?= シーケンスの優先順位も変更された可能性があるバリアント。(B) 不活性の変異体の大部分と明らかに変化しない切断パターンを持つ 1 つのバリアントを伴う、スクリーニングに失敗した。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig8large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig9.jpg"> 図9:ライゲーションによる代替選択。この代替は、スティッキーエンドを生成するすべてのREaseに使用できます。ここでは、MwoI酵素(未発表)の選択スキームのプロトコルの例を紹介します。I)選択された配列(ESCの右端に位置)で、定義された残基が赤で示され、青色で示された同結合配列のバリエーションが選択された。ESC の左端に配置するカウンタ選択シーケンスの下のかっこ内に表示されます。II) MwoI切断の産物;III) インビトロ転写/翻訳を終了した後、製品を精製し、過剰なアダプターでライゲーションを行います。選択された配列で切断された切断産物のみがライゲーションに関与することができる。したがって、非アクティブなバリアントは削除され、プルダウンステップは不要です。カウンター選択されたシーケンスの切断物 (ESC の左端に、図示せず) は、アダプタの突出先端が選択されたカウンターシーケンスと相補的ではないため、このライゲーションに参加できません。IV) 選択的 PCR は、メイン プロトコルと同じ戦略を使用して、野生型の退化配列特異性 (F1 プライマー結合遠位から選択された部位に遠位) を持つ変異体を除去するのに対し、非活性変異体は、非切断(したがって、アダプタ結紮によって修飾されない)に結合できない選択的リバースプライマーによって排除される。次のサイクルでは、前工程の切断産物と同一のアダプター(すなわち、パネルIIIの「切断カセット」)と、適切な選択的リバースプライマーを用いてプロセスを反復処理することができる。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig9large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
表1 NlaIVエンジニアリングで使用されるプライマーコメントに記載されている制限サイトのシーケンスには下線が付いています。小さな文字は、DNAテンプレートに補数を持たない配列を示します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/table1.xlsx" target="_blank">こちらの表を表示するには、ここをクリックしてください (右クリックしてダウンロードしてください)。</a>
表2:プロトコルに使用するPCR反応の条件。Tm = プライマー融解温度(プライマーに対して Tmが異なる場合は、低い Tmを使用する必要があります)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/table2.xlsx" target="_blank">こちらの表を表示するには、ここをクリックしてください (右クリックしてダウンロードしてください)。</a>
表3:スプリットアンドミックス戦略で合成した2つの変異原性プライマーの品質チェックの結果。変異原化コドンは[XXX]で示される。低いインデックス数は、コード化されたアミノ酸の位置を示します。ツァピンスカら8世からエルゼビアの許可を得て適応。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/table3.xlsx" target="_blank">こちらの表を表示するには、ここをクリックしてください (右クリックしてダウンロードしてください)。</a>
表4:EP-PCRの結果ECSの22クローンの配列解析から導出された主要なパラメータ。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/table4.xlsx" target="_blank">こちらの表を表示するには、ここをクリックしてください (右クリックしてダウンロードしてください)。</a>

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In Vitro Directed Evolution of a Restriction Endonuclease with More Stringent Specificity

新しい配列特異性を有する制限エンドヌクレアーゼは、部分的に縮退配列を認識する酵素から開発することができる。ここでは、NlaIV酵素の配列特異性を変更するために使用した詳細なプロトコルを提供します。プロトコルの主な成分は、転写/翻訳反応のインビトロ区画化と新しい配列特異性を有するバリアントの選択である。

より厳格な特異性を有する制限エンドヌクレアーゼのインビトロ指向進化

Restriction endonuclease (REase) specificity engineering is extremely difficult. Here we describe a multistep protocol that helps to produce REase ...

当社のプロトコルは、体外区画化と指向進化におけるユニークな選択戦略を使用して、変化した、より厳格な配列特異性を持つ制限酵素の作成を可能にします。制限エンドヌクレアーゼに適用され、選択は元のコネートシーケンスのより厳しいバージョンに向けることができるので、潜在的にそれは非常に普遍的です。新しく作成された変異体がin vitro転写翻訳によって発現される場合、プロトコルは特異性を絞り込むだけでなく、特異性を変化させるのにも適している。亜飽和変異形成の部位を決定するには、サイトの仮定の重要性に応じて変異発生頻度を選択し、ライブラリ全体の複雑さに制限を念頭に置きます。合成を開始するには、新しい樹脂を詰めた列をシンセサイザーに挿入します。トリプレットまで全てのカラムのオリゴヌクレオチドを合成し、3素端から数える第2の亜飽和変異発生部位の直前に。合成し、5素数のトリチウム基を最後に残す。保護グループは、次の合成サイクルの開始時に削除されます.合成カラムを開き、乾いた1.5ミリリットルのチューブに短時間遠心分離して樹脂を回収します。CPG合成サポートを引き出し、渦によって混合します。混合CPG樹脂を新しい合成カラムに再分割します。湿度は全体的な収量を減少させるので、導入を避けてください。亜飽和変異生成部位トリプレットから始めて、合成を継続する。目的の突然変異発生頻度に従って、カラムをランダム化NNS三つ子または野生型三つ子に割り当てます。追加の亜飽和部位が存在する場合は、次の亜飽和変異形成部位の前に三重項に進む。下流に亜飽和部位が存在しない場合は、合成を完了し、最後に5原性トリチウム基を残す。広いボアピペットチップを使用して、スパン80の225マイクロリットルとTween 80の25マイクロリットルを15ミリリットルの円錐形チューブに5ミリリットルのミネラルオイルを加えることによって、油界面活性剤混合物を調製します。穏やかな反転で15回徹底的に混ぜます。このステップでの混合物は半透明である必要があります。各ライブラリーについて、950マイクロリットルの油界面活性剤混合物を2ミリリットルの丸底極低温バイアルに移す。ライブラリ名でラベルを付け、氷に移します。各バイアルに小さな円筒形の攪拌棒を1つ入れます。メーカーの提案に従って、インビトロ転写翻訳反応混合物を準備します。1.5 ミリモルの最終濃度に塩化マグネシウムと混合物を補います.反応混合物の50マイクロリットルのアリコートを氷上の1.5ミリリットルのチューブに分配する。氷上の反応混合物にライブラリの1.7フェムトモレを追加します。まず、攪拌速度を1150 RPMに設定して、磁気攪拌機に氷で満たされた小さなビーカーを置くことによって、各ライブラリに連続して油水中エマルジョンを調製します。その後、950マイクロリットルの油界面活性剤混合物と小さな攪拌バーを備えた極低温バイアルを磁気攪拌機の氷冷ビーカーに移します。攪拌バーが回転していることを確認します。30秒間隔で2分間にわたってインビトロライブラリ転写翻訳混合物の5つの10マイクロリットルのアリコートを加え、さらに1分間攪拌を続ける。エマルジョンを使用してバイアルを氷容器に移します。この時点で、液体は半透明ではなく不透明でなければなりません。次に、次のライブラリに進みます。すべてのライブラリが処理された後、キットメーカーの推奨に従って、すべてのライブラリのインキュベーションを開始します。バイアルを、少なくとも10分間氷の上に置く前に、さらに2時間、設計されたエンドヌクレアーゼに最適な温度に移します。1.5ミリリットルのチューブに極低温バイアルからエマルジョンを転送します。5モルEDTAの1マイクロリットルを加えます。そして、室温で5分間13,000倍gでそれらを遠心分離します。遠心後に水油界面がはっきりと見えない場合は、上部油相の吸引前に混合物を凍結してください。上部の油相をピペットで動かし、廃棄します。水相にフェノールクロロホルム150マイクロリットルと10ミリモルトリス-HClの100マイクロリットルを加えて抽出をすぐに行います。ボルテックスを、次いで13,000倍gで30秒遠心分離を経て相分離を行う。上部水相を収集します。3モル酢酸ナトリウム15マイクロリットル、グリコーゲン2.5~5マイクログラム、エタノール375マイクロリットルを添加してDNAを沈殿させる。サンプルをマイナス20度で1時間インキュベートした後、遠心分離機は13,000グラム、摂氏4度で15分間処理します。上清を捨て、冷たい70%エタノールの1ミリリットルでペレットを短時間洗います。DNAグリコーゲンペレットをスピードバクまたはエアドライヤーで5分以上乾燥します。その後、ペレットを10ミリモルトリス-HClの50マイクロリットルに溶解する。次に、メーカーの指示に従って調製したストレプトアビジン磁気ビーズを5マイクロリットル加えます。室温で1時間混合し、好ましくはカルーセルミキサーで、または穏やかな渦によって混合する。チューブを磁気スタンドに移してビーズを分離します。その後、ビオチンを含まないDNAに濃縮された液体を回収する。このプロトコルは、不活性な酵素およびエンドヌクレアーゼを不変の野生型配列特異性で枯渇させることによって、設計された制限エンドヌクレアーゼの所望の変異体の頻度を増加させるツールである。成功したスクリーニングは有望な変種の20%まで識別できる。変異体は、野生型酵素とは異なる切断パターンを生成する場合、有望な変異体として標識される。シーケンスの優先順位を変更した可能性があるバリアントにもラベルが付けられます。ここに示されているのは、非アクティブな分散の大部分と明らかに変化していない切断パターンを持つ1つの変異体を伴うスクリーニングに失敗した。この場合、ライブラリはストレプトアビジンキャプチャ選択ステップを逃れた非アクティブなバリアントによって支配されている可能性が最も高い。選択された、カウンター選択された配列を慎重に設計し、少数の選択された位置で置換を生成する変異生成戦略によってライブラリーの多様性を制限することが重要である。選択された最良の変異体は、最初のスクリーニングからの結果に基づいて、好ましいと切断された配列に結合および切断動態について十分に特徴付けるべきである。我々の試験事例では、変異遺伝子形成部位を相同性モデルに基づいて選択した。驚くべきことに、結晶構造は後に、いくつかの改変された残基がDNAと直接接触していない可能性が最も高いことを示した。

Research

JoVE Journal

Genetics

Design and Use of a Low Cost, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution of Bacteria Under Antibiotic Drug Selection

設計と低コストの使用、自動Morbidostat細菌の適応進化のための抗生物質選択下

We describe a low cost, configurable morbidostat for characterizing the evolutionary pathway of antibiotic resistance. The morbidostat is a bacterial ...

Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat

ケモスタットを用いた微生物の適応研究所進化のための手順

Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) ...

Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development

ヒト膵臓の開発にリネージュの決定要因を問い合わせるためのゲノム編集とhPSCsの指向性分化

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding ...

Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans

Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans

線虫の遺伝子発現レベルの間に寿命変調下広い範囲食事制限によってエンコードされた情報の定量化

Sensory systems allow animals to detect, process, and respond to their environment. Food abundance is an environmental cue that has profound effects on ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

遺伝子破壊ミュータンス連鎖球菌緊張せず遺伝子クローニングの生成

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Testing the Role of Multicopy Plasmids in the Evolution of Antibiotic Resistance

抗生物質耐性の進化のマルチコピー プラスミドのロールのテスト

Multicopy plasmids are extremely abundant in prokaryotes but their role in bacterial evolution remains poorly understood. We recently showed that the ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

真核生物の転写エラーのゲノム全体の監視

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

物品税課税対象の抗生物質耐性カセット P1 伝達による大腸菌の遺伝子の削除を生産

A first approach to study the function of an unknown gene in bacteria is to create a knock-out of this gene. Here, we describe a robust and fast protocol ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

MRNA の構造変化を誘導培養と細胞の形で使用して小分子を調査するには

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Using Sniper-Cas9 to Minimize Off-target Effects of CRISPR-Cas9 Without the Loss of On-target Activity Via Directed Evolution

進化を介してターゲットの活性を失うことがなく CRISPR Cas9 のオフターゲット効果を最小限に抑えるための狙撃兵 Cas9 を使用してください。

The development of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated protein 9 (Cas9) into therapeutic modalities requires the ...