Name: in vitro directed evolution of a restriction endonuclease with more stringent specificity
Uploaded: 2020-03-25T15:00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Directed Evolution of a Restriction Endonuclease with More Stringent Specificity at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av bevilgningene fra Vitenskaps- og høyere utdanningsdepartementet (0295/B/PO1/2008/34 til MB og N301 100 31/3043 til KS), fra Det polske nasjonale vitenskapssenteret (NCN) (UMO-2011/02/A/NZ1/00052, UMO-2014/13/B/NZ1/03991 og UMO-2014/14/M/NZ5/00558 til MB) og ved kortsiktig EMBO-fellesskap til KS (ATSF 277.00-05).

<ol>
	<li>Sch&#246;ttler, S., Wenz, C., Lanio, T., Jeltsch, A., Pingoud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+engineering+of+the+restriction+endonuclease+EcoRV--structure-guided+design+of+enzyme+variants+that+recognize+the+base+pairs+flanking+the+recognition+site.">Protein engineering of the restriction endonuclease EcoRV--structure-guided design of enzyme variants that recognize the base pairs flanking the recognition site.</a> European Journal of Biochemistry. 258 (1), 184-191 (1998).</li><li>Wenz, C., Hahn, M., Pingoud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+variants+of+the+restriction+endonuclease+EcoRV+that+depend+in+their+cleavage+activity+on+the+flexibility+of+sequences+flanking+the+recognition+site.">Engineering of variants of the restriction endonuclease EcoRV that depend in their cleavage activity on the flexibility of sequences flanking the recognition site.</a> Biochemistry. 37 (8), 2234-2242 (1998).</li><li>Samuelson, J. C., Xu, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+restriction+endonuclease+BstYI+to+achieve+increased+substrate+specificity.">Directed evolution of restriction endonuclease BstYI to achieve increased substrate specificity.</a> Journal of Molecular Biology. 319 (3), 673-683 (2002).</li><li>Samuelson, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+a+rare-cutting+restriction+enzyme:+genetic+screening+and+selection+of+NotI+variants.">Engineering a rare-cutting restriction enzyme: genetic screening and selection of NotI variants.</a> Nucleic Acids Research. 34 (3), 796-805 (2006).</li><li>Rimseliene, R., Maneliene, Z., Lubys, A., Janulaitis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+restriction+endonucleases:+using+methylation+activity+of+the+bifunctional+endonuclease+Eco57I+to+select+the+mutant+with+a+novel+sequence+specificity.">Engineering of restriction endonucleases: using methylation activity of the bifunctional endonuclease Eco57I to select the mutant with a novel sequence specificity.</a> Journal of Molecular Biology. 327 (2), 383-391 (2003).</li><li>Morgan, R. D., Luyten, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+engineering+of+type+II+restriction+endonuclease+DNA+binding+and+cleavage+specificity.">Rational engineering of type II restriction endonuclease DNA binding and cleavage specificity.</a> Nucleic Acids Research. 37 (15), 5222-5233 (2009).</li><li>Skowronek, K., Boniecki, M. J., Kluge, B., Bujnicki, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+engineering+of+sequence+specificity+in+R.MwoI+restriction+endonuclease.">Rational engineering of sequence specificity in R.MwoI restriction endonuclease.</a> Nucleic Acids Research. 40 (17), 8579-8592 (2012).</li><li>Czapinska, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+Structure+and+Directed+Evolution+of+Specificity+of+NlaIV+Restriction+Endonuclease.">Crystal Structure and Directed Evolution of Specificity of NlaIV Restriction Endonuclease.</a> Journal of Molecular Biology. 431 (11), 2082-2094 (2019).</li><li>Miller, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+by+in+vitro+compartmentalization.">Directed evolution by in vitro compartmentalization.</a> Nature Methods. 3 (7), 561-570 (2006).</li><li>Zheng, Y., Roberts, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+restriction+endonucleases+using+artificial+cells.">Selection of restriction endonucleases using artificial cells.</a> Nucleic Acids Research. 35 (11), e83 (2007).</li><li>Takeuchi, R., Choi, M., Stoddard, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redesign+of+extensive+protein-DNA+interfaces+of+meganucleases+using+iterative+cycles+of+in+vitro+compartmentalization.">Redesign of extensive protein-DNA interfaces of meganucleases using iterative cycles of in vitro compartmentalization.</a> Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 111 (11), 4061-4066 (2014).</li><li>Howland, J. L., Ausubel, F., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Short Protocols in Molecular Biology. , (1995).</li><li>Wilson, D. S., Keefe, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+8+Unit+8.3:+Random+mutagenesis+by+PCR.">Chapter 8 Unit 8.3: Random mutagenesis by PCR.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (2001).</li></ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Utvalgsprotokollen som er beskrevet her ble testet for NlaIV8, en dimeric PD-(D/E)XK fold anerkjennelse sekvens som gjenkjenner en palindromisk målområde med sentrale NN baser og katalyserer en stump ende kuttet mellom NN baser. NlaIV ble plukket fordi spalting mellom NN-basene tyder på at disse basene er nær proteinet i komplekset. I prinsippet kan protokollen brukes til enhver sekvens spesifikk begrensning endonuclease, monomeric eller dimeric, av en fold gruppe, katalysere dobbel tråd pauser av noen forskjøvet, uavhengig av om katalytiske og spesifisitet domener faller sammen (som i NlaIV eksempel) eller er separate (f.eks FokI). Videre er protokollen i prinsippet nyttig ikke bare for generering av nye, smalere enzymspesifisitet, men kan også brukes til å eliminere stjerneaktiviteter, eller for å skape high fidelity endonucleases. Alt dette er imidlertid ikke testet ennå. Spesielt kan målrettet eliminering av stjerneaktivitet være komplisert, fordi de samme aminosyrerester kan være involvert i binding til de ønskede og uønskede basene. In vitro trinnene som er beskrevet i denne protokollen er ikke begrenset til valg av innsnevrede spesifisiteter, men kan også brukes til å velge ellers endrede spesifisiteter. Det er imidlertid da et problem med variant endonucleases: hvis spekteret av substrater inkluderer nye mål som ikke spaltes av foreldrenes endonuclease, er det generelt ingen god måte å beskytte celler mot de skadelige effektene av denne aktiviteten. I motsetning, hvis endonuclease spesifisitet bare er innsnevret, målene er et delsett av vill type mål, og dermed den allerede tilgjengelige cognate metyltransferase bør være fullt beskyttende.
Vår protokoll skiller seg på flere måter fra mange regisserte evolusjonsprotokoller. Åpne leserammemangfold genereres en gang i begynnelsen av eksperimentet, ikke i hver iterasjon. Videre er det skapt av split-and-mix syntese, snarere enn av EP-PCR. For NNS-erstatninger av codons, som brukt i dette arbeidet, er det (4 x 4 x 2)6 ~ 1,07 x 109 kombinasjoner for seks posisjoner. Derfor er en gitt variant til stede i gjennomsnitt en gang i 1,7 fmoles av ESC. Denne kapasiteten kan økes til syv posisjoner ved hjelp av syntese med en blanding av 20 trinucleotide forløpere som tilbys av Glen Research eller ved å redusere mutasjonsfrekvens i mindre lovende posisjoner med split-and-mix oligonucleotide syntese. Hvis det er mulig, anbefales det å begrense omfanget av variasjon til seks stillinger. Selvfølgelig krever slik mutagenesis målretting noen eksisterende kunnskap om minst regionene i REase involvert i substratbinding. Split-and-mix-protokollen for å generere mangfold har klare fordeler i forhold til EP-PCR. Ved hjelp av EP-PCR fikk vi uendret varianter og sekvenser med åtte erstatninger for NlaIV-ESCer i samme EP-PCR (tabell 4). Biblioteket fra EP-PCR inneholder en betydelig brøkdel av kloner som bør unngås (vill type sekvenser, flere substitusjoner, frameshift og tull mutasjoner, og mutasjoner på steder usannsynlig å påvirke sekvensspesifisitet).
Vår protokoll skiller seg også fra mange andre anrettede evolusjonsprotokoller ved tilstedeværelsen av to sekvensielle utvalgstrinn. Positivt valg sørger for at ønsket aktivitet beholdes, ellers fjernes ikke biotinkoden, og kodesekvensen kan fjernes ved å trekke ned. Det er teknisk mulig at den falske fremveksten av en roman, ikke-overlappende spesifisitet (f.eks GCATGC) kan føre til utsslutt av biotinkoden også, hvis et passende spaltingssted er til stede i nærheten av ønsket spalting, men ikke andre steder. Dette bør imidlertid være svært usannsynlig. Negativt utvalg fjerner åpne leserammer som kode for enzymer som fortsatt har uønsket aktivitet. Dette trinnet er ikke strengt obligatorisk, fordi protokollen fortsatt vil berike utdatabiblioteket med varianter som er i stand til å holde utvalgssekvensen, men ikke i stand til å holde seg andre steder i ESC, og dermed gjøre den uegnet for PCR forsterkning. Imidlertid forventes utvalgseffektiviteten å være lavere fordi enzymer med den opprinnelige sekvensspesifisiteten ikke vil bli fjernet fra utgangen og vil konkurrere lovende varianter med endret spesifisitet, men også redusert enzymatisk aktivitet. Vær oppmerksom på at på befolkningsnivå kan både ønskede og uønskede målsekvenser, men trenger ikke være, degenerere. I NlaIV-eksemplet ble antimålet degenerert og målet ikke-degenerert. Selv når det er degeneracy på befolkningsnivå, i en enkelt dråpe bare ett (ikke-degenerert) mål eller anti-mål er til stede. I vår protokoll gjeninnføres mål- og antimålsekvenser ved hver repetisjon av valgtrinnene. Derfor må en åpen leseramme kode et enzym som er i stand til å holde alle mulige mål, og ute av stand til å holde noen av antimålene, for å overleve flere valgrunder. Legg merke til at behovet for å gjeninnføre antiselection målet ved hver iterasjon av protokollen håndhever to sekvensielle PCRs. Den første PCR bruker en primer som anneals utenfor anti-målet, slik at cleavage av anti-målet hindrer PCR reaksjon. Den andre PCR krever en primer som når utover anti-målet, og gjeninnfører anti-mål, for å sikre at hver åpen avlesningsramme testes mot alle varianter av antimålet under flere runder med valg.
For enzymer som genererer klebrig ender, kan en relatert alternativ protokoll basert på en tidligere beskrevet metode for isolering av REase ORF10 brukes. Uttømming av inaktive varianter av biotinfangst som brukes i våre eksperimenter, erstattes i den alternative protokollen ved å ligation av den kompatible adapteren med en sekvens som brukes som et primerbindingssted i en selektiv PCR (figur 9). Bare ESCer som produserer enzymer med den valgte spesifisiteten genererer ligation-kompatible ender og vil derfor bli valgt. Sekvensen av den klissete enden av telleren som ikke er valgt, må utformes på en slik måte at den ikke kan delta i ligation med adaptere. Iterasjon av utvelgelsesprosessen kan enkelt oppnås ved å bytte mellom to forskjellige adaptere og dermed to forskjellige omvendte primere i selektiv PCR.
Selv med nye protokoller er oppgaven med å konstruere nye spesifisiteter in vitro fortsatt svært utfordrende. For typisk type II REases er sekvensspesifisitet og endonucleolytic aktivitet avhengig av de samme proteinområdene. Det er derfor vanskelig å endre den ene uten å påvirke den andre. Suksess er gjort mer sannsynlig av en strategi som tar hensyn til fotavtrykket til enzymet, respekterer symmetrien av protein-DNA interaksjoner, og bygger på eksisterende enzymatiske preferanser, som bør bestemmes på forhånd i biokjemiske eksperimenter, som ble gjort for NlaIV eksempel8.

Sekvensspesifisitetsteknikk er ekstremt utfordrende for klasse II REases. I denne klassen av endonukleases, sekvens anerkjennelse og katalyser er tett sammenvevd, mest sannsynlig som en evolusjonær beskyttelse mot etableringen av en endonuclease av bredere spesifisitet enn sin cognate metyltransferase, som ville skade verten DNA. Rettet utvikling av nye spesifisiteter i celler er ytterligere komplisert av behovet for å beskytte verten DNA mot den nylig konstruerte endonuclease aktivitet. Derfor er det bare noen få vellykkede forsøk på REase engineering rapportert og alle av dem utnytte de unike funksjonene til et bestemt enzym1,2,3,4,5,6,7.
Her gir vi en detaljert protokoll for spesifisitetsteknikk som kan brukes til å generere endonuclease-varianter som har smalere spesifisitet enn et foreldreenzym som er basert på vår vellykkede prosjektering av en NlaIV endonuclease8. For et slikt enzym med en vilkårlig gjenkjenningssekvens kan ekstra spesifisitet innføres for baser i flankene. For foreldreenzymer som gjenkjenner delvis degenererte sekvenser (for eksempel NlaIV med GGNNCC-målet), kan ytterligere spesifisitet også innføres i gjenkjenningssekvensen. Som ekstra spesifisitet vil trolig kreve protein-DNA-kontakter, bør de nylig anerkjente basene ligge innenfor fotavtrykket til foreldrenes endonuclease på DNA. I prinsippet kan valgordninger defineres for ønsket spesialisering av gjenkjenningssekvensen. Imidlertid er de fleste reases som gjenkjenner palindromic og nesten palindromic målsekvenser funksjonelle dimers som gjenkjenner bare et halvt sted av palindrome. Derfor er det lite sannsynlig at valg av nye spesifiteter som bryter symmetrien av proteinnukleærinteraksjoner, vil fungere. For den dimeric NlaIV, for eksempel, kan GGNNCC-sekvensen teoretisk begrenses til GGATCC, men innsnevring av spesifisiteten ned til GGAACC forventes å være vanskeligere. Vår ordning innebærer både positivt og negativt utvalg.
Prosessen er mer effektiv når negativt utvalg også brukes til å fjerne spesifisitetene som kan holde alle andre sekvenser enn den foretrukne smalere spesifisiteten. Valg for GGATCC kan for eksempel kombineres med antivalg mot GGBVCC (der B er en annen base enn A, og V er en annen base enn T). Når noen av de mulige målsekvensene ikke dekkes, avhenger utfallet av utvalgseksperimentet av effektiviteten av positivt og negativt utvalg. I vårt NlaIV-arbeid valgte vi for GGATCC, og mot GGSSCC (hvor S er G eller C), og fikk en spesifisitet som, ignorerer symmetribrytende mål, kan beskrives som GGWWCC (hvor W er A eller T), noe som tyder på at i dette spesielle tilfellet var negativt utvalg mer viktig enn positivt utvalg.
Vår tilnærming starter med opprettelsen av en uttrykksvalgkassett (ESC). ESC er strukturert i seksjoner. På innsiden kjernen delen, det er varianter av den åpne leserammen (ORF) av REase, under T7 arrangør kontroll. Denne kjernedelen av ESC kan ikke inneholde noe cognate-område for den konstruerte REase. Kjernen er klemt mellom to cognate nettsteder for vill type REase: en cleavage nettsted for uønsket aktivitet (counter valgt sekvens, GGSSCC i dette eksemplet) og en cleavage nettsted for ønsket aktivitet (valgt sekvens, GGATCC i eksemplet). Det siste trinnet i utarbeidelsen av ESC i PCR legger biotin nær ønsket aktivitet på 5'slutten og skaper en rekke teller utvalgte sekvenser (GGSSCC i eksemplet). Valgstrategien er avhengig av bruk av nøye utformede primere ved ESC-reampliiseringsprotokollen etter en in vitro transkripsjon/oversettelses-/utvelgelsesprotokoll (figur 1A). ESC-biblioteket uttrykkes i en in vitro compartmentalized transkripsjon oversettelse vann-i-olje emulsjon9,,10,11. Innenfor hver dråpe påvirker spesifisiteten til det uttrykte enzymet tilstanden til ESC(Figur 1B, trinn I). For den beskrevne ordningen fjerner ønsket spaltingsaktivitet av det oversatte proteinet DNA-ets biotinmerke, men påvirker ikke den andre ESC-enden med tellerenvalgt sekvens. Når emulsjonen er ødelagt, fjernes biotinylated fragmenter ved streptavidin affinitetspulldown, slik at bare fragmenter fra dråper med ønsket aktivitet forblir (Figur 1B, trinn II). Dette trinnet fjerner inaktive REase-varianter. Den supernatante fraksjonen av nedtrekkstrinnet forsterkes deretter av PCR. I den første PCR reaksjon primers F2 og R1 brukes (Figur 1A, B, trinn III). Primer F2 bindes til ESC-delen mellom den valgte telleren og molekyletden. Derfor er ESCs som uttrykker varianter som er i stand til å cleaving telleren valgt sekvens (og derfor skille bindingsstedene for primere F2 og R1 i to forskjellige DNA molekyler) ikke forsterkes og blir dermed fjernet fra biblioteket. Primer R1 binder seg mellom det valgte området og kjernen i ESC slik at det ikke påvirkes av spaltningsstatusen til det valgte området og gjenoppretter spaltningsstedet for ønsket aktivitet (GGATCC). Syklusen er lukket av en annen PCR (med primere F1 og R2) som legger biotin på 5'slutten nær det valgte området og gjenoppretter designet variasjon på telleren valgt sted nær motsatt ende av ESC(Figur 1B, trinn IV). Den resulterende DNA-blandingen er klar for en ny runde med valg.
Suksessen til utvelgelsesprotokollen avhenger sterkt av riktig valg av den nye, strengere målgjenkjenningssekvensen og forsiktig utforming av mutagenesisstrategien og den effektive implementeringen. Fordi det er mye lettere å forbedre på små eksisterende preferanser av REase enn å overvinne dem, anbefaler vi å starte med en kinetisk studie av eventuelle eksisterende preferanser. Nødvendigheten av forsiktig mutagenesis design skyldes den begrensede størrelsen på et mutert bibliotek som kan behandles av den presenterte protokollen (109 kloner i et enkelt eksperiment). Derfor kan alle 20 mulige aminosyresubstitusjoner effektivt testes i bare noen få stillinger (se Diskusjon). Tilfeldig mutagenesis, for eksempel feilutsatt PCR (EP-PCR) presentert som en alternativ metode, vil føre til dyp undersampling av eksisterende kompleksitet. Hvis informasjon om potensielle aminosyrestillinger involvert i kontakter med DNA (eller til og med ligger i nærheten av degenererte nukleotider i en cognate sekvens) er tilgjengelig, bør det absolutt brukes til å velge noen aminosyrer for oligonucleotide guidet metningmutagenesis (protokolltrinn 1.6-3.10).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1000&#197; CPG Support (dA, dT, dC, dG)</td>
			<td>Biosset</td>
			<td>45-1000-050</td>
			<td>Other vendors can be used as well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ASM-800 DNA/RNA</td>
			<td>Biosset</td>
			<td>800-001-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJET Gel Extraction Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K0691</td>
			<td>Any other kit can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glen-Pak DNA purification cartridge</td>
			<td>Glen Research</td>
			<td>60-5200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIS-Select Nickel Affinity Gel</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET 28a vector</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any other vector with T7 promoter upstream of plycloning site can be used instead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td>Any other high fidelity and highly processive thermophilic polymearse can be used instead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porous steel foil</td>
			<td>Biosset</td>
			<td>40-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid Translation System 
			RTS 100, E.coli HY Kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3 186 148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction endonucleases</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Obviously other vendors, enzymes can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Magnetic Beads</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>S1420S</td>
			<td>Other vendors can be used as well. We have positively tested beds form Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthesis chemicals including phosphoramidities</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td></td>
			<td>Other vendors can be used as well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthesis columns (different sizes)</td>
			<td>Biosset</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EL0011</td>
			<td>Any other ligase can be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro directed evolution of a restriction endonuclease with more stringent specificity

Begrensning endonuclease (REase) spesifisitet engineering er ekstremt vanskelig. Her beskriver vi en flertrinnsprotokoll som bidrar til å produsere REase-varianter som har strengere spesifisitet enn foreldreenzymet. Protokollen krever opprettelse av et bibliotek med uttrykksvalgkassetter (EsCer) for varianter av REase, ideelt sett med variabilitet i posisjoner som sannsynligvis vil påvirke DNA-binding. ESC er flankert på den ene siden av en sekvens for begrensning ser nettstedet aktivitet ønsket og en biotin tag og på den andre siden av en begrensning nettsted for uønsket aktivitet og en primer gløding området. EsCene transkribert og oversatt i en vann-i-olje emulsjon, under forhold som gjør tilstedeværelsen av mer enn ett DNA molekyl per dråpe usannsynlig. Derfor blir DNA i hvert kassettmolekyl bare utsatt for aktiviteten til det oversatte, kodede enzymet. REase varianter av ønsket spesifisitet fjerne biotin tag, men ikke primer annealing området. Etter å ha brutt emulsjonen, blir DNA-molekylene utsatt for en biotinpulldown, og bare de i supernatanten beholdes. Dette trinnet sikrer at bare ESCer for varianter som ikke har mistet ønsket aktivitet, beholdes. Disse DNA-molekylene blir deretter utsatt for en første PCR-reaksjon. Cleavage i uønsket rekkefølge kutter av primer bindende området for en av primere. PCR forsterker derfor bare ESCer fra dråper uten uønsket aktivitet. En annen PCR-reaksjon utføres deretter for å gjeninnføre begrensningsstedet for ønsket spesifisitet og biotinkoden, slik at valgtrinnet kan gjentas. Utvalgte åpne leserammer kan overuttrykkes i bakterielle celler som også uttrykker den cognate metyltransferase av foreldrene SEase, fordi den nyutviklede REase bare retter seg mot et undersett av metyltransferasemålsstedene.

Denne protokollen er bare et verktøy for å øke frekvensen av ønskede varianter av en konstruert rease ved å tømme (men ikke eliminere) to uønskede klasser: inaktive enzymer og endonucleases med uendret vill type sekvens spesifisitet. På den annen side, fordi endring av REase spesifisitet er ekstremt vanskelig, finne enda en slik variant produsere en cleavage mønster som er forskjellig fra vill type enzymet i en enkelt screening av 24 kloner bør betraktes som en suksess. I våre hender kunne de beste skjermene identifisere opptil 20% av lovende varianter (Figur 8A).
Det positive resultatet avhenger sterkt av en bibliotekkvalitet (dvs. begrenset hyppighet av substitusjoner og deres tilfeldige distribusjon) og effektiv fangst av den biotinylated befolkningen av bibliotekmedlemmer (trinn 3.6-3.7). Begge problemene kan oppdages. Bibliotekkvaliteten bør kontrolleres før valget ved sekvensering av så mange kloner som mulig (>15) eller ved direkte sekvensering av biblioteket ved sekvensering med høy gjennomstrømning (trinn 3.10, tabell 3). Hvis et flertall av de valgte klonene ikke er aktive, er dette en klar indikasjon på svikt i streptavidin-fangstvalget. En lignende effekt observeres i tilfelle av biblioteker som gjennomgår mange utvalgssykluser, fordi slike biblioteker mest sannsynlig domineres av inaktive varianter som unnslapp streptavidin fangst utvalg trinn (Figur 8B). Derfor er det tilrådelig å kjøre screening etter hver utvelgelsessyklus og videreutvikle manuelt utvalgte lovende varianter i stedet for å stole på valgitering.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig1.jpg"> Figur 1: In vitro valg av en ny sekvens spesifisitet basert på NlaIV engineering. (A) Organiseringen av uttrykket/valgkassetten (ESC) inkluderer to gjenkjenningssteder for REase, 1) den valgte sekvensen (GGATCC) nær høyre ende og 2) den motvalgte sekvensen (GGSSCC) nær venstre ende, samt T7p og T7t-T7-arrangøren og T7-terminatoren. Primerbindingsstedene vises nedenfor. Cleavage etter vill type og utvalgte NlaIV varianter vises som røde og grønne trekanter henholdsvis. (B) Trinn for valgsyklus: I) Emulgering av transkripsjons-oversettelse-cleavage reaksjon blander med ESC biblioteket; II) Alt biotinylated DNA fanges på magnetiske partikler belagt med streptavidin og fjernet, og dermed fjerne koding inaktive varianter; III) ESCer koding REases med vill type aktivitet (dvs. de som er i stand til å holde GGSSCC sekvens) elimineres fordi cleavage av sekvensen skiller bindingnettsteder for fremover og revers primers. Derfor oppstår ingen forsterkning av disse EsCene; IV) Inngang til neste valgrunde opprettes ved tillegg av biotin i høyre ende og gjeninnføre variasjon av tellervalgte sekvenser i venstre ende. Gjengitt fra Czapinska et al.8 med tillatelse fra Elsevier. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig1large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig2.jpg"> Figur 2: Utarbeidelse av ESC. Fragment avledet fra den opprinnelige konstruksjonen i en uttrykksvektor som inneholder NlaIV ORF under kontroll av T7-arrangøren ble endret for å være egnet for uttrykk/valg. NlaIV-området nedstrøms fra NlaIV ORF ble fjernet og unike steder (SalI, EcoRI og Eco52I) som ble brukt til å dempe utvalgte posisjoner ble introdusert i NlaIV ORF som stille mutasjoner. Den endelige konstruksjonen ble forsterket med flankerte primere som introduserte to flankerte NlaIV-områder: Den valgte tellersekvensen (GGSSCC) til venstre og valgt sekvens (GGATCC) til høyre. Den omvendte primeren introduserte også biotin. Primere som brukes til å lage muterte ECS vises som blå piler og merket nedenfor (se tabell 1B,C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig3.jpg"> Figur 3: Ordning for splitt og bland syntese. Eksemplet refererer til MutB primer syntese der en NNS sekvens ble introdusert på 0,8 frekvens på fire posisjoner (se også tabell 3). Merk at kjemisk syntese utføres fra 3 til 5', men alle sekvenser er vist i kanonisk 5'-3 'orientering (dvs. det fortsetter fra høyre til venstre i denne ordningen). Wild type sekvenser på mutagenized posisjoner vises i grønt mens NNS mutagne sekvenser er i rødt. SalI-gjenkjenningsstedet som senere brukes til å introdusere mutasjoner i ESCer, understrekes. Punkter for blanding og splitting trinn (2 og 4) er angitt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig3large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig4.jpg"> Figur 4: Bruk av unike restriksjonenzymsteder i oligonucleotid målrettet mutagenesis. Strategien for mutasjonsintroduksjon er vist på et eksempel på bygging av bibliotekene A-C (se trinn 3.1–3.7). Gjengitt fra Czapinska et al.8 med tillatelse fra Elsevier. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig4large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig5.jpg"> Figur 5: Endonucleolytic cleavage in in vitro transcription-translation. (A) Spalting av et testsubstrat i optimal REase-buffer: 1) Substrat, 612 bp PCR-produkt med et enkelt NlaIV-gjenkjenningsnettsted; 2) Cleavage produkter, 355 bp og 257 bp. (B) Cleavage i en in vitro transkripsjon-oversettelse reaksjon (inneholder 0,5 μg av ESC): 1–2) 15 μL aliquots av in vitro transkripsjon oversettelse uten substrat (linje 2: reaksjon supplert med 1,5 mM MgCl2); 3–4) 15 μL aliquots av in vitro transkripsjon-oversettelse med 1 μg testsubstrat; (linje 4: reaksjon supplert med 1,5 mM MgCl2). S-DNA størrelse markør (pBR322 fordøyd med MspI). Eksempler ble løst i 6% opprinnelig SIDE. DNA ble farget med ethidiumbromid. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig5large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig6.jpg"> Figur 6: Produkter av den første PCR i valgsyklusen. Se figur 1B, trinn III; protokolltrinn 5.10. Kolonnesett 1 og 2 er aliquots av to forskjellige biblioteker lastet i triplicate. S-DNA størrelse standard (lambda DNA fordøyd med HindIII og EcoRI). Pilen angir posisjonen til ESC i full lengde (1050 bp). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig6large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig7.jpg"> Figur 7: NlaIV-varianter renset for videre screening i miniskala. Se trinn 6.3.11. Hver linje inneholder en 10 μL aliquot av en annen variant. S-protein molekylvekt standard. Molekylær masse av NaIV REase underenhet er 29,9 kDa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig7large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig8.jpg"> Figur 8: Eksempler på screening av NlaIV-varianter for sekvensspesifisitetsendring. Se trinn 6.4.2. (A) Vellykket screening med høy frekvens av lovende varianter. S = DNA størrelse markør, lambda DNA spaltet med HindIII og EcoRI; vill type (wt) = lambda DNA spaltet med vill type NlaIV; λ = lambda DNA substrat, ikke spaltet; andre kolonner=varianter med svært lav aktivitet. Varianter er merket ! = lovende varianter som produserer et spaltingsmønster forskjellig fra villtypeenzymet; ? = varianter som også kan ha endret sekvenspreferanse. (B) Mislykket screening, med et flertall av varianter inaktive og en variant med tilsynelatende uendret spalting mønster. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig8large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig9.jpg"> Figur 9: Alternativt utvalg etter ligation. Dette alternativet kan brukes til alle REases generere klissete ender. Her presenterer vi en eksempelprotokoll for et utvalgsskjema for MwoI-enzym (upublisert). I) Valgt sekvens (plassert til høyre på ESC) med definerte rester vist i rødt og valgt variasjon av den kognatsekvensen vist i blått. I parenteser under den valgte tellersekvensen som skal plasseres i venstre ende av ESC vises. II) Produkt av MwoI cleavage; III) Etter terminering in vitro transkripsjon/oversettelse blir produktene renset og ligation utføres med overflødig adapter. Bare spaltingsproduktene som ble spaltet i den valgte sekvensen kan delta i ligation. Derfor elimineres inaktive varianter, og pulldown-trinnet er unødvendig. Spaltningsproduktet i den valgte tellersekvensen (på venstre side av ESC, ikke vist) kan ikke delta i denne ligasjonen fordi den utstående enden av adapteren ikke er komplementære til den valgte telleren; IV) Selektiv PCR bruker samme strategi som i hovedprotokollen for å eliminere varianter med villtype degenerere sekvens spesifisitet (F1 primer binding distal til telleren valgt sted) mens inaktive varianter elimineres av selektiv omvendt primer som ikke kan binde til onkelaved (og derfor ikke endret av adapter ligation) høyre ende. I neste syklus kan prosessen gjentas ved hjelp av adapter som er identisk med spaltningsproduktet for det foregående trinnet (dvs. den "spaltede kassetten" i panel III), og en passende selektiv omvendt primer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig9large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Tabell 1: Primerer som brukes i NlaIV engineering. Sekvenser av begrensningsstedene som er nevnt i kommentarene, understrekes. Små bokstaver indikerer sekvenser som ikke har komplementer i DNA-malene. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/table1.xlsx" target="_blank">Vennligst klikk her for å se denne tabellen (Høyreklikk for å laste ned).</a>
Tabell 2: Betingelser for PCR-reaksjoner som skal brukes i protokollen. Tm = primer smeltetemperatur (hvis Tm er forskjellig for primere, bør den nedre Tm brukes). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/table2.xlsx" target="_blank">Vennligst klikk her for å se denne tabellen (Høyreklikk for å laste ned).</a>
Tabell 3: Resultater av kvalitetskontroll av to mutogene primere syntetisert med split-and-mix strategi. Mutageniserte kodoner er angitt med [XXX]. Et lavere indekstall indikerer posisjonen til en kodet aminosyre. Tilpasset fra Czapinska et al.8 med tillatelse fra Elsevier. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/table3.xlsx" target="_blank">Vennligst klikk her for å se denne tabellen (Høyreklikk for å laste ned).</a>
Tabell 4: Resultater fra EP-PCR. Hovedparametere avledet fra sekvensanalyse av 22 kloner av ECS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/table4.xlsx" target="_blank">Vennligst klikk her for å se denne tabellen (Høyreklikk for å laste ned).</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Directed Evolution of a Restriction Endonuclease with More Stringent Specificity at JoVE.com

In Vitro Directed Evolution of a Restriction Endonuclease with More Stringent Specificity

Begrensning endonucleases med ny sekvens spesifisitet kan utvikles fra enzymer gjenkjenne en delvis degenerert sekvens. Her gir vi en detaljert protokoll som vi med hell brukte til å endre sekvensspesifisiteten til NlaIV-enzymet. Viktige ingredienser i protokollen er in vitro compartmentalization av transkripsjon / oversettelse reaksjon og valg av varianter med nye sekvens spesifisiteter.

In Vitro rettet utviklingen av en restriksjon endonuclease med strengere spesifisitet

Restriction endonuclease (REase) specificity engineering is extremely difficult. Here we describe a multistep protocol that helps to produce REase ...

Vår protokoll gjør det mulig å opprette begrensningsenzymer med endrede, strengere sekvensspesifisiteter ved hjelp av in vitro compartmentalization og en unik utvalgsstrategi i rettet evolusjon. Potensielt er det ganske universelt, da det bør gjelde for enhver begrensning endonuclease og valg kan rettes mot en strengere versjon av en original cognate sekvens. Hvis nyopprettede varianter uttrykkes ved in vitro transkripsjon-oversettelse, er protokollen egnet ikke bare for å begrense spesifisitet, men også for å endre spesifisitet.Hvis du vil bestemme områder for undermetning mutagenesis, velger du mutagenesis frekvenser i henhold til den hypotetiske betydningen av nettstedene, holde grenser for den generelle biblioteket kompleksitet i tankene. Hvis du vil starte syntesen, setter du inn kolonner som er pakket med ny harpiks i synthesizeren. Syntetisere oligonucleotides i alle kolonner opp til trillingen, rett før den andre subsaturation mutagenesis området teller fra tre-prime slutten.Syntetisere, forlater en fem-prime trityl gruppe på slutten. Beskyttelsesgruppen vil bli fjernet i begynnelsen av neste syntesesyklus. Åpne syntesesøylene og sentrifuger i tørre 1,5 milliliter rør for å samle harpiksen.Trekk cpg syntesestøtten og bland ved å virvle. Partisjoner den blandede CPG-harpiksen på nytt i nye syntesespalter. Unngå å innføre fuktighet fordi det vil redusere det totale utbyttet.Fortsett syntesen, fra undermetningen mutagenesis området trilling. Tilordne kolonner til randomiserte NNS-trillinger eller wild-type trillinger i henhold til ønsket mutagenesefrekvens. Hvis det finnes flere undermetningsområder, går du bare videre til trillingen foran neste område for dedemagenese for undermetning.Hvis det ikke finnes flere undermetningsområder nedstrøms, fullfører du syntesen, slik at en fem-prime tritylgruppe på slutten. Bruk brede pipettespisser til å lage en oljeveksom blanding ved å tilsette 225 mikroliter span 80 og 25 mikroliter Tween 80 til fem milliliter mineralolje i et konisk rør på 15 milliliter. Bland godt ved skånsom inversjon 15 ganger.Blandingen på dette trinnet skal være gjennomskinnelig. For hvert bibliotek, overfør 950 mikroliter av olje overflateaktivt middel blanding til en to milliliter rund bunn kryogent hetteglass. Merk med et biblioteknavn og overfør til is.Sett en liten sylindrisk rørestang i hvert hetteglass. Forbered en in vitro transkripsjon-oversettelsereaksjonsblanding i henhold til produsentens forslag. Supplere blandingen med magnesiumklorid til en endelig konsentrasjon på 1,5 millimolar.Dispenser 50 mikroliter aliquots av reaksjonsblandingen i 1,5 milliliter rør på is. Tilsett 1,7 femtomoler av biblioteket til reaksjonsblandingen på is. Forbered vann-i-olje emulsjon fortløpende for hvert bibliotek ved først å plassere et lite beger fylt med is på en magnetisk rørerører med omrøringshastigheten satt til 1150 RPM.Overfør deretter et kryogent hetteglass med 950 mikroliter oljesurfeaktivt blanding og en liten rørebar til et iskaldt beger på den magnetiske røreren. Kontroller at rørestangen spinner. Tilsett fem 10-mikroliter aliquots av in vitro bibliotek transkripsjon-oversettelse blanding over en to-minutters periode i 30 sekunders intervaller og fortsette å røre i et ekstra minutt.Overfør hetteglasset med emulsjonen til en isbeholder. På dette punktet bør væsken være ugjennomsiktig, ikke gjennomsiktig. Fortsett deretter med neste bibliotek.Når alle bibliotekene er behandlet, starter du inkubasjonen av alle bibliotekene i henhold til kit produsentens anbefalinger. Overfør hetteglassene til den optimale temperaturen for den konstruerte endonukleæren i ytterligere to timer før du plasserer dem på is i minst 10 minutter. Overfør emulsjonene fra kryogene hetteglass til 1,5 milliliter rør.Tilsett en mikroliter på 5 molar EDTA. Og sentrifuge dem på 13, 000 ganger g i fem minutter ved romtemperatur. Hvis du etter sentrifugering ikke kan se vannoljegrensesnittet tydelig, frys blandingen før aspirasjon av den øvre oljefasen.Flytt den øvre oljefasen med en pipette og kast. Utfør umiddelbart ekstraksjon ved å legge til 150 mikroliter fenolklorform og 100 mikroliter på 10 millimolar Tris-HCl i vandig fase. Vortex og utfør deretter faseseparasjon via 30-sekunders sentrifugering ved 13 000 ganger g.Samle den øvre vandige fasen. Utfell DNA ved å legge til 15 mikroliter tre-molarnatriumacetat, 2,5 til fem mikrogram glykogen og 375 mikroliter etanol. Etter inkubering av prøvene ved minus-20 grader Celsius i en time, sentrifuge i 15 minutter ved 13,000 ganger g, fire grader Celsius.Kast den overnaturlige og vask pelleten kort med en milliliter kald 70% etanol. Tørk DNA glykogenpellet i en hastighetsvac eller lufttørker i mer enn fem minutter. Oppløs deretter pelleten i 50 mikroliter på 10 millimolar Tris-HCl.Deretter legger du til fem mikroliter streptavidin magnetiske perler, tilberedt i henhold til produsentens instruksjoner. Bland i en time ved romtemperatur, helst i en karusellblander eller ved mild vortexing. Overfør rørene til et magnetisk stativ for å skille perlene.Deretter samler væsken beriket i DNA uten biotin. Denne protokollen er et verktøy for å øke frekvensen av ønskede varianter av konstruert begrensning endonucleases ved å tømme inaktive enzymer og endonucleases med uendret vill-type sekvens spesifisitet. Vellykket screening kan identifisere opptil 20 % av lovende varianter.Varianter er merket som lovende varianter hvis de produserer et spaltingsmønster forskjellig fra wild-type enzymet. Varianter som kan ha endret sekvensinnstillingen, er også merket. Vist her er en mislykket screening med flertallet av varians inaktiv og en variant med tilsynelatende uendret cleavage mønster.I dette tilfellet er bibliotekene mest sannsynlig dominert av inaktive varianter som unnslapp streptavidin fangst utvalg trinn. Det er avgjørende å nøye utforme de valgte og motvalgte sekvensene og begrense bibliotekmangfoldet ved mutagenesestrategi som genererer erstatninger i bare noen få utvalgte stillinger. De beste variantene som velges bør karakteriseres grundig for binding og spalting kinetikk på foretrukne og ikke spaltede sekvenser basert på resultatene fra den første screeningen.I vårt test tilfelle ble mutagenesis nettsteder valgt basert på en homologimodell. Overraskende, en krystallstruktur senere viste at noen endrede rester er mest sannsynlig ikke i direkte kontakt med DNA.

Research

JoVE Journal

Genetics

Design and Use of a Low Cost, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution of Bacteria Under Antibiotic Drug Selection

Design og bruk av en lav pris, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution of Bakterier Under Antibiotika Drug Selection

We describe a low cost, configurable morbidostat for characterizing the evolutionary pathway of antibiotic resistance. The morbidostat is a bacterial ...

Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat

Prosedyre for Adaptive Laboratory Utviklingen av mikroorganismer ved hjelp av en kjemostat

Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) ...

Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development

Genome Redigering og Regissert Differensiering av hPSCs for Henting Lineage Determinanter i Human bukspyttkjertelen Development

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding ...

Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans

Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans

Kvantifisering av informasjonen kodet av Gene Expression nivåer under levetid modulering Under bredt kosttilskudd restriksjon i C. elegans

Sensory systems allow animals to detect, process, and respond to their environment. Food abundance is an environmental cue that has profound effects on ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generering av en gen-forstyrret Streptococcus mutans belastning uten Gene kloning

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Testing the Role of Multicopy Plasmids in the Evolution of Antibiotic Resistance

Testing Multicopy plasmider rolle i utviklingen av antibiotikaresistens

Multicopy plasmids are extremely abundant in prokaryotes but their role in bacterial evolution remains poorly understood. We recently showed that the ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Genomet hele overvåking av transkripsjon feil i eukaryote organismer

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

Produsere Gene slettingene i Escherichia coli av P1 signaltransduksjon med Excisable antibiotikaresistens kassetter

A first approach to study the function of an unknown gene in bacteria is to create a knock-out of this gene. Here, we describe a robust and fast protocol ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

Bruke i Vitro og i celle form å undersøke små molekyl indusert Pre-mRNA strukturelle endringer

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Using Sniper-Cas9 to Minimize Off-target Effects of CRISPR-Cas9 Without the Loss of On-target Activity Via Directed Evolution

Bruke Sniper-Cas9 å minimere Off-målet effekter av CRISPR-Cas9 uten tap av på målet aktivitet Via regissert evolusjon

The development of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated protein 9 (Cas9) into therapeutic modalities requires the ...