Name: in vitro directed evolution of a restriction endonuclease with more stringent specificity
Uploaded: 2020-03-25T15:00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Directed Evolution of a Restriction Endonuclease with More Stringent Specificity at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelas bolsas do Ministério da Ciência e Ensino Superior (0295/B/PO1/2008/34 ao MB e N301 100 31/3043 à KS), do Centro Nacional de Ciência da Polônia (NCN) (UMO-2011/02/A/NZ1/00052, UMO-2014/13/B/NZ1/03991 e UMO-2014/14/M/NZ5/00558 à MB) e por bolsa EMBO de curto prazo à KS (ATSF 277.00-05).

<ol>
	<li>Sch&#246;ttler, S., Wenz, C., Lanio, T., Jeltsch, A., Pingoud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+engineering+of+the+restriction+endonuclease+EcoRV--structure-guided+design+of+enzyme+variants+that+recognize+the+base+pairs+flanking+the+recognition+site.">Protein engineering of the restriction endonuclease EcoRV--structure-guided design of enzyme variants that recognize the base pairs flanking the recognition site.</a> European Journal of Biochemistry. 258 (1), 184-191 (1998).</li><li>Wenz, C., Hahn, M., Pingoud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+variants+of+the+restriction+endonuclease+EcoRV+that+depend+in+their+cleavage+activity+on+the+flexibility+of+sequences+flanking+the+recognition+site.">Engineering of variants of the restriction endonuclease EcoRV that depend in their cleavage activity on the flexibility of sequences flanking the recognition site.</a> Biochemistry. 37 (8), 2234-2242 (1998).</li><li>Samuelson, J. C., Xu, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+restriction+endonuclease+BstYI+to+achieve+increased+substrate+specificity.">Directed evolution of restriction endonuclease BstYI to achieve increased substrate specificity.</a> Journal of Molecular Biology. 319 (3), 673-683 (2002).</li><li>Samuelson, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+a+rare-cutting+restriction+enzyme:+genetic+screening+and+selection+of+NotI+variants.">Engineering a rare-cutting restriction enzyme: genetic screening and selection of NotI variants.</a> Nucleic Acids Research. 34 (3), 796-805 (2006).</li><li>Rimseliene, R., Maneliene, Z., Lubys, A., Janulaitis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+restriction+endonucleases:+using+methylation+activity+of+the+bifunctional+endonuclease+Eco57I+to+select+the+mutant+with+a+novel+sequence+specificity.">Engineering of restriction endonucleases: using methylation activity of the bifunctional endonuclease Eco57I to select the mutant with a novel sequence specificity.</a> Journal of Molecular Biology. 327 (2), 383-391 (2003).</li><li>Morgan, R. D., Luyten, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+engineering+of+type+II+restriction+endonuclease+DNA+binding+and+cleavage+specificity.">Rational engineering of type II restriction endonuclease DNA binding and cleavage specificity.</a> Nucleic Acids Research. 37 (15), 5222-5233 (2009).</li><li>Skowronek, K., Boniecki, M. J., Kluge, B., Bujnicki, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+engineering+of+sequence+specificity+in+R.MwoI+restriction+endonuclease.">Rational engineering of sequence specificity in R.MwoI restriction endonuclease.</a> Nucleic Acids Research. 40 (17), 8579-8592 (2012).</li><li>Czapinska, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+Structure+and+Directed+Evolution+of+Specificity+of+NlaIV+Restriction+Endonuclease.">Crystal Structure and Directed Evolution of Specificity of NlaIV Restriction Endonuclease.</a> Journal of Molecular Biology. 431 (11), 2082-2094 (2019).</li><li>Miller, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+by+in+vitro+compartmentalization.">Directed evolution by in vitro compartmentalization.</a> Nature Methods. 3 (7), 561-570 (2006).</li><li>Zheng, Y., Roberts, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+restriction+endonucleases+using+artificial+cells.">Selection of restriction endonucleases using artificial cells.</a> Nucleic Acids Research. 35 (11), e83 (2007).</li><li>Takeuchi, R., Choi, M., Stoddard, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redesign+of+extensive+protein-DNA+interfaces+of+meganucleases+using+iterative+cycles+of+in+vitro+compartmentalization.">Redesign of extensive protein-DNA interfaces of meganucleases using iterative cycles of in vitro compartmentalization.</a> Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 111 (11), 4061-4066 (2014).</li><li>Howland, J. L., Ausubel, F., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Short Protocols in Molecular Biology. , (1995).</li><li>Wilson, D. S., Keefe, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+8+Unit+8.3:+Random+mutagenesis+by+PCR.">Chapter 8 Unit 8.3: Random mutagenesis by PCR.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (2001).</li></ol>

Os autores não têm nada para revelar.

O protocolo de seleção descrito aqui foi testado para NlaIV8, uma seqüência de reconhecimento de dobra pd-(D/E)XK dimérica que reconhece um local de destino palindômico com bases nn centrais e catalisa um corte de extremidade sem corte entre as bases NN. NlaIV foi escolhido porque o decote entre as bases NN sugere que essas bases estão próximas da proteína no complexo. Em princípio, o protocolo pode ser usado para qualquer seqüência específica de restrição endonuclease, monomérica ou dimeric, de qualquer grupo dobrável, catalisando quebras duplas de fios de qualquer cambalhota, independentemente de os domínios catalíticos e de especificidade coincidirem (como no exemplo NlaIV) ou são separados (por exemplo, FokI). Além disso, o protocolo em princípio é útil não apenas para a geração de novas especificidades enzimáticas mais estreitas, mas também poderia ser usado para eliminar atividades estelares, ou para criar endonucleases de alta fidelidade. No entanto, tudo isso ainda não foi testado. Em particular, a eliminação direcionada da atividade estelar pode ser complicada, porque os mesmos resíduos de aminoácidos podem estar envolvidos na ligação às bases desejadas e indesejadas. As etapas in vitro descritas neste protocolo não se limitam à seleção de especificidades reduzidas, mas também podem ser usadas para selecionar especificidades alteradas de outra forma. No entanto, há então um problema com endonucleases variantes: se o espectro de substratos inclui novos alvos não cortados pela endonuclease parental, não há, em geral, uma boa maneira de proteger as células dos efeitos nocivos dessa atividade. Em contraste, se a especificidade da endonuclease for reduzida apenas, os alvos são um subconjunto dos alvos do tipo selvagem e, portanto, o cognato metiltransferase já disponível deve ser totalmente protetor.
Nosso protocolo difere em vários aspectos de muitos protocolos de evolução direcionados. A diversidade de quadros de leitura aberta é gerada uma vez no início do experimento, não em todas as iterações. Além disso, é criado por síntese split-and-mix, em vez de por EP-PCR. Para substituições nns de códons, como usado neste trabalho, há (4 x 4 x 2)6 ~ 1,07 x 109 combinações para seis posições. Portanto, qualquer variante está presente em média uma vez em 1,7 fmoles de ESC. Essa capacidade pode ser aumentada para sete posições usando a síntese com uma mistura de 20 precursores trinucleotídeos que é oferecida pela Glen Research ou diminuindo a frequência de mutação em posições menos promissoras com síntese de oligonucleotídeos split-and-mix. Se possível, recomenda-se limitar a extensão da variação a seis posições. Obviamente, tal alvo de mutagênese requer algum conhecimento preexistente sobre pelo menos as regiões da REase envolvidas na ligação do substrato. O protocolo split-and-mix para gerar diversidade tem claras vantagens em comparação com o EP-PCR. Utilizando EP-PCR, obtivemos variantes e seqüências inalteradas que carregam oito substituições para ESCs NlaIV no mesmo EP-PCR (Tabela 4). A biblioteca do EP-PCR contém uma fração substancial de clones que devem ser evitados (seqüências de tipo selvagem, múltiplas substituições, frameshift e mutações sem sentido, e mutações em lugares improváveis de afetar a especificidade da seqüência).
Nosso protocolo também difere de muitos outros protocolos de evolução direcionados pela presença de duas etapas de seleção sequencial. A seleção positiva garante que a atividade desejada seja retida, caso contrário, a etiqueta de biotina não será removida e a seqüência de codificação pode ser removida por pull-down. É tecnicamente possível que o surgimento fortuito de uma especificidade nova e não sobreposta (por exemplo, GCATGC) possa levar ao severção da etiqueta de biotina também, se um local de decote adequado estiver presente perto do decote desejado, mas não em outro lugar. No entanto, isso deve ser altamente improvável. A seleção negativa remove quadros de leitura abertos que codificam enzimas que ainda têm a atividade indesejada. Esta etapa não é estritamente obrigatória, pois o protocolo ainda enriquecerá a biblioteca de saída com variantes que são capazes de cortar a seqüência de seleção, mas não são capazes de cortar em outros lugares do ESC, tornando-a inadequada para amplificação pcr. No entanto, espera-se que a eficácia da seleção seja menor porque as enzimas com a especificidade da seqüência original não serão removidas da saída e superarão as variantes promissoras com especificidade alterada, mas também diminuírão a atividade enzimática. Note que, no nível populacional, tanto as seqüências de alvo desejadas quanto indesejadas podem, mas não precisam ser, degeneradas. No exemplo nlaiv, o anti-alvo era degenerado e o alvo não degenerado. Mesmo quando há degeneração no nível populacional, em uma única gotícula apenas um alvo (não degenerado) ou anti-alvo está presente. Em nosso protocolo, seqüências de alvo e anti-alvo são reintroduzidas a cada repetição das etapas de seleção. Portanto, um quadro de leitura aberto deve codificar uma enzima capaz de cachar todos os alvos possíveis, e incapaz de cachar qualquer um dos anti-alvos, para sobreviver a múltiplas rodadas de seleção. Observe que a necessidade de reintroduzir a meta de antisseleção em cada iteração do protocolo impõe dois PCRs seqüenciais. O primeiro PCR usa um primer que anneals fora do anti-alvo, de modo que o decote do anti-alvo previne a reação pcr. O segundo PCR requer um primer que ultrapasse o anti-alvo, e reintroduz o anti-alvo, para garantir que durante várias rodadas de seleção, cada quadro de leitura aberto seja testado contra todas as variantes do anti-alvo.
Para enzimas que geram extremidades pegajosas, um protocolo alternativo relacionado baseado em um método previamente descrito para o isolamento do REase ORF10 pode ser usado. O esgotamento das variantes inativas pela captura de biotina que é usada em nossos experimentos é substituído no protocolo alternativo pela ligadura do adaptador compatível com uma seqüência que é usada como um local de ligação de primer em um PCR seletivo(Figura 9). Apenas AS ESCs que produzem enzimas com a especificidade selecionada geram extremidades capazes de ligadura e, portanto, serão selecionadas. A seqüência da extremidade pegajosa da seqüência eselecionada do contador deve ser projetada de tal forma que não possa participar da ligadura com adaptadores. A iteração do processo de seleção pode ser facilmente alcançada alternando entre dois adaptadores diferentes e, consequentemente, dois primers reversos diferentes em PCR seletivo.
Mesmo com novos protocolos, a tarefa de criar novas especificidades in vitro ainda é muito desafiadora. Para as reases do tipo II típicas, a especificidade da seqüência e a atividade endonucleolítica dependem das mesmas regiões proteicas. É, portanto, difícil alterar um sem afetar o outro. O sucesso é mais provável por uma estratégia que leva em conta a pegada da enzima, respeita a simetria das interações proteína-DNA e se baseia em preferências enzimáticas pré-existentes, que devem ser determinadas antecipadamente em experimentos bioquímicos, como foi feito para o exemplo NlaIV8.

A engenharia de especificidade de seqüência é extremamente desafiadora para rEases classe II. Nesta classe de endonucleases, o reconhecimento de seqüências e a catálise estão intimamente entrelaçados, provavelmente como uma salvaguarda evolutiva contra a criação de uma endonuclease de especificidade mais ampla do que sua metiltransferência de cognato, o que danificaria o DNA do hospedeiro. A evolução dirigida de novas especificidades nas células é ainda mais complicada pela necessidade de proteger o DNA do hospedeiro contra a atividade de endonuclease recém-projetada. Portanto, há apenas algumas tentativas bem sucedidas de engenharia REase relatadas e todas elas exploram as características únicas de uma enzima particular1,,2,,3,4,5,6,7.
Aqui fornecemos um protocolo detalhado para engenharia de especificidade que pode ser usado para gerar variantes de endonuclease que têm especificidade mais estreita do que uma enzima parental que se baseia em nossa engenharia bem sucedida de endonuclease NlaIV8. Para qualquer enzima com uma seqüência de reconhecimento arbitrário, uma especificidade extra pode ser introduzida para bases nos flancos. Para enzimas parentais que reconhecem sequências parcialmente degeneradas (como NlaIV com seu alvo GGNNCC), uma especificidade adicional também pode ser introduzida dentro da seqüência de reconhecimento. Como a especificidade extra provavelmente exigirá contatos de Proteína-DNA, as bases recém-reconhecidas devem estar dentro da pegada da endonuclease parental no DNA. Em princípio, os esquemas de seleção podem ser configurados para qualquer especialização desejada da seqüência de reconhecimento. No entanto, a maioria dos REases que reconhecem sequências de alvo palindômicas e quase palindômicas são dimers funcionais que reconhecem apenas um meio-local do palíndromo. Assim, é improvável que a seleção de novas especificidades que violem a simetria das interações nucleicas proteicas funcione. Para o NlaIV dimérico, por exemplo, a seqüência GGNNCC pode teoricamente ser reduzida ao GGATCC, mas reduzir a especificidade para GGAACC é esperado ser mais difícil. Nosso esquema envolve seleção positiva e negativa.
O processo é mais eficiente quando a seleção negativa também é usada para remover as especificidades capazes de cirizar todas as seqüências que não a especificidade mais estreita preferida. Por exemplo, a seleção para GGATCC pode ser combinada com antisseleção contra GGBVCC (onde B é qualquer base diferente de A, e V é qualquer base diferente de T). Quando algumas das possíveis seqüências de alvo não são cobertas, o resultado do experimento de seleção depende da eficácia da seleção positiva e negativa. Em nosso trabalho nlaIV, selecionamos para GGATCC, e contra GGSSCC (onde S é G ou C), e obtivemos uma especificidade que, ignorando metas de quebra de simetria, poderia ser descrita como GGWWCC (onde W é A ou T), sugerindo que neste caso específico, a seleção negativa era mais importante do que a seleção positiva.
Nossa abordagem começa com a criação de um de seleção de expressão (ESC). O ESC está estruturado em seções. Na seção interna do núcleo, há variantes do quadro de leitura aberta (ORF) do REase, o controle do promotor T7. Esta seção central do ESC não pode conter qualquer local cognato para o REase projetado. O núcleo é sanduíche entre dois locais cognatos para o tipo selvagem REase: um site de decote para a atividade indesejada (seqüência de contador selecionado, GGSCCneste exemplo) e um site de decote para a atividade desejada (seqüência selecionada, GGATCC no exemplo). A etapa final da preparação do ESC em PCR adiciona biotina próxima à atividade desejada no final de 5' e cria uma variedade de seqüências de contra-selecionados (GGSSCC no exemplo). A estratégia de seleção baseia-se no uso de primers cuidadosamente projetados no protocolo de reamplificação ESC após um protocolo de transcrição/tradução/seleção in vitro(Figura 1A). A biblioteca ESC é expressa em uma transcrição compartimentalizada in vitro tradução água-em-óleo emulsão9,10,11. Dentro de cada gotícula, a especificidade da enzima expressa afeta o estado da ESC (Figura 1B, passo I). Para o arranjo descrito, a atividade desejada de decote da proteína traduzida remove a etiqueta de biotina do DNA, mas não afeta a outra extremidade ESC com a seqüência do contador selecionado. Quando a emulsão é quebrada, fragmentos biotinylados são removidos por streptavidin affinity pulldown, de modo que apenas fragmentos de gotículas com a atividade desejada permanecem (Figura 1B, passo II). Esta etapa remove variantes REase inativas. A fração sobrenadante do passo pull-down é então amplificada por PCR. Nas primeiras revezas pcr são utilizados os primers F2 e R1 (Figura 1A,B, passo III). O primer F2 liga-se à seção ESC entre a seqüência do contador selecionada e a extremidade da molécula. Portanto, os ESCs que expressam variantes capazes de afiar a seqüência de contador selecionado (e, portanto, separar os locais de ligação para primers F2 e R1 em duas moléculas de DNA diferentes) não são amplificados e são assim removidos da biblioteca. O primer R1 se liga entre o local selecionado e o núcleo do ESC para que ele não seja afetado pelo status do decote do local selecionado e restaure o local do decote para a atividade desejada (GGATCC). O ciclo é fechado por um segundo PCR (com primers F1 e R2) que adiciona biotina na extremidade de 5' perto do local selecionado e restaura a variação projetada no balcão selecionado local próximo à extremidade oposta do ESC (Figura 1B, passo IV). A mistura de DNA resultante está pronta para outra rodada de seleção.
O sucesso do protocolo de seleção depende fortemente da escolha adequada da nova e mais rigorosa seqüência de reconhecimento de alvo e do design cuidadoso da estratégia de mutagênese e sua implementação eficaz. Como é muito mais fácil melhorar as preferências preexistentes do REase do que superá-las, recomendamos começar com um estudo cinético de quaisquer preferências pré-existentes. A necessidade de um design de mutagênese cuidadoso resulta do tamanho limitado de uma biblioteca mutante que pode ser processada pelo protocolo apresentado (109 clones em um único experimento). Portanto, todas as 20 possíveis substituições de aminoácidos podem ser efetivamente testadas em apenas algumas posições (ver Discussão). Mutagêneses aleatórias, como pcr propenso a erros (EP-PCR) apresentados como um método alternativo, levarão a uma profunda subamostragem da complexidade existente. Se alguma informação sobre potenciais posições de aminoácidos envolvidas em contatos com DNA (ou mesmo localizada em uma proximidade com os nucleotídeos degenerados em uma seqüência de cognato) certamente deve ser usada para selecionar alguns aminoácidos para saturação guiada por oligonucleotídeos mutagênese (passos de protocolo 1.6-3.10).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1000&#197; CPG Support (dA, dT, dC, dG)</td>
			<td>Biosset</td>
			<td>45-1000-050</td>
			<td>Other vendors can be used as well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ASM-800 DNA/RNA</td>
			<td>Biosset</td>
			<td>800-001-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJET Gel Extraction Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K0691</td>
			<td>Any other kit can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glen-Pak DNA purification cartridge</td>
			<td>Glen Research</td>
			<td>60-5200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIS-Select Nickel Affinity Gel</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET 28a vector</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any other vector with T7 promoter upstream of plycloning site can be used instead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td>Any other high fidelity and highly processive thermophilic polymearse can be used instead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porous steel foil</td>
			<td>Biosset</td>
			<td>40-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid Translation System 
			RTS 100, E.coli HY Kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3 186 148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction endonucleases</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Obviously other vendors, enzymes can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Magnetic Beads</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>S1420S</td>
			<td>Other vendors can be used as well. We have positively tested beds form Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthesis chemicals including phosphoramidities</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td></td>
			<td>Other vendors can be used as well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthesis columns (different sizes)</td>
			<td>Biosset</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EL0011</td>
			<td>Any other ligase can be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro directed evolution of a restriction endonuclease with more stringent specificity

A engenharia de especificidade de endonuclease de restrição (REase) é extremamente difícil. Aqui descrevemos um protocolo multipasso que ajuda a produzir variantes REase que têm especificidade mais rigorosa do que a enzima parental. O protocolo requer a criação de uma biblioteca de de seleção de expressão (ESCs) para variantes do REase, idealmente com variabilidade em posições susceptíveis de afetar a ligação de DNA. O ESC é flanqueado de um lado por uma seqüência para a atividade do local de restrição desejada e uma etiqueta de biotina e do outro lado por um local de restrição para a atividade indesejada e um local de recozimento de primer. Os ESCs são transcritos e traduzidos em uma emulsão de água no óleo, em condições que tornam improvável a presença de mais de uma molécula de DNA por gota. Portanto, o DNA em cada molécula é submetido apenas à atividade da enzima traduzida e codificada. As variantes REase da especificidade desejada removem a etiqueta de biotina, mas não o local de recozimento do primer. Após a quebra da emulsão, as moléculas de DNA são submetidas a uma retração de biotina, e apenas as do sobrenadante são retidas. Esta etapa garante que apenas ESCs para variantes que não perderam a atividade desejada sejam mantidos. Essas moléculas de DNA são então submetidas a uma primeira reação de PCR. O decote na seqüência indesejada corta o local de ligação do primer para um dos primers. Portanto, o PCR amplifica apenas ESCs de gotículas sem a atividade indesejada. Uma segunda reação de PCR é então realizada para reintroduzir o local de restrição para a especificidade desejada e a tag de biotina, para que a etapa de seleção possa ser reiterada. Quadros de leitura abertos selecionados podem ser superexpressos em células bacterianas que também expressam a metiltransferência de cognato do REase parental, porque o REase recém-evoluído tem como alvo apenas um subconjunto dos locais-alvo da metiltransferase.

Este protocolo é apenas uma ferramenta para aumentar a freqüência de variantes desejadas de um REase projetado, esgotando (mas não eliminando) duas classes indesejadas: enzimas inativas e endonucleases com especificidade de seqüência de tipo selvagem inalterada. Por outro lado, como mudar a especificidade do REase é extremamente difícil, encontrar até mesmo uma dessas variantes produzindo um padrão de decote diferente da enzima do tipo selvagem em uma única triagem de 24 clones deve ser considerado um sucesso. Em nossas mãos, as melhores telas poderiam identificar até 20% das variantes promissoras(Figura 8A).
O resultado positivo depende fortemente de uma qualidade de biblioteca (ou seja, frequência limitada de substituições e sua distribuição aleatória) e captura eficiente da população biotinylated de membros da biblioteca (passos 3.6-3.7). Ambos os problemas podem ser detectados. A qualidade da biblioteca deve ser verificada antes da seleção sequenciando o maior número possível de clones (>15) ou por sequenciamento direto da biblioteca por sequenciamento de alto throughput (etapa 3.10, Tabela 3). Se a maioria dos clones selecionados não estiver ativa, esta é uma clara indicação de falha na seleção de captura de streptavidin. Um efeito semelhante é observado no caso de bibliotecas que passam por muitos ciclos de seleção, pois essas bibliotecas são provavelmente dominadas por variantes inativas que escaparam da etapa de seleção de captura de streptavidin(Figura 8B). Portanto, é aconselhável executar a triagem após cada ciclo de seleção e desenvolver variantes promissoras selecionadas manualmente em vez de depender da iteração de seleção.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig1.jpg"> Figura 1: Seleção in vitro de uma nova especificidade de seqüência baseada na engenharia NlaIV. (A) A organização do de expressão/seleção (ESC) inclui dois locais de reconhecimento para REase, 1) a seqüência selecionada (GGATCC) perto da extremidade direita e 2) a seqüência de contador selecionada (GGSSCC) perto da extremidade esquerda, bem como o promotor T7p e T7t-T7 e o exterminador T7t-T7. Os locais de ligação do primer são mostrados abaixo. O decote por tipo selvagem e as variantes NlaIV selecionadas são mostrados como triângulos vermelhoe verde, respectivamente. (B) Etapas do ciclo de seleção: I) Emulsificação das misturas de reação transcrição-tradução-decote com a biblioteca ESC; II) Todo DNA biotinylado é capturado em partículas magnéticas revestidas com streptavidin e removidas, removendo assim variantes inativas codificadoras; III) As ESCs que codificam REases com atividade do tipo selvagem (ou seja, aquelas capazes de cira da seqüência GGSSCC) são eliminadas porque o decote da seqüência separa os locais de ligação para os primers para frente e para trás. Portanto, não ocorre a ampliação dessas ESCs; IV) A entrada para a próxima rodada de seleção é criada pela adição de biotina na extremidade direita e reintrodução da variação das seqüências do contador selecionado na extremidade esquerda. Reimpresso de Czapinska et al.8 com permissão da Elsevier. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig2.jpg"> Figura 2: Preparação de ESC. Fragmento derivado do construto original em um vetor de expressão contendo NlaIV ORF sob controle do promotor T7 foi modificado para ser adequado para expressão/seleção. O site NlaIV a jusante do ORF NlaIV foi removido e locais únicos (SalI, EcoRI e Eco52I) que foram usados para mutagenizar posições selecionadas foram introduzidos no ORF NlaIV como mutações silenciosas. A construção final foi amplificada com primers de flanqueamento que introduziram dois locais de NlaIV flanqueando: a seqüência de contador selecionado (GGSSCC) à esquerda e seqüência selecionada (GGATCC) à direita. O primer reverso também introduziu a biotina. Os primers usados na criação de ECS mutados são mostrados como setas azuis e rotulados abaixo (ver Tabela 1B,C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig3.jpg"> Figura 3: Esquema de síntese de divisão e mistura. O exemplo refere-se à síntese de primer MutB onde uma seqüência NNS foi introduzida em freqüência de 0,8 em quatro posições (ver também Tabela 3). Note que a síntese química é realizada de 3' a 5', mas todas as seqüências são mostradas na orientação canônica de 5'-3' (ou seja, prossegue da direita para a esquerda neste esquema). Sequências de tipo selvagem em posições mutagenizadas são mostradas em verde, enquanto seqüências mutagênicas NNS estão em vermelho. O site de reconhecimento SalI que mais tarde é usado para introduzir mutações em ESCs é sublinhado. São indicados pontos de mistura e divisão (2 e 4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig4.jpg"> Figura 4: Uso de locais de enzimas de restrição únicas em mutagêneses direcionadas ao oligonucleotídeo. A estratégia de introdução de mutação é mostrada em um exemplo da construção de bibliotecas A-C (ver passos 3.1-3.7). Reimpresso de Czapinska et al.8 com permissão da Elsevier. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig5.jpg"> Figura 5: Decote endonucleolítico em tradução de transcrição in vitro. (A) Decote de um substrato de teste no buffer REase ideal: 1) Substrato, produto PCR de 612 bp com um único local de reconhecimento NlaIV; 2) Produtos de decote, 355 bp e 257 bp.(B) Decote em uma reação in vitro de tradução de transcrição (contendo 0,5 μg de ESC): 1-2) alíquotas de 15 μL de tradução in vitro de transcrição sem substrato (linha 2: reação complementada com 1,5 mM MgCl2); 3-4) alíquotas de 15 μL de tradução de transcrição in vitro com 1 μg de substrato de ensaio; (linha 4: reação complementada com 1,5 mM MgCl2). Marcador de tamanho de S-DNA (pBR322 digerido com MspI). As amostras foram resolvidas em 6% de PAGE nativo. DNA foi manchado com brometo de etídio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig6.jpg"> Figura 6: Produtos do primeiro PCR no ciclo de seleção. Ver Figura 1B, etapa III; passo de protocolo 5.10. Os conjuntos de colunas 1 e 2 são alíquotas de duas bibliotecas diferentes carregadas em triplicado. Padrão de tamanho de S-DNA (DNA lambda digerido com HindIII e EcoRI). A seta indica a posição do ESC de comprimento completo (1.050 bp). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig7.jpg"> Figura 7: Variantes NlaIV purificadas para posterior triagem em mini escala. Veja o passo 6.3.11. Cada linha contém uma alíquota de 10 μL de uma variante diferente. Padrão de peso molecular de proteína S. A massa molecular da subunidade NaIV REase é de 29,9 kDa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig7large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig8.jpg"> Figura 8: Exemplos de triagem de variantes NlaIV para alteração de especificidade da seqüência. Veja o passo 6.4.2. (A)Triagem bem sucedida com alta frequência de variantes promissoras. S = Marcador de tamanho de DNA, DNA lambda com HindIII e EcoRI; tipo selvagem (wt) = DNA lambda com nlaIV tipo selvagem; λ = substrato de DNA lambda, não cortado; outras colunas=variantes com atividade muito baixa. Variantes são rotuladas ! = variantes promissoras que produzem um padrão de decote distinto da enzima do tipo selvagem; ? = variantes que também podem ter alterado a preferência de seqüência. (B) Triagem mal sucedida, com uma maioria de variantes inativas e uma variante com padrão de decote aparentemente inalterado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig8large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig9.jpg"> Figura 9: Seleção alternativa por ligadura. Esta alternativa pode ser usada para todos os REases gerando extremidades pegajosas. Aqui apresentamos um protocolo de exemplo para um esquema de seleção de enzima SéI (inédito). I) Seqüência selecionada (localizada na extremidade direita do ESC) com resíduos definidos mostrados em vermelho e variação selecionada da seqüência cognato mostrada em azul. Entre parênteses abaixo, é mostrada a seqüência de contador selecionada a ser colocada na extremidade esquerda do ESC; II) Produto do decote MwoI; III) Após o término da transcrição/tradução in vitro, os produtos são purificados e a ligadura é realizada com adaptador em excesso. Somente os produtos de decote que foram cortados na seqüência selecionada podem participar da ligadura. Portanto, as variantes inativas são eliminadas, e a etapa de pulldown é desnecessária. O produto de decote na seqüência selecionada do contador (na extremidade esquerda do ESC, não mostrado) não pode participar desta ligadura porque a extremidade saliente do adaptador não é complementar à seqüência do contador selecionado; IV) O PCR seletivo usa a mesma estratégia do protocolo principal para eliminar variantes com a especificidade da seqüência de degeneração do tipo selvagem (f1 primer binding distal ao site selecionado do contador), enquanto as variantes inativas são eliminadas pelo primer reverso seletivo que não pode se ligar ao final direito impuro (e, portanto, não modificado pela ligadura do adaptador). No próximo ciclo, o processo pode ser iterado usando um adaptador idêntico ao produto de decote da etapa anterior (ou seja, o de celado no painel III), e um primer reverso seletivo apropriado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig9large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Tabela 1: Primers usados na engenharia NlaIV. As seqüências dos locais de restrição mencionados nos comentários são sublinhadas. Letras pequenas indicam sequências que não possuem complementos nos modelos de DNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/table1.xlsx" target="_blank">Clique aqui para ver esta tabela (Clique com o botão direito do mouse para baixar).</a>
Tabela 2: Condições das reações de PCR a serem utilizadas no protocolo. Tm = temperatura de fusão do primer (se Tm for diferente para os primers, o Tm inferior deve ser usado). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/table2.xlsx" target="_blank">Clique aqui para ver esta tabela (Clique com o botão direito do mouse para baixar).</a>
Tabela 3: Resultados da verificação de qualidade de dois primers mutagênicos sintetizados com estratégia split-and-mix. Códons mutagenizados são indicados com [XXX]. Um número de índice mais baixo indica a posição de um aminoácido codificado. Adaptado de Czapinska et al.8 com permissão da Elsevier. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/table3.xlsx" target="_blank">Clique aqui para ver esta tabela (Clique com o botão direito do mouse para baixar).</a>
Tabela 4: Resultados do EP-PCR. Principais parâmetros derivados da análise seqüencial de 22 clones de ECS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/table4.xlsx" target="_blank">Clique aqui para ver esta tabela (Clique com o botão direito do mouse para baixar).</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Directed Evolution of a Restriction Endonuclease with More Stringent Specificity at JoVE.com

In Vitro Directed Evolution of a Restriction Endonuclease with More Stringent Specificity

Endonucleases de restrição com nova especificidade de seqüência podem ser desenvolvidas a partir de enzimas que reconhecem uma seqüência parcialmente degenerada. Aqui fornecemos um protocolo detalhado que usamos com sucesso para alterar a especificidade da seqüência da enzima NlaIV. Os ingredientes-chave do protocolo são a compartimentação in vitro da reação de transcrição/tradução e a seleção de variantes com novas especificidades de seqüência.

In Vitro Evolução dirigida de uma endonuclease de restrição com especificidade mais rigorosa

Restriction endonuclease (REase) specificity engineering is extremely difficult. Here we describe a multistep protocol that helps to produce REase ...

Nosso protocolo permite a criação de enzimas de restrição com especificidades de sequência alteradas e mais rigorosas usando compartimentação in vitro e uma estratégia de seleção única na evolução direcionada. Potencialmente é bastante universal, pois deve ser aplicável a qualquer restrição endonuclease e seleção pode ser direcionada para qualquer versão mais rigorosa de uma sequência cognato original. Se as variantes recém-criadas forem expressas pela tradução in vitro de transcrição, o protocolo é adequado não apenas para reduzir a especificidade, mas também para alterar a especificidade.Para decidir locais para mutagênese de subsaturação, escolha frequências de mutagênese de acordo com a importância hipotética dos locais, mantendo em mente os limites da complexidade geral da biblioteca. Para iniciar a síntese, insira colunas que foram embaladas com nova resina no sintetizador. Sintetizar oligonucleotídeos em todas as colunas até o trigêmeo, imediatamente precedendo o segundo local de mutagênese de subsaturação contando a partir do final de três primos.Sintetizar, deixando um grupo trityl cinco prime no final. O grupo de proteção será removido no início do próximo ciclo de síntese. Abra as colunas de síntese e centrífugue brevemente em tubos secos de 1,5 mililitro para coletar a resina.Puxe o suporte à síntese do CPG e misture por vórtice. Repartição da resina CPG mista em novas colunas de síntese. Evite introduzir umidade porque diminuirá o rendimento geral.Continue a síntese, a partir do trigêmeo do local da mutagênese de subsaturação. Atribua colunas a trigêmeos NNS randomizados ou trigêmeos do tipo selvagem de acordo com a frequência de mutagênese desejada. Se houver locais adicionais de subsaturação, prossiga apenas para o trigêmeo anterior ao próximo local de mutagenese de subsaturação.Se não houver mais locais de subsaturação a jusante, complete a síntese, deixando um grupo trityl cinco primos no final. Use pontas largas de pipeta para preparar uma mistura de surfactante de óleo adicionando 225 microliters de Span 80 e 25 microliters de Tween 80 a cinco mililitros de óleo mineral em um tubo cônico de 15 mililitros. Misture bem por inversão suave 15 vezes.A mistura nesta etapa deve ser translúcida. Para cada biblioteca, transfira 950 microliters da mistura surfactante de óleo para um frasco criogênico de fundo redondo de dois mililitros. Rotular com um nome de biblioteca e transferir para o gelo.Coloque uma pequena barra de agitação cilíndrica em cada frasco. Prepare uma mistura de reação de transcrição in vitro de acordo com as sugestões do fabricante. Suplemente a mistura com cloreto de magnésio a uma concentração final de 1,5 milimiliar.Dispense 50 alíquotas de microliter da mistura de reação em tubos de 1,5 mililitro no gelo. Adicione 1,7 femtomoles da biblioteca à mistura de reação no gelo. Prepare a emulsão água-em-óleo consecutivamente para cada biblioteca, colocando pela primeira vez um pequeno béquer cheio de gelo em um agitador magnético com a velocidade de agitação definida para 1150 RPM.Em seguida, transfira um frasco criogênico com 950 microliters de mistura surfactante de óleo e uma pequena barra de agitação para um béquer gelado no agitador magnético. Verifique se a barra de agitação está girando. Adicione cinco alíquotas de 10 microliter da mistura de transcrição de transcrição in vitro da biblioteca durante um período de dois minutos em intervalos de 30 segundos e continue mexendo por mais um minuto.Transfira o frasco com a emulsão para um recipiente de gelo. Neste ponto, o líquido deve ser opaco, não translúcido. Então, prossiga com a próxima biblioteca.Depois que todas as bibliotecas forem processadas, inicie a incubação de todas as bibliotecas de acordo com as recomendações do fabricante do kit. Transfira os frascos para a temperatura ideal para a endonuclease projetada por mais duas horas antes de colocá-los no gelo por pelo menos 10 minutos. Transfira as emulsões dos frascos criogênicos em tubos de 1,5 mililitro.Adicione um microliter de 5 EDTA molares. E centrifuá-los a 13.000 vezes g por cinco minutos em temperatura ambiente. Se após a centrifugação você não puder ver claramente a interface água-óleo, congele a mistura antes da aspiração da fase superior do óleo.Mova a fase superior do óleo com uma pipeta e descarte. Realize imediatamente a extração adicionando 150 microlitadores de clorofórmio fenol e 100 microlitres de 10 mililitros Tris-HCl à fase aquosa. Vórtice e, em seguida, realizar separação de fase através de centrifugação de 30 segundos a 13.000 vezes g.Colete a fase aquosa superior. Precipitar o DNA adicionando 15 microlitadores de acetato de sódio de três molares, 2,5 a cinco microgramas de glicogênio e 375 microliters de etanol. Depois de incubar as amostras a menos-20 graus Celsius por uma hora, centrífuga por 15 minutos a 13.000 vezes g, quatro graus Celsius.Descarte o supernasce e lave brevemente a pelota com um mililitro de frio de 70% de etanol. Seque a pelota de glicogênio de DNA em uma vac de velocidade ou secador de ar por mais de cinco minutos. Em seguida, dissolva a pelota em 50 microliters de 10 mililitros Tris-HCl.Em seguida, adicione cinco microliters de contas magnéticas streptavidin, preparadas de acordo com as instruções do fabricante. Misture por uma hora à temperatura ambiente, de preferência em um misturador de carrossel ou por vórtice suave. Transfira os tubos para um suporte magnético para separar as contas.Então colete o líquido enriquecido em DNA sem biotina. Este protocolo é uma ferramenta para aumentar a frequência das variantes desejadas de endonucleases de restrição projetada, esgotando enzimas inativas e endonucleases com especificidade de sequência de tipo selvagem inalterada. A triagem bem-sucedida pode identificar até 20% das variantes promissoras.As variantes são rotuladas como variantes promissoras se produzirem um padrão de decote distinto da enzima do tipo selvagem. Variantes que podem ter alterado a preferência de sequência também são rotuladas. Mostrado aqui é uma triagem mal sucedida com a maioria de variância inativa e uma variante com padrão de decote aparentemente não substituído.Neste caso, as bibliotecas são provavelmente dominadas por variantes inativas que escaparam da etapa de seleção de captura de streptavidin. É fundamental projetar cuidadosamente as sequências selecionadas e contra-selecionadas e limitar a diversidade da biblioteca pela estratégia mutagênese que gera substituições em apenas algumas posições selecionadas. As melhores variantes selecionadas devem ser completamente caracterizadas para cinéticas de ligação e decote em sequências preferenciais e não rachadas com base nos resultados da triagem inicial.No nosso caso de teste, os locais de mutagênese foram selecionados com base em um modelo de homologia. Surpreendentemente, uma estrutura de cristal mais tarde mostrou que alguns resíduos alterados provavelmente não estão em contato direto com o DNA.

Research

JoVE Journal

Genetics

Design and Use of a Low Cost, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution of Bacteria Under Antibiotic Drug Selection

Concepção e utilização de um baixo custo, Automated Morbidostat para Adaptive Evolução das bactérias sob Antibiótico Seleção de Drogas

We describe a low cost, configurable morbidostat for characterizing the evolutionary pathway of antibiotic resistance. The morbidostat is a bacterial ...

Genética

Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat

Processo para o Adaptive Laboratório Evolução de microrganismos utilizando um quimiostato

Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) ...

Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development

Genoma Edição e Directed Diferenciação de hPSCs para interrogar Determinantes Lineage no desenvolvimento pancreático humano

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding ...

Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans

Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans

Quantificação da informação codificada pelos níveis de expressão gênica durante modulação do tempo de vida sob ampla restrição alimentar em C. elegans.

Sensory systems allow animals to detect, process, and respond to their environment. Food abundance is an environmental cue that has profound effects on ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Geração de um Gene-interrompeu Streptococcus mutans estirpe sem Gene clonagem

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Testing the Role of Multicopy Plasmids in the Evolution of Antibiotic Resistance

Testando o papel de plasmídeos multicópia na evolução da resistência aos antibióticos

Multicopy plasmids are extremely abundant in prokaryotes but their role in bacterial evolution remains poorly understood. We recently showed that the ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Vigilância de todo o genoma de erros de transcrição em organismos eucarióticos

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

Produzindo a deleção do Gene na Escherichia coli por transdução P1 com fitas de resistência aos antibióticos sujeitos

A first approach to study the function of an unknown gene in bacteria is to create a knock-out of this gene. Here, we describe a robust and fast protocol ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

Usando em forma de Vitro e na célula para investigar a pequena molécula induzida por alterações estruturais Pre-mRNA

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Using Sniper-Cas9 to Minimize Off-target Effects of CRISPR-Cas9 Without the Loss of On-target Activity Via Directed Evolution

Usando o Sniper-Cas9 para minimizar efeitos fora do alvo de CRISPR-Cas9 sem perda de atividade no alvo através de evolução dirigida

The development of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated protein 9 (Cas9) into therapeutic modalities requires the ...