Name: in vitro directed evolution of a restriction endonuclease with more stringent specificity
Uploaded: 2020-03-25T15:00:00
Duration: 9 min 16 s
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Este trabajo fue apoyado por las subvenciones del Ministerio de Ciencia y Educación Superior (0295/B/PO1/2008/34 a MB y N301 100 31/3043 a KS), del Centro Nacional polaco de ciencias (NCN) (UMO-2011/02/A/NZ1/00052, UMO-2014/13/B/NZ1/03991 y UMO-2014/14/M/NZ5/00558 a MB) y por beca EMBO a corto plazo a KS (ATSF 277.00-05).

<ol>
	<li>Sch&#246;ttler, S., Wenz, C., Lanio, T., Jeltsch, A., Pingoud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+engineering+of+the+restriction+endonuclease+EcoRV--structure-guided+design+of+enzyme+variants+that+recognize+the+base+pairs+flanking+the+recognition+site.">Protein engineering of the restriction endonuclease EcoRV--structure-guided design of enzyme variants that recognize the base pairs flanking the recognition site.</a> European Journal of Biochemistry. 258 (1), 184-191 (1998).</li><li>Wenz, C., Hahn, M., Pingoud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+variants+of+the+restriction+endonuclease+EcoRV+that+depend+in+their+cleavage+activity+on+the+flexibility+of+sequences+flanking+the+recognition+site.">Engineering of variants of the restriction endonuclease EcoRV that depend in their cleavage activity on the flexibility of sequences flanking the recognition site.</a> Biochemistry. 37 (8), 2234-2242 (1998).</li><li>Samuelson, J. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+a+rare-cutting+restriction+enzyme:+genetic+screening+and+selection+of+NotI+variants.">Engineering a rare-cutting restriction enzyme: genetic screening and selection of NotI variants.</a> Nucleic Acids Research. 34 (3), 796-805 (2006).</li><li>Rimseliene, R., Maneliene, Z., Lubys, A., Janulaitis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+restriction+endonucleases:+using+methylation+activity+of+the+bifunctional+endonuclease+Eco57I+to+select+the+mutant+with+a+novel+sequence+specificity.">Engineering of restriction endonucleases: using methylation activity of the bifunctional endonuclease Eco57I to select the mutant with a novel sequence specificity.</a> Journal of Molecular Biology. 327 (2), 383-391 (2003).</li><li>Morgan, R. D., Luyten, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+engineering+of+type+II+restriction+endonuclease+DNA+binding+and+cleavage+specificity.">Rational engineering of type II restriction endonuclease DNA binding and cleavage specificity.</a> Nucleic Acids Research. 37 (15), 5222-5233 (2009).</li><li>Skowronek, K., Boniecki, M. J., Kluge, B., Bujnicki, J. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+8+Unit+8.3:+Random+mutagenesis+by+PCR.">Chapter 8 Unit 8.3: Random mutagenesis by PCR.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (2001).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El protocolo de selección descrito aquí fue probado para NlaIV8, una secuencia de reconocimiento de plegado dieric-(D/E)XK que reconoce un sitio de destino palindrómico con bases NN centrales y cataliza un corte final contundente entre las bases NN. NlaIV fue recogido porque el escote entre las bases NN sugiere que estas bases están cerca de la proteína en el complejo. En principio, el protocolo podría utilizarse para cualquier restricción específica de la secuencia endonucleasa, monomérica o dimerica, de cualquier grupo de plegado, catalizando roturas de doble hebra de cualquier escalonamiento, independientemente de si los dominios catalíticos y especificidad coinciden (como en el ejemplo NlaIV) o son separados (por ejemplo, FokI). Además, el protocolo en principio es útil no sólo para la generación de nueva especificidad enzimática más estrecha, sino que también podría utilizarse para eliminar las actividades estelares, o para crear endonucleasasas de alta fidelidad. Sin embargo, todo esto aún no ha sido probado. En particular, la eliminación dirigida de la actividad estelar puede ser complicada, porque los mismos residuos de aminoácidos podrían estar involucrados en la unión a las bases deseadas y no deseadas. Los pasos in vitro descritos en este protocolo no se limitan a la selección de especificidades reducidas, sino que también podrían utilizarse para seleccionar especificidades alteradas de otro modo. Sin embargo, entonces hay un problema con las endonucleasas variantes: si el espectro de sustratos incluye nuevos objetivos no aplacados por la endonucleasa parental, en general no hay una buena manera de proteger a las células de los efectos nocivos de esta actividad. Por el contrario, si la especificidad de la endonucleasa sólo se reduce, los objetivos son un subconjunto de los objetivos de tipo silvestre, y por lo tanto la metiltransferasa cognada ya disponible debe ser totalmente protectora.
Nuestro protocolo difiere en varios aspectos de muchos protocolos de evolución dirigida. La diversidad de fotogramas de lectura abierta se genera una vez al principio del experimento, no en todas las iteraciones. Además, se crea mediante la síntesis de división y mezcla, en lugar de por EP-PCR. Para las sustituciones NNS de codones, tal como se utiliza en este trabajo, hay (4 x 4 x 2)6 x 1,07 x 109 combinaciones para seis posiciones. Por lo tanto, cualquier variante dada está presente en promedio una vez en 1,7 fmoles de ESC. Esta capacidad se puede aumentar a siete posiciones mediante el uso de síntesis con una mezcla de 20 precursores de trinucleótidos que es ofrecido por Glen Research o disminuyendo la frecuencia de mutación en posiciones menos prometedoras con síntesis de oligonucleótidos divididos y mixtos. Si es posible, se recomienda limitar el grado de variación a seis posiciones. Obviamente, este tipo de mutagénesis dirigida requiere cierto conocimiento preexistente sobre al menos las regiones del REase involucradas en la unión de sustratos. El protocolo de división y mezcla para generar diversidad tiene claras ventajas en comparación con el EEP-PCR. Utilizando el EP-PCR, obtuvimos variantes y secuencias sin cambios que llevaban ocho sustituciones para los EsC NlaIV en el mismo EP-PCR (cuadro 4). La biblioteca de EP-PCR contiene una fracción sustancial de clones que deben evitarse (secuencias de tipo salvaje, múltiples sustituciones, mutaciones de cambio de fotogramas y sin sentido, y mutaciones en lugares poco probables que afecten a la especificidad de la secuencia).
Nuestro protocolo también difiere de muchos otros protocolos de evolución dirigidos por la presencia de dos pasos de selección secuenciales. La selección positiva se asegura de que se conserva la actividad deseada, de lo contrario la etiqueta biotina no se elimina y la secuencia de codificación se puede eliminar mediante la extracción. Es técnicamente posible que la aparición fortuita de una especificidad no superesofosa no esnueva (por ejemplo, GCATGC) podría conducir a la separación de la etiqueta de biotina también, si un sitio de escote adecuado está presente cerca del escote deseado, pero no en otro lugar. Sin embargo, esto debería ser muy improbable. La selección negativa elimina los fotogramas de lectura abiertos que codifican para las enzimas que todavía tienen la actividad no deseada. Este paso no es estrictamente obligatorio, porque el protocolo todavía enriquecerá la biblioteca de salida con variantes que son capaces de cortar la secuencia de selección pero no pueden cortar en otro lugar del ESC, por lo tanto, lo que la hace inadecuada para la amplificación de PCR. Sin embargo, se espera que la eficacia de la selección sea menor porque las enzimas con la especificidad de la secuencia original no se eliminarán de la salida y superarán a las variantes prometedoras con especificidad alterada, sino también a una menor actividad enzimática. Tenga en cuenta que en el nivel de población, las secuencias de destino deseadas y no deseadas pueden, pero no es necesario, degenerar. En el ejemplo de NlaIV, el antiobjetivo era degenerado y el destino no degenerado. Incluso cuando hay degeneración a nivel de población, en una sola gota sólo está presente un objetivo (no degenerado) o un objetivo antiobjetivo. En nuestro protocolo, las secuencias de objetivo y antiobjetivo se reintroducen en cada repetición de los pasos de selección. Por lo tanto, un marco de lectura abierto debe codificar una enzima capaz de cortar todos los objetivos posibles, e incapaz de cortar ninguno de los objetivos antiobjetivos, para sobrevivir a múltiples rondas de selección. Observe que la necesidad de reintroducir el destino de antiselección en cada iteración del protocolo aplica dos PCR secuenciales. El primer PCR utiliza una imprimación que se recocido fuera del anti-objetivo, de modo que el escote del anti-objetivo previene la reacción PCR. El segundo PCR requiere una imprimación que va más allá del antiobjetivo, y reintroduce anti-target, para asegurarse de que durante múltiples rondas de selección, cada marco de lectura abierto se prueba contra todas las variantes del anti-objetivo.
Para las enzimas que generan extremos pegajosos, se puede utilizar un protocolo alternativo relacionado basado en un método descrito previamente para el aislamiento de REase ORF10. El agotamiento de las variantes inactivas por captura de biotina que se utiliza en nuestros experimentos se sustituye en el protocolo alternativo por la ligadura del adaptador compatible con una secuencia que se utiliza como sitio de enlace de imprimación en un PCR selectivo(Figura 9). Solo los ESC que producen enzimas con la especificidad seleccionada generan extremos capaces de ligar y, por lo tanto, se seleccionarán. La secuencia del extremo pegajoso de la secuencia eseleccionada del contador debe diseñarse de tal manera que no pueda participar en la ligadura con adaptadores. La iteración del proceso de selección se puede lograr fácilmente cambiando entre dos adaptadores diferentes y, en consecuencia, dos imprimaciones inversas diferentes en PCR selectivo.
Incluso con nuevos protocolos, la tarea de ingeniería de nuevas especificidades in vitro sigue siendo muy difícil. Para los REases típicos de tipo II, la especificidad de la secuencia y la actividad endonucleólítica dependen de las mismas regiones proteicas. Por lo tanto, es difícil modificar uno sin afectar al otro. El éxito se hace más probable por una estrategia que tiene en cuenta la huella de la enzima, respeta la simetría de las interacciones proteína-ADN, y se basa en las preferencias enzimáticas preexistentes, que deben determinarse por adelantado en experimentos bioquímicos, como se hizo para el ejemplo8de NlaIV.

La ingeniería de especificidad de secuencia es extremadamente difícil para los REases de clase II. En esta clase de endonucleasasas, el reconocimiento de secuencias y la catálisis están estrechamente entrelazados, probablemente como una salvaguardia evolutiva contra la creación de una endonucleasa de especificidad más amplia que su metiltransferasa cognada, que dañaría el ADN del huésped. La evolución dirigida de nuevas especificidades en las células se complica aún más por la necesidad de proteger el ADN del huésped contra la actividad de endonucleasa recién diseñada. Por lo tanto, hay sólo unos pocos intentos exitosos de ingeniería REase reportados y todos ellos explotar las características únicas de una enzima en particular1,2,3,4,5,6,7.
Aquí proporcionamos un protocolo detallado para la ingeniería de especificidad que se puede utilizar para generar variantes de endonucleasa que tienen una especificidad más estrecha que una enzima parental que se basa en nuestra ingeniería exitosa de una endonucleasa NlaIV8. Para cualquier enzima de este tipo con una secuencia de reconocimiento arbitraria, se puede introducir una especificidad adicional para las bases en los flancos. Para las enzimas parentales que reconocen secuencias parcialmente degeneradas (como NlaIV con su objetivo GGNNCC), también se puede introducir especificidad adicional dentro de la secuencia de reconocimiento. Como es probable que la especificidad adicional requiera contactos proteico-ADN, las bases recientemente reconocidas deben estar dentro de la huella de la endonucleasa parental en el ADN. En principio, se pueden configurar esquemas de selección para cualquier especialización deseada de la secuencia de reconocimiento. Sin embargo, la mayoría de los REases que reconocen secuencias diana palindrómicas y casi palindrómicas son dimers funcionales que reconocen sólo un medio sitio del palíndromo. Por lo tanto, es poco probable que la selección de nuevas especificidades que violen la simetría de las interacciones nucleicas proteicas funcione. Para el NlaIV dimerico, por ejemplo, la secuencia GGNNCC teóricamente se puede reducir a GGATCC, pero se espera que reducir la especificidad a GGAACC sea más difícil. Nuestro esquema implica una selección positiva y negativa.
El proceso es más eficiente cuando la selección negativa también se utiliza para eliminar las especificidades capaces de cleave todas las secuencias que no sea la especificidad más estrecha preferida. Por ejemplo, la selección para GGATCC podría combinarse con la antiselección contra GGBVCC (donde B es cualquier base que no sea A, y V es cualquier base distinta de T). Cuando algunas de las posibles secuencias de destino no están cubiertas, el resultado del experimento de selección depende de la eficacia de la selección positiva y negativa. En nuestro trabajo NlaIV, seleccionamos para GGATCC, y contra GGSSCC (donde S es G o C), y obtuvimos una especificidad que, ignorando los objetivos de ruptura de simetría, podría describirse como GGWWCC (donde W es A o T), lo que sugiere que en este caso en particular, la selección negativa era más selección importante que positiva.
Nuestro enfoque comienza con la creación de un casete de selección de expresiones (ESC). El ESC se estructura en secciones. En la sección del núcleo interior, hay variantes del marco de lectura abierto (ORF) del REase, bajo el control del promotor T7. Esta sección principal del ESC no puede contener ningún sitio de cognado para el REase diseñado. El núcleo se intercala entre dos sitios de cognado para el tipo salvaje REase: un sitio de escote para la actividad no deseada (secuencia de contador seleccionada, GGSSCC en este ejemplo) y un sitio de escote para la actividad deseada (secuencia seleccionada, GGATCC en el ejemplo). El paso final de la preparación del ESC en PCR añade biotina cerca de la actividad deseada en el extremo de 5' y crea una variedad de secuencias seleccionadas de contador (GGSSCC en el ejemplo). La estrategia de selección se basa en el uso de imprimaciones cuidadosamente diseñadas en el protocolo de reamplificación ESC después de un protocolo in vitro de transcripción/traducción/selección(Figura 1A). La biblioteca ESC se expresa en una transcripción compartimentada in vitro de traducción de la emulsión agua en aceite9,10,11. Dentro de cada gota, la especificidad de la enzima expresada afecta el estado de la ESC(Figura 1B,paso I). Para la disposición descrita, la actividad de escisión deseada de la proteína traducida elimina la etiqueta de biotina del ADN, pero no afecta al otro extremo ESC con la secuencia de contador seleccionada. Cuando se rompe la emulsión, los fragmentos biotinylados se eliminan mediante el desplegable de afinidad de estreptavidina, de modo que solo queden fragmentos de gotas con la actividad deseada(Figura 1B,paso II). Este paso elimina las variantes rease inactivas. La fracción sobrenadante del paso desplegable es entonces amplificada por PCR. En los primeros cebatos de reacción PCR se utilizan f2 y R1(Figura 1A,B,paso III). Primer F2 se une a la sección ESC entre la secuencia de contador seleccionada y el extremo de la molécula. Por lo tanto, los ESC que expresan variantes que son capaces de cortar la secuencia seleccionada del contador (y, por lo tanto, separan los sitios de unión para los imprimadores F2 y R1 en dos moléculas de ADN diferentes) no se amplifican y, por lo tanto, se eliminan de la biblioteca. El primer R1 se une entre el sitio seleccionado y el núcleo del ESC para que no se vea afectado por el estado de escisión del sitio seleccionado y restaure el sitio de escisión para la actividad deseada (GGATCC). El ciclo se cierra con un segundo PCR (con imprimaciones F1 y R2) que añade biotina en el extremo de 5' cerca del sitio seleccionado y restaura la variación diseñada en el sitio seleccionado del contador cerca del extremo opuesto del ESC(Figura 1B,paso IV). La mezcla de ADN resultante está lista para otra ronda de selección.
El éxito del protocolo de selección depende en gran medida de la elección adecuada de la nueva secuencia de reconocimiento de objetivos más estricta y del diseño cuidadoso de la estrategia de mutagénesis y su implementación efectiva. Debido a que es mucho más fácil mejorar las ligeras preferencias preexistentes del REase que superarlas, recomendamos comenzar con un estudio cinético de cualquier preferencia preexistente. La necesidad de un diseño cuidadoso de la mutagénesis resulta del tamaño limitado de una biblioteca mutante que puede ser procesada por el protocolo presentado (109 clones en un solo experimento). Por lo tanto, las 20 posibles sustituciones de aminoácidos se pueden probar eficazmente en sólo unas pocas posiciones (ver discusión). La mutagénesis aleatoria, como la PCR propensa a errores (EP-PCR) presentada como un método alternativo, conducirá a un profundo submuestreo de la complejidad existente. Si hay disponible alguna información sobre posibles posiciones de aminoácidos implicadas en contactos con ADN (o incluso situadas cerca de los nucleótidos degenerados en una secuencia deconada), ciertamente debe utilizarse para seleccionar algunos aminoácidos para la mutagénesis de saturación guiada por oligonucleótidos (pasos de protocolo 1.6-3.10).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1000&#197; CPG Support (dA, dT, dC, dG)</td>
			<td>Biosset</td>
			<td>45-1000-050</td>
			<td>Other vendors can be used as well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ASM-800 DNA/RNA</td>
			<td>Biosset</td>
			<td>800-001-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJET Gel Extraction Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K0691</td>
			<td>Any other kit can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glen-Pak DNA purification cartridge</td>
			<td>Glen Research</td>
			<td>60-5200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIS-Select Nickel Affinity Gel</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET 28a vector</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any other vector with T7 promoter upstream of plycloning site can be used instead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td>Any other high fidelity and highly processive thermophilic polymearse can be used instead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porous steel foil</td>
			<td>Biosset</td>
			<td>40-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid Translation System 
			RTS 100, E.coli HY Kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3 186 148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction endonucleases</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Obviously other vendors, enzymes can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Magnetic Beads</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>S1420S</td>
			<td>Other vendors can be used as well. We have positively tested beds form Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthesis chemicals including phosphoramidities</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td></td>
			<td>Other vendors can be used as well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthesis columns (different sizes)</td>
			<td>Biosset</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EL0011</td>
			<td>Any other ligase can be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro directed evolution of a restriction endonuclease with more stringent specificity

La ingeniería de especificidad de endonucleasa de restricciones (REase) es extremadamente difícil. Aquí describimos un protocolo de varios pasos que ayuda a producir variantes REase que tienen una especificidad más estricta que la enzima parental. El protocolo requiere la creación de una biblioteca de casetes de selección de expresiones (ESC) para las variantes del REase, idealmente con variabilidad en posiciones que puedan afectar a la unión al ADN. El ESC está flanqueado por un lado por una secuencia para la actividad del sitio de restricción deseada y una etiqueta de biotina y en el otro lado por un sitio de restricción para la actividad no deseada y un sitio de recocido de imprimación. Los ESC se transcriben y traducen en una emulsión de agua en aceite, en condiciones que hacen improbable la presencia de más de una molécula de ADN por gota. Por lo tanto, el ADN de cada molécula de casete se somete únicamente a la actividad de la enzima traducida y codificada. Las variantes REase de la especificidad deseada eliminan la etiqueta de biotina, pero no el sitio de recocido de imprimación. Después de romper la emulsión, las moléculas de ADN se someten a un pulldown de biotina, y sólo se conservan las del sobrenadante. Este paso garantiza que solo se conservan las ESC para las variantes que no han perdido la actividad deseada. Estas moléculas de ADN se someten a una primera reacción de PCR. El escote en la secuencia no deseada corta el sitio de encuadernación de la imprimación para una de las imprimaciones. Por lo tanto, PCR amplifica solamente los ESC de las gotas sin la actividad no deseada. A continuación, se lleva a cabo una segunda reacción de PCR para reintroducir el sitio de restricción para la especificidad deseada y la etiqueta de biotina, de modo que se pueda reiterar el paso de selección. Los marcos de lectura abiertos seleccionados pueden expresarse en células bacterianas que también expresan la metiltransferasa cognada del REase parental, porque el REase recién evolucionado se dirige sólo a un subconjunto de los sitios de destino de la metiltransferasa.

Este protocolo es sólo una herramienta para aumentar la frecuencia de las variantes deseadas de un REase diseñado agotando (pero no eliminando) dos clases no deseadas: enzimas inactivas y endonucleasas con especificidad de secuencia de tipo salvaje sin cambios. Por otro lado, debido a que cambiar la especificidad de REase es extremadamente difícil, encontrar incluso una de estas variantes produciendo un patrón de escisión que sea diferente de la enzima de tipo salvaje en un solo cribado de 24 clones debe considerarse un éxito. En nuestras manos las mejores pantallas podrían identificar hasta el 20% de las variantes prometedoras(Figura 8A).
El resultado positivo depende en gran medida de la calidad de la biblioteca (es decir, la frecuencia limitada de sustituciones y su distribución aleatoria) y de la captura eficiente de la población biotinicada de los miembros de la biblioteca (pasos 3.6 a 3.7). Ambos problemas se pueden detectar. La calidad de la biblioteca debe comprobarse antes de la selección mediante la secuenciación de tantos clones como sea posible (>15) o mediante la secuenciación directa de la biblioteca mediante la secuenciación de alto rendimiento (paso 3.10, Tabla 3). Si la mayoría de los clones seleccionados no están activos, esto es una indicación clara de un error de la selección de captura de estreptavidina. Un efecto similar se observa en el caso de las bibliotecas que sufren muchos ciclos de selección, porque estas bibliotecas están probablemente dominadas por variantes inactivas que escaparon del paso de selección de captura de estreptavidina(Figura 8B). Por lo tanto, es aconsejable ejecutar el cribado después de cada ciclo de selección y desarrollar más variantes prometedoras seleccionadas manualmente en lugar de depender de la iteración de la selección.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig1.jpg"> Figura 1: Selección in vitro de una nueva especificidad de secuencia basada en la ingeniería NlaIV. (A) La organización del casete de expresión/selección (ESC) incluye dos sitios de reconocimiento para REase, 1) la secuencia seleccionada (GGATCC) cerca del extremo derecho y 2) la secuencia seleccionada del contador (GGSSCC) cerca del extremo izquierdo, así como el promotor T7p y T7t-T7 y el terminador T7. Los sitios de encuadernación de imprimación se muestran a continuación. El escote por tipo salvaje y las variantes NlaIV seleccionadas se muestran como triángulos rojos y verdes respectivamente. (B) Pasos del ciclo de selección: I) Emulsificación de las mezclas de reacción transcripción-traducción-escisión con la biblioteca ESC; II) Todo el ADN biotinilado se captura en partículas magnéticas recubiertas con estreptavidina y se elimina, eliminando así las variantes inactivas de codificación; III) Los ESC que codifican REases con actividad de tipo salvaje (es decir, aquellos capaces de corte rinde la secuencia GGSSCC) se eliminan porque el escote de la secuencia separa los sitios de enlace para las imprimaciones delanteras e inversas. Por lo tanto, no se produce ninguna amplificación de estos ESC; IV) La entrada para la siguiente ronda de selección se crea mediante la adición de biotina en el extremo derecho y la reintroducción de la variación del contador seleccionado en el extremo izquierdo. 8 con permiso de Elsevier. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig2.jpg"> Figura 2: Preparación del ESC. El fragmento derivado de la construcción original en un vector de expresión que contiene NlaIV ORF bajo el control del promotor T7 se modificó para que fuera adecuado para la expresión/selección. El sitio NlaIV aguas abajo del NlaIV ORF fue eliminado y sitios únicos (SalI, EcoRI y Eco52I) que se utilizaron para mutar las posiciones seleccionadas fueron introducidos en el NlaIV ORF como mutaciones silenciosas. La construcción final se amplificó con imprimaciones de flanqueo que introdujeron dos sitios NlaIV flanqueantes: la secuencia de contador seleccionada (GGSSCC) a la izquierda y la secuencia seleccionada (GGATCC) a la derecha. La imprimación inversa también introdujo biotina. Los imprimaciones utilizadas en la creación de ECS mutado se muestran como flechas azules y se etiquetan a continuación (véase el Cuadro 1B,C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig3.jpg"> Figura 3: Esquema de síntesis de división y mezcla. El ejemplo se refiere a la síntesis de imprimación MutB donde se introdujo una secuencia NNS a una frecuencia de 0,8 en cuatro posiciones (véase también el Cuadro 3). Tenga en cuenta que la síntesis química se lleva a cabo de 3' a 5', pero todas las secuencias se muestran en orientación canónica 5'-3' (es decir, procede de derecha a izquierda en este esquema). Las secuencias de tipo salvaje en posiciones mutagenizadas se muestran en verde, mientras que las secuencias mutagénicas NNS están en rojo. Se subraya el sitio de reconocimiento SalI que más tarde se utiliza para introducir mutaciones en los ESC. Se indican los puntos de mezcla y división de pasos (2 y 4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig4.jpg"> Figura 4: Uso de sitios de enzimas de restricción únicos en mutagénesis dirigida a oligonucleótidos. La estrategia de introducción de mutaciones se muestra en un ejemplo de la construcción de bibliotecas A-C (véanse los pasos 3.1–3.7). 8 con permiso de Elsevier. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig5.jpg"> Figura 5: Escote endonucleólítico en transcripción-traducción in vitro. (A) Escisión de un sustrato de ensayo en tampón REase óptimo: 1) Sustrato, producto PCR de 612 bp con un único sitio de reconocimiento NlaIV; 2) Productos de escisión, 355 bp y 257 bp. (B) Escisión en una reacción de transcripción-traducción in vitro (que contiene 0,5 g de ESC): 1–2) alícuotas de 15 ml de traducción de transcripción in vitro sin sustrato (línea 2: reacción suplementada con 1,5 mM MgCl2); 3–4) Alícuotas de 15 l de transcripción-traducción in vitro con 1 g de sustrato de ensayo; (línea 4: reacción suplementada con 1,5 mM MgCl2). Marcador de tamaño S-DNA (pBR322 digerido con MspI). Las muestras se resolvieron en un 6% de PAGE nativo. El ADN estaba manchado con bromuro de etidio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig6.jpg"> Figura 6: Productos del primer PCR en el ciclo de selección. Vea la Figura 1B, paso III; protocolo 5.10. Los conjuntos de columnas 1 y 2 son alícuotas de dos bibliotecas diferentes cargadas por triplicado. Estándar de tamaño S-DNA (ADN lambda digerido con HindIII y EcoRI). La flecha indica la posición del ESC de longitud completa (1.050 bp). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig7.jpg"> Figura 7: Variantes NlaIV purificadas para su posterior cribado en miniescala. Consulte el paso 6.3.11. Cada línea contiene una alícuota de 10 l de una variante diferente. Estándar de peso molecular de proteína S. La masa molecular de la subunidad NaIV REase es de 29,9 kDa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig7large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig8.jpg"> Figura 8: Ejemplos de cribado de variantes NlaIV para la alteración de la especificidad de la secuencia. Consulte el paso 6.4.2. (A) Cribado exitoso con alta frecuencia de variantes prometedoras. S - marcador de tamaño de ADN, ADN lambda estallado con HindIII y EcoRI; tipo salvaje (wt) - ADN lambda se vacíe con el tipo salvaje NlaIV; • Sustrato de ADN lambda, no se lanzó; otras columnas-variantes con muy baja actividad. ¡Las variantes están etiquetadas ! • variantes prometedoras que producen un patrón de escote distinto de la enzima de tipo salvaje; ? • Variantes que también podrían tener una preferencia de secuencia alterada. (B) Cribado infructuoso, con una mayoría de variantes inactivas y una variante con patrón de escote aparentemente inalterado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig8large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig9.jpg"> Figura 9: Selección alternativa por ligadura. Esta alternativa se puede utilizar para todos los REases que generan extremos pegajosos. Aquí presentamos un protocolo de ejemplo para un esquema de selección para la enzima MwoI (inédita). I) Secuencia seleccionada (situada en el extremo derecho del ESC) con residuos definidos mostrados en rojo y variación seleccionada de la secuencia de cognado que se muestra en azul. Entre paréntesis debajo de la secuencia seleccionada del contador que se colocará en el extremo izquierdo del ESC se muestra; II) Producto de escote MwoI; III) Después de terminar la transcripción/traducción in vitro, los productos se purifican y la ligadura se realiza con el exceso de adaptador. Solo los productos de escisión que se han esgrimido en la secuencia seleccionada pueden participar en la ligadura. Por lo tanto, se eliminan las variantes inactivas y el paso desplegable es innecesario. El producto de escisión en la secuencia de contador seleccionada (en el extremo izquierdo del ESC, no se muestra) no puede participar en esta ligadura porque el extremo saliente del adaptador no es complementario a la secuencia de contador seleccionada; IV) El PCR selectivo utiliza la misma estrategia que en el protocolo principal para eliminar variantes con la especificidad de secuencia degenerada de tipo comodín (f1 primer enlace disal al sitio seleccionado del contador) mientras que las variantes inactivas se eliminan por la imprimación inversa selectiva que no se puede enlazar al extremo derecho no modificado (y por lo tanto no modificado por la ligadura del adaptador). En el siguiente ciclo, el proceso puede iterar mediante el uso de un adaptador idéntico al producto de escisión del paso anterior (es decir, el "cassette de salvia" en el panel III) y una imprimación inversa selectiva adecuada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig9large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Tabla 1: Primers utilizados en la ingeniería NlaIV. Se subrayan las secuencias de los sitios de restricción mencionados en los comentarios. Las letras pequeñas indican secuencias que no tienen complementos en las plantillas de ADN. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/table1.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para ver esta tabla (haga clic con el botón derecho para descargar).</a>
Tabla 2: Condiciones de las reacciones PCR que se utilizarán en el protocolo. Tm - temperatura de fusión de imprimación (si Tm es diferente para las imprimaciones, se debe utilizar la Tm inferior). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/table2.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para ver esta tabla (haga clic con el botón derecho para descargar).</a>
Tabla 3: Resultados de la comprobación de la calidad de dos imprimaciones mutagénicas sintetizadas con estrategia de división y mezcla. Los codones mutagenizados se indican con [XXX]. Un número de índice inferior indica la posición de un aminoácido codificado. 8 con permiso de Elsevier. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/table3.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para ver esta tabla (haga clic con el botón derecho para descargar).</a>
Cuadro 4: Resultados del EP-PCR. Parámetros principales derivados del análisis de secuencia de 22 clones de ECS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/table4.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para ver esta tabla (haga clic con el botón derecho para descargar).</a>

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In Vitro Directed Evolution of a Restriction Endonuclease with More Stringent Specificity

Las endonucleasas de restricción con nueva especificidad de secuencia se pueden desarrollar a partir de enzimas que reconocen una secuencia parcialmente degenerada. Aquí proporcionamos un protocolo detallado que utilizamos con éxito para alterar la especificidad de la secuencia de la enzima NlaIV. Los ingredientes clave del protocolo son la compartimentación in vitro de la reacción de transcripción/traducción y la selección de variantes con nuevas especificidades de secuencia.

In Vitro dirigió la evolución de una endonucleasa de restricción con una especificidad más estricta

Restriction endonuclease (REase) specificity engineering is extremely difficult. Here we describe a multistep protocol that helps to produce REase ...

Nuestro protocolo permite la creación de enzimas de restricción con especificidades de secuencia alteradas y más estrictas utilizando la compartimentación in vitro y una estrategia de selección única en la evolución dirigida. Potencialmente es bastante universal, ya que debería ser aplicable a cualquier restricción endonucleasa y la selección se puede dirigir hacia cualquier versión más estricta de una secuencia de cognilla original. Si las variantes recién creadas se expresan mediante la transcripción-traducción in vitro, el protocolo es adecuado no sólo para reducir la especificidad, sino también para alterar la especificidad.Para decidir los sitios de mutagénesis de subsaturación, elija las frecuencias de mutagénesis de acuerdo con la importancia hipotética de los sitios, teniendo en cuenta los límites de la complejidad general de la biblioteca. Para comenzar la síntesis, inserte columnas que hayan sido embaladas con nueva resina en el sintetizador. Sintetizar oligonucleótidos en todas las columnas hasta el triplete, inmediatamente antes de la segunda subsaturación del sitio de mutagenesis contando desde el extremo de tres primos.Sintetizar, dejando un grupo de trityl de cinco primos al final. El grupo protector se eliminará al comienzo del siguiente ciclo de síntesis. Abra las columnas de síntesis y centrifugar brevemente en tubos secos de 1,5 mililitros para recoger la resina.Tire del soporte de síntesis de CPG y mezcle por vórtice. Vuelva a particionar la resina CPG mixta en nuevas columnas de síntesis. Evite introducir humedad porque disminuirá el rendimiento general.Continuar la síntesis, a partir del triplete del sitio de mutagénesis de la subsaturación. Asigne columnas a trillizos NNS aleatorios o trillizos de tipo salvaje de acuerdo con la frecuencia de mutagénesis deseada. Si hay sitios de subsaturación adicionales, diríjase únicamente al triplete anterior al siguiente sitio de mutagénesis de subsaturación.Si no hay más sitios de subsaturación en el nivel inferior, complete la síntesis, dejando un grupo de trityl de cinco primos al final. Utilice puntas de pipeta de diámetro ancho para preparar una mezcla de tensioactivo de aceite añadiendo 225 microlitros de Span 80 y 25 microlitros de Tween 80 a cinco mililitros de aceite mineral en un tubo cónico de 15 mililitros. Mezclar bien por inversión suave 15 veces.La mezcla en este paso debe ser translúcida. Para cada biblioteca, transfiera 950 microlitros de la mezcla de tensioactivos de aceite a un vial criogénico de fondo redondo de dos mililitros. Etiqueta con un nombre de biblioteca y transfiérala al hielo.Coloque una pequeña barra de agitación cilíndrica en cada vial. Preparar una mezcla de reacción de transcripción-traducción in vitro de acuerdo con las sugerencias del fabricante. Complementar la mezcla con cloruro de magnesio a una concentración final de 1,5 milimolares.Dispensar 50 microlitros alícuotas de la mezcla de reacción en tubos de 1,5 mililitros sobre hielo. Añadir 1.7 femtomoles de la biblioteca a la mezcla de reacción sobre hielo. Prepare la emulsión de agua en aceite consecutivamente para cada biblioteca colocando primero un vaso pequeño lleno de hielo en un agitador magnético con la velocidad de agitación establecida en 1150 RPM.A continuación, transfiera un vial criogénico con 950 microlitros de mezcla de tensioactivos de aceite y una pequeña barra de agitación a un vaso de precipitados helado en el agitador magnético. Compruebe que la barra de agitación esté girando. Agregue cinco alícuotas de 10 microlitros de la mezcla de transcripción-traducción de la biblioteca in vitro durante un período de dos minutos en intervalos de 30 segundos y continúe agitando durante un minuto adicional.Transfiera el vial con la emulsión a un recipiente de hielo. En este punto, el líquido debe ser opaco, no translúcido. A continuación, continúe con la siguiente biblioteca.Después de que se procesen todas las bibliotecas, inicie la incubación de todas las bibliotecas de acuerdo con las recomendaciones del fabricante del kit. Transfiera los viales a la temperatura óptima para la endonucleasa de ingeniería durante dos horas adicionales antes de colocarlos sobre hielo durante al menos 10 minutos. Transfiera las emulsiones de los viales criogénicos a tubos de 1,5 mililitros.Añadir un microlitro de 5 molares EDTA. Y centrifugarlos a 13.000 veces g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Si después de la centrifugación no puede ver claramente la interfaz agua-aceite, congele la mezcla antes de la aspiración de la fase superior del aceite.Mueva la fase superior del aceite con una pipeta y deseche. Realice inmediatamente la extracción añadiendo 150 microlitros de cloroformo de fenol y 100 microlitros de tris-HCl mililar a la fase acuosa. Vórtice y luego realizar la separación de fase por centrifugación de 30 segundos a 13.000 veces g.Recoger la fase acuosa superior. Precipite el ADN añadiendo 15 microlitros de acetato de sodio de tres molares, 2,5 a cinco microgramos de glucógeno y 375 microlitros de etanol. Después de incubar las muestras a menos-20 grados Celsius durante una hora, centrifugar durante 15 minutos a 13.000 veces g, cuatro grados centígrados.Deseche el sobrenadante y lave brevemente el pellet con un mililitro de etanol frío al 70%. Seque el pellet de glucógeno de ADN en una aspiradora de velocidad o secador de aire durante más de cinco minutos. Luego disuelve el pellet en 50 microlitros de 10 tris-HCl mililolares.A continuación, añada cinco microlitros de perlas magnéticas de estreptavidina, preparadas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Mezclar durante una hora a temperatura ambiente, preferiblemente en un mezclador de carrusel o por vórtices suaves. Transfiera los tubos a un soporte magnético para separar las perlas.A continuación, recoger el líquido enriquecido en ADN sin biotina. Este protocolo es una herramienta para aumentar la frecuencia de las variantes deseadas de endonucleasas de restricción diseñadas agotando enzimas inactivas y endonucleasas con especificidad de secuencia de tipo salvaje sin cambios. El cribado exitoso puede identificar hasta un 20% de variantes prometedoras.Las variantes se etiquetan como variantes prometedoras si producen un patrón de escote distinto de la enzima de tipo salvaje. Las variantes que podrían haber alterado la preferencia de secuencia también se etiquetan. Aquí se muestra un cribado fallido con la mayoría de la varianza inactiva y una variante con patrón de escote aparentemente inalterado.En este caso, las bibliotecas probablemente están dominadas por variantes inactivas que escaparon del paso de selección de captura de streptavidin. Es fundamental diseñar cuidadosamente las secuencias seleccionadas y contraseleccionados y limitar la diversidad de bibliotecas mediante una estrategia de mutagénesis que genere sustituciones en solo unas pocas posiciones seleccionadas. Las mejores variantes seleccionadas deben caracterizarse a fondo para la cinética de unión y escote en secuencias preferidas y no cortadas en función de los resultados del cribado inicial.En nuestro caso de prueba, los sitios de mutagénesis fueron seleccionados en base a un modelo de homología. Sorprendentemente, una estructura cristalina más tarde mostró que algunos residuos alterados probablemente no están en contacto directo con el ADN.

Research

JoVE Journal

Genetics

Design and Use of a Low Cost, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution of Bacteria Under Antibiotic Drug Selection

Diseño y Uso de un bajo coste, Automatizado Morbidostat para Adaptive Evolución de las bacterias a los antibióticos En la selección de fármacos

We describe a low cost, configurable morbidostat for characterizing the evolutionary pathway of antibiotic resistance. The morbidostat is a bacterial ...

Investigación

Genética

Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat

Procedimiento para Adaptive Laboratory Evolución de microorganismos utilizando un quimiostato

Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) ...

Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development

Genoma Edición y diferenciación dirigida de hPSCs para interrogar Determinantes linaje en el Desarrollo Humano de páncreas

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding ...

Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans

Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans

Cuantificación de la información codificada por el Gene expresión niveles durante la vida útil modulación bajo amplia gama dieta restricción en C. elegans

Sensory systems allow animals to detect, process, and respond to their environment. Food abundance is an environmental cue that has profound effects on ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generación de un gen interrumpido Streptococcus mutans cepa sin gen clonación

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Testing the Role of Multicopy Plasmids in the Evolution of Antibiotic Resistance

Prueba el papel de Multicopy plásmidos en la evolución de resistencia a los antibióticos

Multicopy plasmids are extremely abundant in prokaryotes but their role in bacterial evolution remains poorly understood. We recently showed that the ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Vigilancia de todo el genoma de errores de transcripción en organismos eucariotas

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

Producción de canceladuras del Gene en Escherichia coli por transducción de P1 con casetes de resistencia a los antibióticos

A first approach to study the function of an unknown gene in bacteria is to create a knock-out of this gene. Here, we describe a robust and fast protocol ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

Uso en Vitro y en las células la forma para investigar la molécula pequeña inducida por cambios estructurales Pre-mRNA

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Using Sniper-Cas9 to Minimize Off-target Effects of CRISPR-Cas9 Without the Loss of On-target Activity Via Directed Evolution

Uso de francotirador Cas9 para minimizar efectos Off-target de CRISPR Cas9 sin la pérdida de actividad en blanco mediante evolución dirigida

The development of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated protein 9 (Cas9) into therapeutic modalities requires the ...