Name: in vitro directed evolution of a restriction endonuclease with more stringent specificity
Uploaded: 2020-03-25T15:00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Directed Evolution of a Restriction Endonuclease with More Stringent Specificity at JoVE.com

Detta arbete stöddes av anslag från ministeriet för vetenskap och högre utbildning (0295/B/PO1/2008/34 till MB och N301 100 31/3043 till KS), från Polska National Science Centre (NCN) (UMO-2011/02/A/NZ1/00052, UMO-2014/13/B/NZ1/03991 och UMO-2014/14/M/NZ5/00558 till MB) och genom kortvarig EMBO-stipendium till KS (ATSF 277.00-05).

<ol>
	<li>Sch&#246;ttler, S., Wenz, C., Lanio, T., Jeltsch, A., Pingoud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+engineering+of+the+restriction+endonuclease+EcoRV--structure-guided+design+of+enzyme+variants+that+recognize+the+base+pairs+flanking+the+recognition+site.">Protein engineering of the restriction endonuclease EcoRV--structure-guided design of enzyme variants that recognize the base pairs flanking the recognition site.</a> European Journal of Biochemistry. 258 (1), 184-191 (1998).</li><li>Wenz, C., Hahn, M., Pingoud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+variants+of+the+restriction+endonuclease+EcoRV+that+depend+in+their+cleavage+activity+on+the+flexibility+of+sequences+flanking+the+recognition+site.">Engineering of variants of the restriction endonuclease EcoRV that depend in their cleavage activity on the flexibility of sequences flanking the recognition site.</a> Biochemistry. 37 (8), 2234-2242 (1998).</li><li>Samuelson, J. C., Xu, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+restriction+endonuclease+BstYI+to+achieve+increased+substrate+specificity.">Directed evolution of restriction endonuclease BstYI to achieve increased substrate specificity.</a> Journal of Molecular Biology. 319 (3), 673-683 (2002).</li><li>Samuelson, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+a+rare-cutting+restriction+enzyme:+genetic+screening+and+selection+of+NotI+variants.">Engineering a rare-cutting restriction enzyme: genetic screening and selection of NotI variants.</a> Nucleic Acids Research. 34 (3), 796-805 (2006).</li><li>Rimseliene, R., Maneliene, Z., Lubys, A., Janulaitis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+restriction+endonucleases:+using+methylation+activity+of+the+bifunctional+endonuclease+Eco57I+to+select+the+mutant+with+a+novel+sequence+specificity.">Engineering of restriction endonucleases: using methylation activity of the bifunctional endonuclease Eco57I to select the mutant with a novel sequence specificity.</a> Journal of Molecular Biology. 327 (2), 383-391 (2003).</li><li>Morgan, R. D., Luyten, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+engineering+of+type+II+restriction+endonuclease+DNA+binding+and+cleavage+specificity.">Rational engineering of type II restriction endonuclease DNA binding and cleavage specificity.</a> Nucleic Acids Research. 37 (15), 5222-5233 (2009).</li><li>Skowronek, K., Boniecki, M. J., Kluge, B., Bujnicki, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+engineering+of+sequence+specificity+in+R.MwoI+restriction+endonuclease.">Rational engineering of sequence specificity in R.MwoI restriction endonuclease.</a> Nucleic Acids Research. 40 (17), 8579-8592 (2012).</li><li>Czapinska, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+Structure+and+Directed+Evolution+of+Specificity+of+NlaIV+Restriction+Endonuclease.">Crystal Structure and Directed Evolution of Specificity of NlaIV Restriction Endonuclease.</a> Journal of Molecular Biology. 431 (11), 2082-2094 (2019).</li><li>Miller, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+by+in+vitro+compartmentalization.">Directed evolution by in vitro compartmentalization.</a> Nature Methods. 3 (7), 561-570 (2006).</li><li>Zheng, Y., Roberts, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+restriction+endonucleases+using+artificial+cells.">Selection of restriction endonucleases using artificial cells.</a> Nucleic Acids Research. 35 (11), e83 (2007).</li><li>Takeuchi, R., Choi, M., Stoddard, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redesign+of+extensive+protein-DNA+interfaces+of+meganucleases+using+iterative+cycles+of+in+vitro+compartmentalization.">Redesign of extensive protein-DNA interfaces of meganucleases using iterative cycles of in vitro compartmentalization.</a> Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 111 (11), 4061-4066 (2014).</li><li>Howland, J. L., Ausubel, F., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Short Protocols in Molecular Biology. , (1995).</li><li>Wilson, D. S., Keefe, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+8+Unit+8.3:+Random+mutagenesis+by+PCR.">Chapter 8 Unit 8.3: Random mutagenesis by PCR.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (2001).</li></ol>

Författarna har inget att avslöja.

Urvalsprotokollet som beskrivs här testades för NlaIV8, en dimeric PD-(D/E)XK fold recognition sekvens som känner igen en palindromic målplats med centrala NN baser och katalyserar en trubbig ände skära mellan NN baser. NlaIV plockades eftersom klyvning mellan NN baser tyder på att dessa baser är nära proteinet i komplexet. I princip kan protokollet användas för alla sekvensspecifika begränsningardonuclease, monomeric eller dimeric, av någon vikgrupp, katalyserande dubbla strängbrytningar av någon förskjutning, oavsett om katalytiska och specificitetsdomäner sammanfaller (som i NlaIV-exemplet) eller är separata (t.ex. FokI). Dessutom är protokollet i princip användbart inte bara för generering av nya, mer smala enzym specificitet, men kan också användas för att eliminera stjärnaktiviteter, eller för att skapa high fidelity endonucleases. Allt detta har dock inte testats ännu. I synnerhet kan riktad eliminering av stjärnaktivitet vara komplicerat, eftersom samma aminosyrarester kan vara inblandade i att binda till de önskade och oönskade baserna. De in vitro-steg som beskrivs i detta protokoll är inte begränsade till valet av begränsade specificiteter, men kan också användas för att välja annars ändrade särdrag. Det finns dock då ett problem med variant endonucleases: om spektrumet av substrat innehåller nya mål som inte klyvs av föräldrarnas endonuclease, det finns i allmänhet inget bra sätt att skydda celler från de skadliga effekterna av denna verksamhet. Om endonucleases specificitet endast begränsas är målen däremot en delmängd av målen av vildtyp, och därför bör den redan tillgängliga konjaksmetyltransferas vara helt skyddande.
Vårt protokoll skiljer sig i flera avseenden från många riktade evolutionsprotokoll. Öppen läsram mångfald genereras en gång i början av experimentet, inte i varje iteration. Dessutom är det skapat genom split-and-mix syntes, snarare än av EP-PCR. För NNS substitutioner av kodon, som används i detta arbete, det finns (4 x 4 x 2)6 ~ 1,07 x 109 kombinationer för sex positioner. Därför finns en viss variant i genomsnitt en gång i 1,7 fmoler av ESC. Denna kapacitet kan ökas till sju positioner med hjälp av syntes med en blandning av 20 trinukleotid prekursorer som erbjuds av Glen Research eller genom att minska mutation frekvens i mindre lovande positioner med split-and-mix oligonukleotid syntes. Om möjligt rekommenderas att man begränsar variationens omfattning till sex positioner. Uppenbarligen kräver sådan mutagenesis inriktning viss befintlig kunskap om åtminstone de regioner i REase som deltar i substrat bindande. Split-and-mix-protokollet för att skapa mångfald har tydliga fördelar jämfört med EP-PCR. Med EP-PCR erhöll vi oförändrade varianter och sekvenser med åtta substitutioner för NlaIV ESC i samma EP-PCR (tabell 4). Biblioteket från EP-PCR innehåller en betydande del av kloner som bör undvikas (vilda sekvenser, flera substitutioner, frameshift och nonsens mutationer och mutationer på platser som sannolikt inte påverkar sekvens specificitet).
Vårt protokoll skiljer sig också från många andra riktade evolution protokoll genom förekomsten av två sekventiella urval steg. Positiv markering säkerställer att önskad aktivitet behålls, annars tas inte biotintaggen bort och kodningssekvensen kan tas bort genom dragningskraft. Det är tekniskt möjligt att den slumpartade uppkomsten av en ny, icke-överlappande specificitet (t.ex. GCATGC) kan leda till avskiljande av biotintaggen också, om en lämplig klyvningsplats finns nära den önskade klyvningen, men inte någon annanstans. Detta bör dock vara högst osannolikt. Negativ markering tar bort öppna läsramar som kodar för enzymer som fortfarande har oönskad aktivitet. Det här steget är inte strikt obligatoriskt, eftersom protokollet fortfarande kommer att berika utdatabiblioteket med varianter som kan klyva urvalssekvensen men inte kan klyva någon annanstans i ESC, vilket gör det olämpligt för PCR-förstärkning. Urvalseffektiviteten förväntas dock vara lägre eftersom enzymer med den ursprungliga sekvenss specificiteten inte kommer att tas bort från produktionen och kommer att konkurrera ut lovande varianter med förändrad specificitet men också minskad enzymatiska aktivitet. Observera att på befolkningsnivå kan både önskade och oönskade målsekvenser, men behöver inte vara, urarta. I NlaIV-exemplet urartade antimålet och målet icke-degenererat. Även när det finns degenererad på befolkningsnivå, i en enda droppe endast ett (icke-degenererat) mål eller anti-mål är närvarande. I vårt protokoll återinförs mål- och målsekvenser vid varje upprepning av urvalsstegen. Därför måste en öppen läsram koda ett enzym som kan klyva alla möjliga mål, och inte kan klyva någon av anti-mål, för att överleva flera urval rundor. Observera att behovet av att återinföra antiselection-målet vid varje iteration av protokollet upprätthåller två sekventiella PCRs. Den första PCR använder en primer som glödar utanför anti-målet, så att klyvning av anti-målet förhindrar PCR-reaktionen. Den andra PCR kräver en primer som når bortom anti-målet, och återinför anti-mål, för att se till att under flera omgångar av urval, varje öppen läsram testas mot alla varianter av anti-målet.
För enzymer som genererar klibbiga ändar kan ett relaterat alternativt protokoll baserat på en tidigare beskriven metod för isolering av REase ORF10 användas. Utarmningen av inaktiva varianter genom biotinfångst som används i våra experiment ersätts i det alternativa protokollet genom ligering av den kompatibla adaptern med en sekvens som används som en primerbindningsplats i en selektiv PCR (figur 9). Endast ESC som producerar enzymer med den valda specificiteten genererar ligeringskompatibla ändar och kommer därför att väljas ut. Sekvensen av den klibbiga änden av den valda räknarsekvensen måste utformas på ett sådant sätt att den inte kan delta i ligering med adaptrar. Iteration av urvalsprocessen kan enkelt uppnås genom att växla mellan två olika adaptrar och därmed två olika omvända primers i selektiv PCR.
Även med nya protokoll, uppgiften att ingenjörskonst nya särdrag in vitro är fortfarande mycket utmanande. För typiska typ II REases beror sekvenss specificitet och endonucleolytisk aktivitet på samma proteinregioner. Det är därför svårt att ändra det ena utan att påverka den andra. Framgång görs mer sannolikt genom en strategi som tar hänsyn till fotavtryck av enzymet, respekterar symmetrin i protein-DNA interaktioner, och bygger på befintliga enzymatiska preferenser, som bör fastställas i förväg i biokemiska experiment, som gjordes för NlaIV exempel8.

Sekvens specificitetsteknik är extremt utmanande för klass II REases. I denna klass av endonucleases, sekvens erkännande och katalys är nära sammanflätade, troligen som en evolutionär skydd mot skapandet av en endonuclease av bredare specificitet än dess konjak metyltransferas, vilket skulle skada värd DNA. Riktad utveckling av nya särdrag i celler kompliceras ytterligare av behovet av att skydda värd-DNA mot den nykonstruerade endonucleaseaktiviteten. Därför finns det bara ett fåtal framgångsrika försök av REase teknik rapporterade och alla av dem utnyttja de unika egenskaperna hos ett visst enzym1,2,3,4,5,6,7.
Här tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll för specificitetsteknik som kan användas för att generera endonuclease varianter som har smalare specificitet än ett föräldraenzym som bygger på vår framgångsrika teknik för en NlaIV endonuclease8. För ett sådant enzym med en godtycklig igenkänningssekvens kan extra specificitet införas för baser i flankerna. För föräldraenzymer som känner igen delvis degenererade sekvenser (såsom NlaIV med sitt GGNNCC-mål), kan ytterligare specificitet också införas inom igenkänningssekvensen. Eftersom extra specificitet sannolikt kommer att kräva protein-DNA-kontakter, bör de nyligen erkända baserna ligga inom fotavtryck av föräldrarnas endonuclease på DNA. I princip kan urvalsscheman ställas in för önskad specialisering av igenkänningssekvensen. Men de flesta REases som känner igen palindromic och nästan palindromic målsekvenser är funktionella dimers som känner igen endast en halv-plats av palindrorome. Därför är det osannolikt att valet av nya specificiteter som bryter mot symmetrin hos proteinkärna interaktioner kommer att fungera. För dimeric NlaIV, till exempel, ggnncc-sekvensen kan teoretiskt begränsas till GGATCC men att minska specificiteten ner till GGAACC förväntas bli svårare. Vårt system innebär både positivt och negativt urval.
Processen är effektivare när negativt urval också används för att ta bort de särdrag som kan klyva alla sekvenser än den föredragna smalare specificiteten. Val för GGATCC kan till exempel kombineras med antiselection mot GGBVCC (där B är någon annan bas än A och V är någon annan bas än T). När några av de möjliga målsekvenserna inte täcks beror resultatet av urvalsexperimentet på effektiviteten av ett positivt och negativt urval. I vårt NlaIV-arbete valde vi för GGATCC, och mot GGSSCC (där S är G eller C), och fick en specificitet som, ignorera symmetri bryta mål, kan beskrivas som GGWWCC (där W är A eller T), vilket tyder på att i detta fall, negativt urval var mer viktigt än positivt urval.
Vår strategi börjar med att skapa en uttrycksvalskassett (ESC). ESK är uppbyggd i sektioner. På insidan av kärnan avsnitt finns varianter av den öppna avläsningsramen (ORF) av REase, under T7 promotorn kontroll. Den här kärndelen av ESC kan inte innehålla någon cognate-plats för den konstruerade REase. Kärnan är inklämd mellan två cognate platser för vild typ REase: en klyvning plats för oönskad aktivitet (counter vald sekvens, GGSSCC i detta exempel) och en klyvning plats för önskad aktivitet (vald sekvens, GGATCC i exemplet). Det sista steget i beredningen av ESC i PCR lägger till biotin nära önskad aktivitet vid 5's och skapar en mängd olika counter valda sekvenser (GGSSCC i exemplet). Urvalsstrategin bygger på användning av noggrant utformade grundfärger vid ESC:s omförstärkningsprotokoll efter ett in vitro-protokoll för transkription/översättning/urval (figur 1A). Esc-biblioteket uttrycks i en in vitro-uppdelad transkriptionsöversättning vatten-i-olja emulsion9,,10,11. Inom varje droppe påverkar det uttryckta enzymets specificitet ESK:s tillstånd (figur 1B, steg I). För det beskrivna arrangemanget tar den önskade klyvningsaktiviteten hos det översatta proteinet bort DNA:s biotintagg men påverkar inte den andra ESC-änden med den valda räknarsekvensen. När emulsionen bryts avlägsnas biotinylerade fragment genom streptavidin affinitets pulldown, så att endast fragment från droppar med önskad aktivitet kvarstår (figur 1B, steg II). Det här steget tar bort inaktiva REase-varianter. Den supernatant fraktionen av pull-down-steget förstärks sedan av PCR. I de första PCR-reaktionsprimrarna används F2 och R1 (figur 1A, B, steg III). Primer F2 binder till ESC-sektionen mellan den valda räknarsekvensen och molekyländen. Därför förstärks inte ESCs som uttrycker varianter som kan klyva den valda räknarsekvensen (och därför separera bindningsställena för grundfärgerna F2 och R1 i två olika DNA-molekyler) och tas därmed bort från biblioteket. Primern R1 binder mellan den valda platsen och kärnan i ESC så att den inte påverkas av klyvningsstatusen för det valda området och återställer klyvningsplatsen för önskad aktivitet (GGATCC). Cykeln stängs av en andra PCR (med grundfärger F1 och R2) som lägger till biotin i 5'-änden nära den valda platsen och återställer den utformade variationen vid den disk valda platsen nära den motsatta änden av ESC(figur 1B, steg IV). Den resulterande DNA-blandningen är klar för en ny urvalsrunda.
Framgången för urvalsprotokollet beror starkt på det korrekta valet av den nya, strängare måligenkänningssekvensen och på noggrann utformning av mutagenesis-strategin och dess effektiva genomförande. Eftersom det är mycket lättare att förbättra på små befintliga preferenser REase än att övervinna dem, rekommenderar vi att börja med en kinetisk studie av eventuella befintliga preferenser. Nödvändigheten av noggrann mutagenesis design resultat från den begränsade storleken på en mutant bibliotek som kan behandlas av det presenterade protokollet (109 kloner i ett enda experiment). Därför kan alla 20 möjliga aminosyrasubstitutioner testas effektivt i endast ett fåtal positioner (se Diskussion). Slumpmässig mutagenesis, såsom felbenägna PCR (EP-PCR) presenteras som en alternativ metod, kommer att leda till djupgående undersampling av befintliga komplexitet. Om någon information om potentiella aminosyra positioner som deltar i kontakter med DNA (eller ens ligger i närheten av degenererade nukleotider i en cognate sekvens) är tillgänglig, det säkert bör användas för att välja några aminosyror för oligonukleotid guidad mättnad mutagenesis (protokoll steg 1.6-3.10).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1000&#197; CPG Support (dA, dT, dC, dG)</td>
			<td>Biosset</td>
			<td>45-1000-050</td>
			<td>Other vendors can be used as well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ASM-800 DNA/RNA</td>
			<td>Biosset</td>
			<td>800-001-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJET Gel Extraction Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K0691</td>
			<td>Any other kit can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glen-Pak DNA purification cartridge</td>
			<td>Glen Research</td>
			<td>60-5200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIS-Select Nickel Affinity Gel</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET 28a vector</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any other vector with T7 promoter upstream of plycloning site can be used instead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td>Any other high fidelity and highly processive thermophilic polymearse can be used instead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porous steel foil</td>
			<td>Biosset</td>
			<td>40-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid Translation System 
			RTS 100, E.coli HY Kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3 186 148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction endonucleases</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Obviously other vendors, enzymes can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Magnetic Beads</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>S1420S</td>
			<td>Other vendors can be used as well. We have positively tested beds form Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthesis chemicals including phosphoramidities</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td></td>
			<td>Other vendors can be used as well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthesis columns (different sizes)</td>
			<td>Biosset</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EL0011</td>
			<td>Any other ligase can be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro directed evolution of a restriction endonuclease with more stringent specificity

Begränsning endonuclease (REase) specificitet teknik är extremt svårt. Här beskriver vi ett flerstegsprotokoll som hjälper till att producera REase-varianter som har strängare specificitet än föräldraenzymet. Protokollet kräver att ett bibliotek med uttrycksvalskassetter (ESCs) skapas för varianter av REase, helst med variationer i positioner som kan påverka DNA-bindning. ESK flankeras på ena sidan av en sekvens för den önskade begränsningsplatsens aktivitet och en biotintagg och på andra sidan av en begränsningsplats för oönskad aktivitet och en grundsatsglödplats. ESCs transkriberas och översätts i en vatten-i-olja emulsion, under förhållanden som gör förekomsten av mer än en DNA-molekyl per droppe osannolikt. Därför utsätts DNA i varje kassettmolekyl endast för aktiviteten hos det översatta, kodade enzymet. REase varianter av önskad specificitet ta bort biotin taggen men inte primer glödgning webbplats. Efter att ha brutit emulsionen utsätts DNA-molekylerna för en biotin pulldown, och endast de i supernatanten behålls. Det här steget säkerställer att endast ESC för varianter som inte har förlorat önskad aktivitet behålls. Dessa DNA-molekyler utsätts sedan för en första PCR-reaktion. Klyvning i den oönskade sekvensen skär av primerbindningsstället för en av grundfärgerna. Därför förstärkare PCR endast ESCs från droppar utan oönskad aktivitet. En andra PCR-reaktion utförs sedan för att återinföra begränsningsplatsen för önskad specificitet och biotintaggen, så att urvalssteget kan upprepas. Valda öppna läsramar kan överuttryckas i bakterieceller som också uttrycker cognate metyltransferas av föräldrarnas REase, eftersom den nyligen utvecklade REase riktar endast en delmängd av metyltransferas målplatser.

Detta protokoll är bara ett verktyg för att öka frekvensen av önskade varianter av en konstruerad REase genom att tömma (men inte eliminera) två oönskade klasser: inaktiva enzymer och endonucleases med oförändrad vild typ sekvens specificitet. Å andra sidan, eftersom ändra REase specificitet är extremt svårt, att hitta även en sådan variant producerar en klyvning mönster som skiljer sig från den vilda typ enzym i en enda screening av 24 kloner bör betraktas som en framgång. I våra händer de bästa skärmarna kunde identifiera upp till 20% av lovande varianter (Figur 8A).
Det positiva resultatet beror i hög grad på bibliotekets kvalitet (dvs. begränsad frekvens av substitutioner och deras slumpmässiga spridning) och en effektiv fångst av biblioteksmedlemmarnas biotinylerade population (steg 3.6–3.7). Båda problemen kan upptäckas. Bibliotekets kvalitet bör kontrolleras före valet genom sekvensering av så många kloner som möjligt (>15) eller genom direkt sekvensering av biblioteket genom sekvensering av högt genomflöde (steg 3.10, tabell 3). Om en majoritet av de valda klonerna inte är aktiva är detta en tydlig indikation på fel på streptavidin-fångstvalet. En liknande effekt observeras när det gäller bibliotek som genomgår många urvalscykler, eftersom sådana bibliotek troligen domineras av inaktiva varianter som undgått streptavidin fånga urvalssteg (Figur 8B). Därför är det lämpligt att köra screening efter varje urvalscykel och vidareutveckla manuellt utvalda lovande varianter snarare än att vara beroende av urvalsiteration.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig1.jpg"> Figur 1: In vitro-urval av en ny sekvenssubsitet baserad på NlaIV-teknik. (A)Organisationen av uttrycket / val kassett (ESC) omfattar två erkännande platser för REase, 1) den valda sekvensen (GGATCC) nära den högra änden och 2) räknaren vald sekvens (GGSSCC) nära den vänstra änden, samt T7p och T7t-T7 promotorn och T7 terminator. Primerbindningsplatserna visas nedan. Klyvning av vild typ och valda NlaIV-varianter visas som röda respektive gröna trianglar. B)Urvalscykelsteg: I) Emulgering av transkriptions-översättning-klyvningsreaktion blandas med ESC-biblioteket. II) Allt biotinylerat DNA fångas upp på magnetiska partiklar belagda med streptavidin och avlägsnas, vilket avlägsnar kodning av inaktiva varianter. III) ESC-kodning REases med vild typ aktivitet (dvs. de som kan klyva GGSSCC sekvens) elimineras eftersom klyvning av sekvensen skiljer bindning platser för framåt och omvänd primers. Därför sker ingen förstärkning av dessa ekonomiska och ekonomiska och medelstora företag. IV) Indata för nästa urvalsrunda skapas genom tillägg av biotin i den högra änden och återinföra variationen av de räknare valda sekvenserna i den vänstra änden. Omtryckt från Czapinska et al.8 med tillstånd från Elsevier. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig2.jpg"> Figur 2: Förberedelse av ESK. Fragment som härrör från den ursprungliga konstruktionen i en uttrycksvektor som innehåller NlaIV ORF under kontroll av T7-promotorn ändrades för att vara lämplig för uttryck/urval. NlaIV-platsen nedströms från NlaIV ORF togs bort och unika platser (SalI, EcoRI och Eco52I) som användes för att mutagenisera utvalda positioner introducerades i NlaIV ORF som tysta mutationer. Den slutliga konstruktionen förstärktes med flankerande primers som introducerade två flankerande NlaIV-platser: Den räknare som valts sekvens (GGSSCC) till vänster och vald sekvens (GGATCC) till höger. Den omvända primern introducerade också biotin. Grundfärger som används för att skapa muterade ECS visas som blå pilar och märkta nedan (se tabell 1B,C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig3.jpg"> Figur 3: System för split och blandningssyntes. Exemplet avser MutB primer syntes där en NNS sekvens infördes vid 0,8 frekvens vid fyra positioner (se även tabell 3). Observera att kemisk syntes utförs från 3'till 5' men alla sekvenser visas i kanonisk 5'-3' orientering (dvs. det utgår från höger till vänster i detta schema). Wild typ sekvenser på mutagenized positioner visas i grönt medan NNS mutagena sekvenser är i rött. SalI erkännande webbplats som senare används för att införa mutationer i ESCs är understruken. Blandnings- och delningssteg (2 och 4) anges. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig4.jpg"> Figur 4: Användning av unika restriktionsenzymplatser i oligonukleotid riktade mutagenesis. Strategin för mutation introduktion visas på ett exempel på byggandet av bibliotek A-C (se steg 3.1-3.7). Omtryckt från Czapinska et al.8 med tillstånd från Elsevier. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig5.jpg"> Figur 5: Endonucleolytisk klyvning i in vitro-transkriptionsöversättning. (A)Klyvning av ett testsubstrat i optimal REase-buffert: 1) Substrat, 612 bp PCR-produkt med ett enda NlaIV-igenkänningsställe. 2) Klyvningsprodukter, 355 bp och 257 bp.(B)Klyvning i en in vitro-transkriptionsöversättningsreaktion (innehållande 0,5 μg ESC): 1–2) 15 μL alikvoter av översättning av in vitro-transkription utan substrat (linje 2: reaktion kompletterad med 1,5 mM MgCl2). 3–4) 15 μL alikvoter av in vitro-transkriptionsöversättning med 1 μg testsubstrat; (linje 4: reaktion kompletterad med 1,5 mM MgCl2). S-DNA storlek markör (pBR322 röt med MspI). Prover löstes i 6% native PAGE. DNA var fläckat med ethidiumbromid. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig5large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig6.jpg"> Figur 6: Produkter från den första PCR i urvalscykeln. Se figur 1B, steg III. protokoll steg 5.10. Kolumnuppsättningar 1 och 2 är alikvoter av två olika bibliotek som laddas i tre exemplar. S-DNA storlek standard (lambda DNA rötas med HindIII och EcoRI). Pilen anger positionen för eSK för fullängd (1 050 bp). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig6large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig7.jpg"> Figur 7: NlaIV-varianter renas för vidare screening i miniskala. Se steg 6.3.11. Varje rad innehåller en 10 μL alikvot av en annan variant. S-proteinmolekylvikt standard. Molekylmassan av NaIV REase underavdelning är 29,9 kDa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig7large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig8.jpg"> Figur 8: Exempel på screening av NlaIV-varianter för sekvensspecifikitetsändring. Se steg 6.4.2. (A) Framgångsrik screening med hög frekvens av lovande varianter. S = DNA-storleksmarkör, lambda DNA klyvs med HindIII och EcoRI; Vild typ (wt) = lambda DNA klyvs med vild typ NlaIV; λ = lambda DNA substrat, inte klyvs; andra kolumner=varianter med mycket låg aktivitet. Varianter är märkta ! = lovande varianter som producerar ett klyvningsmönster som skiljer sig från det vilda typenzymet; ? = varianter som också kan ha ändrat sekvensinställning. (B)Misslyckad screening, med en majoritet av varianter inaktiva och en variant med till synes oförändrad klyvning mönster. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig8large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig9.jpg"> Figur 9: Alternativt val efter ligering. Detta alternativ kan användas för alla REases generera klibbiga ändar. Här presenterar vi ett exempel protokoll för ett urvalssystem för MwoI enzym (opublicerade). I) Vald sekvens (placerad i den högra änden av ESK) med definierade rester som visas i rött och valt varianter av konjakssekvensen som visas i blått. Inom parenteser under den markerade räknarsekvensen som ska placeras i den vänstra änden av ESK visas. II) Produkt av MwoI klyvning; III) Efter avslutad in vitro-transkription/översättning renas produkterna och ligering utförs med överflödig adapter. Endast klyvningsprodukter som klyvs i den valda sekvensen kan delta i ligering. Därför elimineras inaktiva varianter och pulldown-steget är onödigt. Klyvningsprodukten i den valda räknarsekvensen (till vänster i esc,inte visas) kan inte delta i denna ligering eftersom den utskjutande änden av adaptern inte kompletterar den valda räknarsekvensen. IV) Selektiv PCR använder samma strategi som i huvudprotokollet för att eliminera varianter med wild type degenererad sekvenss specificitet (F1 primer bindning distala till den counter valda platsen) medan inaktiva varianter elimineras av den selektiva omvänd primer som inte kan binda till uncleaved (och därför inte ändras av adapter ligering) högra änden. I nästa cykel kan processen itereras med hjälp av adapter som är identisk med klyvningsprodukten i föregående steg (dvs. den "klyvade kassetten" i panel III) och en lämplig selektiv omvänd primer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig9large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Tabell 1: Grundfärger som används i NlaIV-teknik. Sekvenser av de begränsningsplatser som nämns i kommentarerna är understrukna. Små bokstäver indikerar sekvenser som inte har komplement i DNA-mallarna. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/table1.xlsx" target="_blank">Klicka här för att se den här tabellen (Högerklicka för att ladda ner).</a>
Tabell 2: Villkor för PCR-reaktioner som skall användas i protokollet. Tm = primersmältningstemperatur (om Tm är annorlunda för grundfärgerna bör den nedre Tm användas). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/table2.xlsx" target="_blank">Klicka här för att se den här tabellen (Högerklicka för att ladda ner).</a>
Tabell 3: Resultat av kvalitetskontrollen av två mutagena grundfärger syntetiseras med split-and-mix strategi. Mutagenized kodon indikeras med [XXX]. Ett lägre indexnummer anger positionen för en kodad aminosyra. Anpassad från Czapinska et al.8 med tillstånd från Elsevier. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/table3.xlsx" target="_blank">Klicka här för att se den här tabellen (Högerklicka för att ladda ner).</a>
Tabell 4: Resultat från EP-PCR. Huvudsakliga parametrar som härleds från sekvensanalys av 22 kloner av ECS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/table4.xlsx" target="_blank">Klicka här för att se den här tabellen (Högerklicka för att ladda ner).</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Directed Evolution of a Restriction Endonuclease with More Stringent Specificity at JoVE.com

In Vitro Directed Evolution of a Restriction Endonuclease with More Stringent Specificity

Begränsning endonucleases med nytt ordnar specificitet kan framkallas från enzym som känner igen ett delvist degenererat ordnar. Här tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll som vi framgångsrikt använde för att ändra sekvenss specificitet nlaIV enzym. Viktiga ingredienser i protokollet är in vitro-uppdelning av transkriptions-/översättningsreaktionen och valet av varianter med nya sekvenssub specificiteter.

In Vitro Riktad Evolution av en begränsning Endonuclease med strängare specificitet

Restriction endonuclease (REase) specificity engineering is extremely difficult. Here we describe a multistep protocol that helps to produce REase ...

Vårt protokoll möjliggör skapandet av restriktionsenzymer med förändrad, strängare sekvensspekpekt med hjälp av in vitro-compartmentalization och en unik urvalsstrategi i riktad evolution. Potentiellt är det ganska universellt, eftersom det bör vara tillämpligt på alla begränsningar endonuclease och urval kan riktas mot någon strängare version av en ursprunglig cognate sekvens. Om nyskapade varianter uttrycks genom in vitro-transkription-translation, är protokollet lämpligt inte bara för att minska specificiteten, utan också för att ändra specificitet.Att besluta platser för subsaturation mutagenesis, välj mutagenesis frekvenser enligt den hypotetiska betydelsen av de platser, hålla gränser för den totala biblioteket komplexitet i åtanke. För att börja syntesen, infoga kolumner som har packat med ny harts i synthesizern. Syntetisera oligonukleotider i alla kolumner upp till tripletten, omedelbart före den andra subsaturationen mutagenesis site räkna från tre-prime slutet.Syntetisera, lämnar en fem-prime trityl grupp i slutet. Den skyddande gruppen kommer att tas bort i början av nästa syntescykel. Öppna synteskolumnerna och kort centrifug i torra 1,5 milliliterrör för att samla in kådan.Dra CPG-syntesstödet och blanda genom att virvelning. Re-partitionera den blandade CPG hartset i nya synteskolumner. Undvik att införa fuktighet eftersom det kommer att minska den totala avkastningen.Fortsätt syntesen, med början från delaturationen mutagenesis plats triplet. Tilldela kolumner till randomiserade NNS-trillingar eller wild-type triplets enligt önskad mutagenesfrekvens. Om ytterligare delatureringsplatser förekommer, fortsätt endast till tripleten som föregår nästa delaturerings-mutagenesis-platsen.Om inga fler delatureringsställen är närvarande nedströms, slutföra syntesen, lämnar en fem-främsta trityl grupp i slutet. Använd bredborrade pipettspetsar för att förbereda en oljetendigmedelsblandning genom att tillsätta 225 mikroliter på Span 80 och 25 mikroliter av Tween 80 till fem milliliter mineralolja i ett koniskt rör på 15 milliliter. Blanda noggrant genom mild inversion 15 gånger.Blandningen vid detta steg ska vara genomskinlig. För varje bibliotek, överför 950 mikroliter av blandningen oljetenaktant till en två milliliter rund botten kryogena vial. Etikett med ett biblioteksnamn och överföring till is.Sätt en liten cylindrisk omrörning bar i varje injektionsflaska. Förbered en in vitro-transkriptions-översättningsreaktionsblandning enligt tillverkarens förslag. Komplettera blandningen med magnesiumklorid till en slutkoncentration på 1,5 millimolar.Dispensera 50 mikroliter alikvoter av reaktionsblandningen i 1,5 milliliterrör på is. Tillsätt 1,7 femtomoles av biblioteket till reaktionsblandningen på is. Förbered vatten-i-olja emulsion i följd för varje bibliotek genom att först placera en liten bägare fylld med is på en magnetisk omrörare med omrörning hastighet inställd på 1150 RPM.Överför sedan en kryogen injektionsflaska med 950 mikroliter oljetenaktmedelsblandning och en liten omrörningsbar till en iskall bägare på magnetomröraren. Kontrollera att omrörningsstången snurrar. Tillsätt fem 10-mikroliter alikvoter av in vitro-biblioteket transkription-översättning blandningen under en tvåminuters period i 30 sekunders intervaller och fortsätta omrörning i ytterligare en minut.Överför injektionsflaskan med emulsionen till en isbehållare. Vid denna punkt bör vätskan vara ogenomskinlig, inte genomskinlig. Fortsätt sedan med nästa bibliotek.Efter att alla biblioteken har bearbetats, starta inkubationen av alla biblioteken enligt kittillverkarens rekommendationer. Överför injektionsflaskan till den temperatur som är optimal för den konstruerade endonukleasen i ytterligare två timmar innan du placerar dem på is i minst 10 minuter. Överför emulsionerna från de kryogena injektionsflaskan i 1,5 milliliterrör.Lägg till en mikroliter av 5 molar EDTA. Och centrifugera dem vid 13, 000 gånger g i fem minuter vid rumstemperatur. Om du efter centrifugering inte kan se vatten-olja gränssnittet klart, frysa blandningen före aspiration av den övre oljefasen.Flytta den övre oljefasen med en pipett och kassera. Omedelbart utföra extraktion genom att lägga till 150 mikroliter av fenolkloroform och 100 mikroliter av 10 millimolar Tris-HCl till vattenfasen. Vortex och utför därefter fasskiljning via 30 sekunders centrifugering vid 13 000 gånger g.Samla den övre vattenfasen. Fäll ut DNA genom att tillsätta 15 mikroliter av tre-molar natriumacetat, 2,5 till fem mikrogram glykogen, och 375 mikroliter etanol. Efter inkubering av proverna vid minus-20 grader Celsius i en timme, centrifug i 15 minuter vid 13, 000 gånger g, fyra grader Celsius.Kassera supernatanten och tvätta kort pelleten med en milliliter kall 70%etanol. Torka DNA-glykogenpelt i en hastighetsvakning eller lufttork längre än fem minuter. Lös sedan upp pelleten i 50 mikroliter på 10 millimolar Tris-HCl.Därefter lägger du till fem mikroliter streptavidin magnetiska pärlor, förberedda enligt tillverkarens instruktioner. Blanda i en timme i rumstemperatur, helst i en karusellblandare eller genom skonsam virvel. Överför rören till ett magnetiskt stativ för att separera pärlorna.Samla sedan vätskan berikad i DNA utan biotin. Detta protokoll är ett verktyg för att öka frekvensen av önskade varianter av konstruerad begränsning endonucleases genom att tömma inaktiva enzymer och endonucleases med oförändrad vild-typ sekvens specificitet. Framgångsrik screening kan identifiera upp till 20%av lovande varianter.Varianter är märkta som lovande varianter om de producerar ett klyvningsmönster som skiljer sig från det vilda enzymet. Varianter som kan ha ändrat sekvenspreferensen är också märkta. Visas här är en misslyckad screening med majoriteten av varians inaktiva och en variant med till synes oföränderliga klyvning mönster.I det här fallet är biblioteken domineras troligen av inaktiva varianter som undkom steget för streptavidin capture-valet. Det är avgörande att noggrant utforma de utvalda och motvalda sekvenserna och att begränsa biblioteksmångfald genom mutagenesis strategi som genererar substitutioner på endast ett fåtal utvalda positioner. De bästa varianterna som väljs ut ska noggrant karakteriseras för bindning och klyvningskinetik på föredragna och inte klyvda sekvenser baserade på resultaten från den inledande screeningen.I vårt testfall valdes mutagenesis platser baserat på en homologi modell. Överraskande, en kristallstruktur senare visade att vissa förändrade rester är mest sannolikt inte i direkt kontakt med DNA.

Research

JoVE Journal

Genetics

Design and Use of a Low Cost, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution of Bacteria Under Antibiotic Drug Selection

Utformning och användning av en låg kostnad, Automated Morbidostat för Adaptive Evolution av bakterier under antibiotikum Drug Val

We describe a low cost, configurable morbidostat for characterizing the evolutionary pathway of antibiotic resistance. The morbidostat is a bacterial ...

Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat

Förfarande för adaptiv Laboratory Evolution av mikroorganismer med hjälp av en kemostat

Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) ...

Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development

Genome redigering och riktad differentiering av hPSCs för Förhöra Lineage bestämmelse i Human Pancreatic utveckling

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding ...

Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans

Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans

Kvantifiering av Information kodas av genen uttryck nivåer under livslängden modulering enligt bred-range kosttillskott begränsning i C. elegans

Sensory systems allow animals to detect, process, and respond to their environment. Food abundance is an environmental cue that has profound effects on ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation av en gen-stört Streptococcus mutans stam utan genen kloning

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Testing the Role of Multicopy Plasmids in the Evolution of Antibiotic Resistance

Testning Multicopy plasmider roll i utvecklingen av antibiotikaresistens

Multicopy plasmids are extremely abundant in prokaryotes but their role in bacterial evolution remains poorly understood. We recently showed that the ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Genome-wide övervakning av transkription fel i eukaryota organismer

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

Producerar genen borttagningar i Escherichia coli av P1 transduktion med punktskattepliktiga antibiotikaresistens kassetter

A first approach to study the function of an unknown gene in bacteria is to create a knock-out of this gene. Here, we describe a robust and fast protocol ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

Använda i Vitro och i cell form att undersöka småmolekylära inducerad Pre-mRNA strukturella förändringar

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Using Sniper-Cas9 to Minimize Off-target Effects of CRISPR-Cas9 Without the Loss of On-target Activity Via Directed Evolution

Med Sniper-Cas9 att minimera Off-target effekter av CRISPR-Cas9 utan förlust av på målet aktiviteten Via riktad Evolution

The development of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated protein 9 (Cas9) into therapeutic modalities requires the ...