Name: in vitro directed evolution of a restriction endonuclease with more stringent specificity
Uploaded: 2020-03-25T15:00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Directed Evolution of a Restriction Endonuclease with More Stringent Specificity at JoVE.com

Bu çalışma, Bilim ve Yüksek Öğretim Bakanlığı'nın (0295/B/PO1/2008/34-MB ve N301 100 31/3043 to KS) Polonya Ulusal Bilim Merkezi'nden (UMO-2011/02/A/NZ1/00052, UMO-2014/13/B/NZ1/03991 ve UMO-2014/14/M/NZ5/00558'den MB'ye) ve Kısa vadeli EMBO bursu ile KS'ye (ATSF 277.00-05).

<ol>
	<li>Sch&#246;ttler, S., Wenz, C., Lanio, T., Jeltsch, A., Pingoud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+engineering+of+the+restriction+endonuclease+EcoRV--structure-guided+design+of+enzyme+variants+that+recognize+the+base+pairs+flanking+the+recognition+site.">Protein engineering of the restriction endonuclease EcoRV--structure-guided design of enzyme variants that recognize the base pairs flanking the recognition site.</a> European Journal of Biochemistry. 258 (1), 184-191 (1998).</li><li>Wenz, C., Hahn, M., Pingoud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+variants+of+the+restriction+endonuclease+EcoRV+that+depend+in+their+cleavage+activity+on+the+flexibility+of+sequences+flanking+the+recognition+site.">Engineering of variants of the restriction endonuclease EcoRV that depend in their cleavage activity on the flexibility of sequences flanking the recognition site.</a> Biochemistry. 37 (8), 2234-2242 (1998).</li><li>Samuelson, J. C., Xu, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+restriction+endonuclease+BstYI+to+achieve+increased+substrate+specificity.">Directed evolution of restriction endonuclease BstYI to achieve increased substrate specificity.</a> Journal of Molecular Biology. 319 (3), 673-683 (2002).</li><li>Samuelson, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+a+rare-cutting+restriction+enzyme:+genetic+screening+and+selection+of+NotI+variants.">Engineering a rare-cutting restriction enzyme: genetic screening and selection of NotI variants.</a> Nucleic Acids Research. 34 (3), 796-805 (2006).</li><li>Rimseliene, R., Maneliene, Z., Lubys, A., Janulaitis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+restriction+endonucleases:+using+methylation+activity+of+the+bifunctional+endonuclease+Eco57I+to+select+the+mutant+with+a+novel+sequence+specificity.">Engineering of restriction endonucleases: using methylation activity of the bifunctional endonuclease Eco57I to select the mutant with a novel sequence specificity.</a> Journal of Molecular Biology. 327 (2), 383-391 (2003).</li><li>Morgan, R. D., Luyten, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+engineering+of+type+II+restriction+endonuclease+DNA+binding+and+cleavage+specificity.">Rational engineering of type II restriction endonuclease DNA binding and cleavage specificity.</a> Nucleic Acids Research. 37 (15), 5222-5233 (2009).</li><li>Skowronek, K., Boniecki, M. J., Kluge, B., Bujnicki, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+engineering+of+sequence+specificity+in+R.MwoI+restriction+endonuclease.">Rational engineering of sequence specificity in R.MwoI restriction endonuclease.</a> Nucleic Acids Research. 40 (17), 8579-8592 (2012).</li><li>Czapinska, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+Structure+and+Directed+Evolution+of+Specificity+of+NlaIV+Restriction+Endonuclease.">Crystal Structure and Directed Evolution of Specificity of NlaIV Restriction Endonuclease.</a> Journal of Molecular Biology. 431 (11), 2082-2094 (2019).</li><li>Miller, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+by+in+vitro+compartmentalization.">Directed evolution by in vitro compartmentalization.</a> Nature Methods. 3 (7), 561-570 (2006).</li><li>Zheng, Y., Roberts, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+restriction+endonucleases+using+artificial+cells.">Selection of restriction endonucleases using artificial cells.</a> Nucleic Acids Research. 35 (11), e83 (2007).</li><li>Takeuchi, R., Choi, M., Stoddard, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redesign+of+extensive+protein-DNA+interfaces+of+meganucleases+using+iterative+cycles+of+in+vitro+compartmentalization.">Redesign of extensive protein-DNA interfaces of meganucleases using iterative cycles of in vitro compartmentalization.</a> Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 111 (11), 4061-4066 (2014).</li><li>Howland, J. L., Ausubel, F., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Short Protocols in Molecular Biology. , (1995).</li><li>Wilson, D. S., Keefe, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+8+Unit+8.3:+Random+mutagenesis+by+PCR.">Chapter 8 Unit 8.3: Random mutagenesis by PCR.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (2001).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Burada açıklanan seçim protokolü NlaIV8için test edilmiştir , merkezi NN üsleri ile bir palindromik hedef site tanır ve NN üsleri arasında künt bir uç kesim katalizler dimeric PD-(D/E)XK kat tanıma dizisi. NN bazları arasındaki bölünme bu bazların kompleksteki proteine yakın olduğunu gösterdiği için NlaIV seçilmiştir. Prensip olarak, protokol herhangi bir katlanır grubun herhangi bir dizi özel kısıtlama ensonükleaz, monomerik veya dimeric, katalalitik ve özgüllük etki alanları çakışıyor (NlaIV örnekte olduğu gibi) ya da ayrı (örneğin, FokI) olup olmadığına bakılmaksızın, herhangi bir stagger çift iplikçik tatili katalize için kullanılabilir. Ayrıca, prensipte protokol sadece yeni, daha dar enzim özgüllüğü üretimi için değil, aynı zamanda yıldız aktivitelerini ortadan kaldırmak veya yüksek sadakat endokleazları oluşturmak için de kullanılabilir. Ancak, tüm bu henüz test edilmemiştir. Aynı amino asit artıkları istenilen ve istenmeyen bazlara bağlanmada rol tutulabileceğinden, özellikle yıldız aktivitesinin hedefli ortadan kaldırılması karmaşık olabilir. Bu protokolde açıklanan in vitro adımlar daraltılmış özelliklerin seçimi yle sınırlı değildir, ancak başka türlü değiştirilmiş özellikleri seçmek için de kullanılabilir. Ancak, varyant endokleazlarla ilgili bir sorun vardır: eğer substrat spektrumu ebeveyn endokleazı tarafından ayrılmayan yeni hedefler içeriyorsa, hücreleri bu aktivitenin zararlı etkilerinden korumanın genel olarak iyi bir yolu yoktur. Buna karşılık, ensonükleaz özgüllüğü sadece daraltılırsa, hedefler yabani tip hedeflerin bir alt kümesidir ve bu nedenle zaten mevcut olan cognate metetiltransferaz tamamen koruyucu olmalıdır.
Protokolümüz birçok yönelimli evrim protokolünden birçok açıdan farklıdır. Açık okuma çerçevesi çeşitliliği, her yinelemede değil, denemenin başında bir kez oluşturulur. Ayrıca, EP-PCR yerine bölme ve karıştırma sentezi ile oluşturulur. Bu çalışmada kullanıldığı gibi kodonların NNS ikameleri için altı pozisyon için (4 x 4 x 2)6 ~ 1,07 x 109 kombinasyonları vardır. Bu nedenle, herhangi bir varyant ESC 1.7 fmoles bir kez ortalama olarak mevcuttur. Glen Research tarafından sunulan 20 trinükleotid öncüllerinin karışımı yla sentez kullanılarak veya split-and-mix oligonükleotid sentezi ile daha az umut verici pozisyonlarda mutasyon frekansı azaltılarak bu kapasite yedi konuma yükseltilebilir. Mümkünse, varyasyonun kapsamını altı konumla sınırlamak önerilir. Açıkçası, bu tür mutagenez hedefleme substrat bağlama dahil REase en azından bölgeleri hakkında bazı önceden varolan bilgi gerektirir. Çeşitlilik oluşturmak için split-and-mix protokolü EP-PCR ile karşılaştırıldığında net avantajlara sahiptir. EP-PCR kullanarak, aynı EP-PCR'de NlaIV ESC'ler için sekiz ikame taşıyan değişmemiş varyantlar ve diziler elde ettik(Tablo 4). EP-PCR'nin kütüphanesi, kaçınılması gereken klonların önemli bir kısmını içerir (vahşi tip dizileri, çoklu değişimler, kare kayması ve saçma mutasyonlar ve dizi özgüllüğünü etkilemeolasılığı düşük yerlerdeki mutasyonlar).
Protokolümüz aynı zamanda diğer birçok yönlendirilmiş evrim protokolünden iki sıralı seçim adımı nın varlığı ile farklıdır. Pozitif seçim istenilen aktivitenin korunmasını sağlar, aksi takdirde biotin etiketi kaldırılmaz ve kodlama sırası aşağı çekilerek kaldırılabilir. Teknik olarak, bir romanın tesadüfi ortaya çıkması, örtüşmeyen özgüllük (örneğin, GCATGC) biotin etiketinin kesilmesine yol açabilir, eğer uygun bir dekolte alanı istenilen dekolte yakınında mevcutsa, ancak başka bir yerde değil. Ancak, bu son derece olası olmalıdır. Negatif seçim, hala istenmeyen aktiviteye sahip enzimleri kodlayan açık okuma çerçevelerini kaldırır. Bu adım kesinlikle zorunlu değildir, çünkü protokol yine de çıkış kitaplığını seçim sırasını bozabilecek ancak ESC'nin başka bir yerinde ayrılamayan varyantlarla zenginleştirecek, bu nedenle pcr amplifikasyon için uygun hale getirecektir. Ancak, orijinal dizi özgüllüğüne sahip enzimler çıktıdan çıkarılmayacağı ve değişmiş özgüllüğe sahip umut verici varyantları aşacağı, aynı zamanda enzimaktivitesini azaltacağı için seçim etkinliğinin daha düşük olması beklenmektedir. Nüfus düzeyinde, hem istenilen hem de istenmeyen hedef dizilerinin dejenere olabileceğini, ancak buna gerek olmadığını unutmayın. NlaIV örneğinde, anti-hedef dejenere ve hedef dejenere değildi. Nüfus düzeyinde dejenerati olsa bile, tek bir damlacıkta sadece bir (dejenere olmayan) hedef veya anti-hedef mevcuttur. Protokolümüzde, seçim adımlarının her tekrarında hedef ve hedef karşıtı diziler yeniden tanıtılır. Bu nedenle, açık bir okuma çerçevesi, mümkün olan tüm hedefleri yarık yeteneğine sahip ve birden fazla seçim mermisi hayatta kalmak için anti-hedeflerin herhangi birini yarık mümkün bir enzim kodlamak gerekir. Protokolün her yinelemesinde antiselection hedefini yeniden başlatma gereksiniminin iki sıralı PCR uyguladığına dikkat edin. İlk PCR anti-hedef dışında anneals bir astar kullanır, böylece anti-hedef bölünmesi PCR reaksiyonu önler. İkinci PCR, anti-hedefin ötesine ulaşan bir astar gerektirir ve birden fazla seçim turunda her açık okuma çerçevesinin hedef karşıtı tüm varyantlara karşı test edildiğinden emin olmak için anti-hedefi yeniden tanıtır.
Yapışkan uçlar üreten enzimler için, REase ORF10'un izolasyonu için daha önce tanımlanmış bir yönteme dayalı ilgili bir alternatif protokol kullanılabilir. Deneylerimizde kullanılan biotin yakalama ile inaktif varyantların tükenmesi, uyumlu bağdaştırıcının seçici bir PCR'de astar bağlama sitesi olarak kullanılan bir dizi ile bağlanması ile alternatif protokolde değiştirilir (Şekil 9). Sadece seçilen özgüllükte enzim üreten ESC'ler ligasyon alabilen uçlar üretirler ve bu nedenle seçilir. Sayaç eselected dizisinin yapışkan uç sırası adaptörleri ile ligasyon katılamaz şekilde tasarlanmalıdır. Seçim sürecinin yinelemesi, seçici PCR'de iki farklı bağdaştırıcı ve dolayısıyla iki farklı ters astar arasında geçiş yaparak kolayca elde edilebilir.
Yeni protokollerle bile, in vitro'da yeni özellikleri netme görevi hala çok zordur. Tipik tip II REases için, dizi özgüllüğü ve endonükleolitik aktivite aynı protein bölgelerine bağlıdır. Bu nedenle diğerini etkilemeden birini değiştirmek zordur. Başarı, enzimin ayak izini dikkate alan, protein-DNA etkileşimlerinin simetrisine saygı gösteren ve NlaIV örnek8'deolduğu gibi biyokimyasal deneylerde önceden belirlenmesi gereken önceden var olan enzimatik tercihler üzerine inşa edilen bir strateji yle daha olası hale getirilmiştir.

Dizi özgüllük mühendisliği sınıf II REases için son derece zordur. Bu ensonükleaz sınıfında, dizi tanıma ve kataliz yakından iç içedir, büyük olasılıkla konak DNA'sına zarar verecek olan daha geniş özgüllükte bir ensonükleaz yaratılmasına karşı evrimsel bir koruma olarak. Hücrelerdeki yeni özelliklerin yönlendirilmiş evrimi, konak DNA'sını yeni tasarlanmış endonükleaz aktivitesine karşı koruma ihtiyacı ile daha da karmaşık hale getirir. Bu nedenle, REase mühendislik bildirilen sadece birkaç başarılı girişimleri vardır ve hepsi belirli,bir enzim1,2,3,,4,5,6,7benzersiz özellikleri yararlanmak .
Burada bir NlaIV enonuclease8bizim başarılı mühendislik dayalı bir ebeveyn enzim daha dar özgüllük var ensonükle varçları oluşturmak için kullanılabilecek özgüllük mühendisliği için ayrıntılı bir protokol sağlar. Keyfi tanıma dizisi olan bu tür bir enzim için, yanlarda bazlar için ekstra özgüllük getirilebilir. Kısmen dejenere dizileri tanıyan ebeveyn enzimleri için (GGNNCC hedefi olan NlaIV gibi), tanıma sırası içinde ek özgüllük de ortaya çıkabilir. Ekstra özgüllük muhtemelen protein-DNA temasları gerektirecektir gibi, yeni tanınan bazlar DNA üzerinde ebeveyn enonukleaz ayak izi içinde yalan olmalıdır. Prensip olarak, tanıma sırasının istenilen herhangi bir uzmanlık için seçim şemaları ayarlanabilir. Ancak, palindromik ve neredeyse palindromik hedef dizileri tanımak en REases palindrom sadece yarım site tanıyan fonksiyonel dimers vardır. Bu nedenle, protein nükleik etkileşimlerinin simetrisini ihlal eden yeni özgüllüklerin seçilmesi pek olası değildir. Dimeric NlaIV için, örneğin, GGNNCC dizisi teorik olarak GGATCC'ye daraltılabilir ancak özgüllüğü GGAACC'ye kadar daraltmanın daha zor olması beklenir. Planımız hem olumlu hem de olumsuz seçimi içerir.
Negatif seçim, tercih edilen dar özgüllük dışında tüm dizileri cleave mümkün özellikleri kaldırmak için de kullanıldığında işlem daha verimlidir. Örneğin, GGATCC seçimi GGBVCC'ye karşı antiseçimle birleştirilebilir (B'nin A'dan başka bir baz olduğu ve V'nin T'den başka bir baz olduğu). Olası hedef dizilerden bazıları ele alınmadığında, seçim deneyinin sonucu pozitif ve negatif seçimin etkinliğine bağlıdır. NlaIV çalışmamızda GGATCC için ve GGSSCC'ye karşı (S'nin G veya C olduğu yer) seçildik ve simetri kırma hedeflerini göz ardı ederek GGWWCC (W'nin A veya T olduğu yerde) olarak tanımlanabilecek bir özgüllük elde ettik ve bu özel durumda negatif seçimin daha fazla olduğunu öne sürdük. pozitif seçimden daha önemlidir.
Yaklaşımımız bir ifade seçim kaseti (ESC) oluşturulması ile başlar. ESC bölümler halinde yapılandırılmıştır. İç çekirdek bölümünde, T7 organizatörü kontrolü altında, REase açık okuma çerçevesi (ORF) türevleri vardır. ESC'nin bu çekirdek bölümü, tasarlanmış REase için herhangi bir biliş alanı içeremez. Çekirdek vahşi tip REase için iki cognate siteleri arasında sıkışmış: istenmeyen etkinlik için bir bölünme sitesi (sayaç seçilen sıra, ggSCcbu örnekte) ve istenen etkinlik için bir bölünme sitesi (seçilen sıra, ggATCC örnekte). PCR ESC hazırlanması son adım 5 'sonunda istenilen aktiviteyakın biotin ekler ve sayaç seçilen dizileri çeşitli oluşturur (örnekte GGSSCC). Seçim stratejisi, esc reamplifikasyon protokolünde dikkatle tasarlanmış astarların in vitro transkripsiyon/çeviri/seçim protokolünden sonra kullanılmasına dayanır (Şekil 1A). ESC kütüphane bir in vitro bölümlü transkripsiyon çeviri su-in-oil emülsiyon99,10,,11ifade edilir. Her damlacık içinde, ifade edilen enzimin özgüllüğü ESC'nin durumunu etkiler(Şekil 1B, adım I). Açıklanan düzenleme için, çevrilen proteinin istenilen bölünme aktivitesi DNA'nın biyotin etiketini kaldırır, ancak sayaç seçilen sıra ile diğer ESC ucunu etkilemez. Emülsiyon kırıldığında, biyotinylated parçaları streptavidin yakınlık pulldown tarafından kaldırılır, böylece istenilen aktivite ile damlacıklardan sadece parçaları kalır(Şekil 1B, adım II). Bu adım, etkin olmayan REase türevlerini kaldırır. Çekme adımın supernatant fraksiyonu daha sonra PCR tarafından yükseltilir. İlk PCR reaksiyon astarlarında F2 ve R1 kullanılır(Şekil 1A,B,adım III). Primer F2, sayaç seçili sıra ile molekül sonu arasındaki ESC bölümüne bağlanır. Bu nedenle, sayaç seçilen sırayı ayırabilen (ve bu nedenle F2 ve R1'in bağlama alanlarını iki farklı DNA molekülü olarak ayıran) varyantları ifade eden ESC'ler yükseltilmez ve böylece kitaplıktan çıkarılır. Astar R1, seçilen sitenin bölünme durumundan etkilenmemesi için seçilen site ile ESC'nin çekirdeği arasında bağlanır ve istenilen etkinlik (GGATCC) için bölünme alanını geri yükler. Döngü, seçilen siteye yakın 5' ucuna biotin ekleyen ikinci bir PCR (F1 ve R2 ile) tarafından kapatılır ve ESC'nin karşı ucuna yakın seçilen sitede tasarlanan varyasyonu geri getirir(Şekil 1B, adım IV). Ortaya çıkan DNA karışımı başka bir seçim turu için hazırdır.
Seçim protokolünün başarısı, yeni, daha sıkı hedef tanıma dizisinin doğru seçimine ve mutagenez stratejisinin dikkatli tasarımına ve etkin uygulanmasına bağlıdır. REase'in önceden var olan küçük tercihlerini geliştirmek, bunları aşmaktan çok daha kolay olduğundan, önceden var olan tercihlerin kinetik bir çalışmasıyla başlamanızı öneririz. Dikkatli mutagenez tasarımının gerekliliği, sunulan protokol (tek bir deneyde 109 klon) ile işlenebilen bir mutant kütüphanesinin sınırlı boyutundan kaynaklanmaktadır. Bu nedenle tüm 20 olası amino asit ikameleri etkili sadece birkaç pozisyonda test edilebilir (Tartışma bakınız). Alternatif bir yöntem olarak sunulan hataya meyilli PCR (EP-PCR) gibi rastgele mutagenez, mevcut karmaşıklığın derin bir şekilde örnek alınmasına yol açacaktır. DNA ile temaslarda yer alan potansiyel amino asit pozisyonları ile ilgili herhangi bir bilgi (hatta bir cognate dizisinde dejenere nükleotidlere yakın bir konumda bulunan) varsa, oligonükleotid güdümlü doygunluk mutagenezi için birkaç amino asit seçmek için kesinlikle kullanılmalıdır (protokol adımları 1.6-3.10).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1000&#197; CPG Support (dA, dT, dC, dG)</td>
			<td>Biosset</td>
			<td>45-1000-050</td>
			<td>Other vendors can be used as well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ASM-800 DNA/RNA</td>
			<td>Biosset</td>
			<td>800-001-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJET Gel Extraction Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K0691</td>
			<td>Any other kit can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glen-Pak DNA purification cartridge</td>
			<td>Glen Research</td>
			<td>60-5200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIS-Select Nickel Affinity Gel</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET 28a vector</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any other vector with T7 promoter upstream of plycloning site can be used instead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td>Any other high fidelity and highly processive thermophilic polymearse can be used instead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porous steel foil</td>
			<td>Biosset</td>
			<td>40-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid Translation System 
			RTS 100, E.coli HY Kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3 186 148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction endonucleases</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Obviously other vendors, enzymes can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Magnetic Beads</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>S1420S</td>
			<td>Other vendors can be used as well. We have positively tested beds form Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthesis chemicals including phosphoramidities</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td></td>
			<td>Other vendors can be used as well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthesis columns (different sizes)</td>
			<td>Biosset</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EL0011</td>
			<td>Any other ligase can be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro directed evolution of a restriction endonuclease with more stringent specificity

Kısıtlama endokleaz (REase) özgüllük mühendisliği son derece zordur. Burada ebeveyn enziminden daha sıkı özgüllüklere sahip REase varyantları üretmeye yardımcı olan çok aşamalı bir protokolü açıklıyoruz. Protokol, DNA bağlamasını etkileme olasılığı yüksek pozisyonlarda değişkenlik ile ideal olarak REase varyantları için ifade seçim kasetleri (ESCs) bir kütüphane oluşturulmasını gerektirir. ESC, istenilen kısıtlama alanı aktivitesi için bir dizi, bir biyotin etiketi ve diğer tarafta istenmeyen aktivite için bir kısıtlama alanı ve astar lama alanı ile çevrilidir. ESC'ler, damlacık başına birden fazla DNA molekülünün varlığını olası hale getiren koşullarda, petrol de su emülsiyonuna dönüştürülür ve tercüme edilir. Bu nedenle, her kaset molekülündeki DNA sadece çevrilmiş, kodlanmış enzimin aktivitesine maruz kalmaktadır. İstenilen özgüllük REase türevleri biotin etiketi ni kaldırır, ancak astar lama sitesini kaldırmaz. Emülsiyon kırıldıktan sonra, DNA molekülleri bir biotin pulldown tabi tutulur, ve sadece supernatant olanlar korunur. Bu adım, yalnızca istenen etkinliği kaybetmemiş varyantlar için ESC'lerin korunamadığını garanti eder. Bu DNA molekülleri daha sonra ilk PCR reaksiyonuna maruz kalınır. İstenmeyen dizideki dekolte astarlardan biri için astar bağlama alanını keser. Bu nedenle, PCR istenmeyen etkinlik olmadan damlacıklardan sadece ESC'leri güçlendirir. İkinci bir PCR reaksiyonu daha sonra istenilen özgüllük ve biyotin etiketi için kısıtlama alanı yeniden tanıtmak için yapılır, böylece seçim adımı yinelenebilir. Seçilen açık okuma çerçeveleri aynı zamanda ebeveyn REase cognate metiltransferaz ifade bakteri hücrelerinde aşırı ifade edilebilir, yeni evrimleşmiş REase metiltransferaz hedef sitelerin sadece bir alt kümesi hedefleri çünkü.

Bu protokol sadece bir mühendislik REase istenilen türevlerinin sıklığını artırmak için iki istenmeyen sınıfları tüketerek (ama ortadan kaldırarak değil): inaktif enzimler ve değişmemiş yabani tip dizi özgüllüğü ile ensonükleazlar. Öte yandan, REase özgüllüğünü değiştirmek son derece zor olduğundan, 24 klondan oluşan tek bir taramada yabani tip enzimden farklı bir dekolte deseni üreten böyle bir varyantı bile bulmak bir başarı olarak kabul edilmelidir. Elimizde en iyi ekranlar umut verici türevlerinin %20'sine kadar(Şekil 8A)tanımlayabilir.
Olumlu sonuç, kütüphane kalitesine (yani sınırlı sıklıkta ikamelere ve rasgele dağılımlarına) ve kütüphane üyelerinin biyotinylated popülasyonunun etkin bir şekilde yakalanmasına (3.6-3.7. adım) bağlıdır. Her iki sorun da algılanabilir. Kitaplık kalitesi seçimden önce mümkün olduğunca çok klon sıralayarak (>15) veya kitaplığın doğrudan sıralanmasıyla yüksek iş bölümü sıralaması (adım 3.10, Tablo 3)ile kontrol edilmelidir. Seçilen klonların çoğunluğu etkin değilse, bu streptavidin yakalama seçiminin başarısızlığının açık bir göstergesidir. Bu tür kütüphaneler büyük olasılıkla streptavidin yakalama seçim adımı(Şekil 8B)kaçan inaktif varyantları tarafından hakim olduğu için, birçok seçim döngüleri geçmesi kütüphaneler durumunda benzer bir etki görülmektedir. Bu nedenle, her seçim döngüsünden sonra tarama çalıştırmak ve daha fazla seçim yineleme bağlı yerine el ile seçilmiş umut verici türevleri geliştirmek için tavsiye edilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig1.jpg"> Şekil 1: NlaIV mühendisliğine dayalı yeni bir dizi özgüllüğünün in vitro seçimi. (A)İfade/seçim kasetinin (ESC) organizasyonu, REase için iki tanıma sitesi, 1) seçilen sıra (GGATCC) sağ uca yakın ve 2) sol uca yakın sayaç seçili sıra (GGSSCC) ile T7p ve T7t-T7 organizatörü ve T7 terminatör içerir. Astar bağlama siteleri aşağıda gösterilmiştir. Yabani tip ve seçili NlaIV varyantlarına göre bölünme sırasıyla kırmızı ve yeşil üçgenler olarak gösterilir. (B) Seçim döngüsü adımları: I) Transkripsiyon-çeviri-bölünme reaksiyonunun ESC kütüphanesi ile birleştirilmesi; II) Tüm biyotinylated DNA streptavidin ile kaplı manyetik parçacıklar üzerinde yakalanır ve kaldırılır, böylece kodlama inaktif varyantları kaldırarak; III) REase'leri vahşi tip aktivitesi ile kodlayan ESC'ler (yani GGSSCC dizisini ayırabilenler) ortadan kaldırılır, çünkü dizinin bölünmesi ileri ve geri astarlar için bağlama sitelerini ayırır. Bu nedenle, bu ESCs hiçbir amplifikasyon oluşur; IV) Bir sonraki seçim turuiçin giriş sağ uçta biotin ilavesi ve sol uçta seçilen sayaç dizilerinin varyasyonunun yeniden tanıtılması yla oluşturulur. Elsevier'in izniyle Czapinska ve ark.8'den yeniden basıldı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig2.jpg"> Şekil 2: ESC'nin hazırlanması. T7 organizatörü kontrolü altında NlaIV ORF içeren bir ifade vektörü orijinal yapıttından türetilen parça ifade / seçim için uygun olacak şekilde değiştirilmiştir. NlaIV ORF'den aşağı yayılan NlaIV sitesi kaldırıldı ve seçilen pozisyonları mutagenize etmek için kullanılan benzersiz siteler (SalI, EcoRI ve Eco52I) NlaIV ORF'de sessiz mutasyonlar olarak tanıtıldı. Son yapı, iki yan NlaIV sitesi tanıtan yan astarlarla güçlendirilmiştir: solda sayaç seçilen sıra (GGSSCC) ve sağda seçilen sıra (GGATCC). Ters astar da biotin tanıttı. Mutasyona uğramış ECS'lerin oluşturulmasında kullanılan astarlar mavi oklar olarak gösterilir ve aşağıda etiketlenir (bkz. Tablo 1B,C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig3.jpg"> Şekil 3: Bölme ve karışım sentezi şeması. Örnek, bir NNS dizisinin dört pozisyonda 0,8 frekansta tanıtıldığı MutB astar sentezini ifade eder (ayrıca bkz. Tablo 3). Kimyasal sentezin 3' den 5'e kadar yapıldığını ancak tüm sekansların 5'-3' oryantasyonda gösterildiğini unutmayın (yani bu şemada sağdan sola doğru ilerler). NNS mutajenik dizileri kırmızı renkte iken mutajenleşmiş pozisyonlarda yabani tip dizileri yeşil olarak gösterilir. Daha sonra ESC'lerde mutasyonları tanıtmak için kullanılan SalI tanıma sitesi altı çizilir. Karıştırma ve bölme adımları noktaları (2 ve 4) belirtilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig4.jpg"> Şekil 4: Oligonükleotid hedefli mutagenezde benzersiz restriksiyon enzim bölgelerinin kullanımı. Mutasyona giriş stratejisi A-C kütüphanelerinin inşasının bir örneğinde gösterilmiştir (bkz. 3.1-3.7. adımlar). Elsevier'in izniyle Czapinska ve ark.8'den yeniden basıldı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig5.jpg"> Şekil 5: Endonükleolitik bölünme in vitro transkripsiyon-çeviri. (A) Optimal REase tampon bir test substrat dekoltesi: 1) Substrat, tek bir NlaIV tanıma sitesi ile 612 bp PCR ürün; 2) Dekolte ürünleri, 355 bp ve 257 bp.(B) Dekolte bir in vitro transkripsiyon-çeviri reaksiyonu (ESC 0.5 μg içeren): 1-2) 15 μL in vitro transkripsiyon çeviri substrat olmadan aliquots (satır 2: reaksiyon 1.5 mM MgCl2ile tamamlanır ); 3–4) 1 μg test substratı ile in vitro transkripsiyon-çeviri15 μL aliquots; (satır 4: reaksiyon 1.5 mM MgCl2ile desteklenmiştir). S-DNA boyutu belirteci (pBR322 MspI ile sindirilir). Örnekler %6 yerli SAYFA'da çözüldü. DNA ethidyum bromürle lekelenmiş. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig6.jpg"> Şekil 6: Seçim döngüsündeki ilk PCR ürünleri. Bkz. Şekil 1B, adım III; protokol adım 5.10. Sütun kümeleri 1 ve 2, üç etekli olarak yüklenen iki farklı kütüphanenin aliquotlarıdır. S-DNA boyutu standardı (HindIII ve EcoRI ile sindirilmiş lambda DNA). Ok, tam uzunluktaki ESC'nin (1.050 bp) konumunu gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig7.jpg"> Şekil 7: Mini ölçekte daha fazla tarama için saflaştırılmış NlaIV varyantları. Bkz. adım 6.3.11. Her satır farklı bir varyantın 10 μL aliquot içerir. S-protein moleküler ağırlık standardı. NaIV REase alt biriminin moleküler kütlesi 29.9 kDa'dır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig8.jpg"> Şekil 8: Sıra özgüllük değişikliği için NlaIV varyantlarının tarama örnekleri. Bkz. adım 6.4.2. (A) Umut verici varyantların yüksek frekanslı başarılı tarama. S = DNA boyutu belirteç, hindIII ve EcoRI ile lambda DNA cleaved; yabani tip (wt) = lambda DNA yabani tip NlaIV ile cleaved; λ = lambda DNA substratı, cleaved değil; diğer sütunlar=çok düşük aktiviteye sahip türevleri. Varyantlar etiketlenir! = yabani tip enzimden farklı bir dekolte deseni üreten umut verici varyantlar; ? = sıra tercihini de değiştirmiş olabilecek türevleri. (B) Başarısız tarama, varyantların çoğunluğu etkin olmayan ve görünüşe göre değişmemiş dekolte deseni ile bir varyant. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig8large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig9.jpg"> Şekil 9: Ligasyona göre alternatif seçim. Bu alternatif yapışkan biter üreten tüm REases için kullanılabilir. Burada MwoI enzimi (yayınlanmamış) için bir seçim şeması için örnek bir protokol salıyoruz. I) Seçili sekans (ESC'nin sağ ucunda bulunan) tanımlı kalıntılar kırmızı ve mavi ile gösterilen biliş dizisinin seçili varyasyonu ile gösterilir. ESC'nin sol ucuna yerleştirilecek sayaç seçili sıranın altındaki parantez içinde gösterilir; II) MwoI dekoltesinin ürünü; III) İn vitro transkripsiyon/çeviri sonlandırma yapıldıktan sonra ürünler saflaştırılır ve fazla adaptörle ligasyon yapılır. Sadece seçilen dizide ayrılan dekolte ürünleri ligasyona katılabilir. Bu nedenle, etkin olmayan türevleri ortadan kaldırılır ve çekme adımı gereksizdir. Adaptörün çıkıntılı ucu sayaç seçili sıraya tamamlayıcı olmadığından, sayaç seçili dizideki dekolte ürünü (ESC'nin sol ucunda, gösterilmez) bu ligasyona katılamaz; IV) Seçici PCR, yabani tip dejenere dizi özgüllüğü (F1 astar bağlama distal sayaç seçilen siteye) ile varyantları ortadan kaldırmak için ana protokolde aynı stratejiyi kullanır, oysa inaktif varyantlar amcaaved bağlanamaz seçici ters astar tarafından ortadan kaldırılır (ve bu nedenle adaptör ligasyonu ile değiştirilmez) sağ uç. Bir sonraki döngüde işlem, bir önceki adımın dekolte ürünüyle aynı olan adaptör (yani, panel III'teki "cleaved kaset" ve uygun bir seçici ters astar kullanılarak yinelenebilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig9large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Tablo 1: NlaIV mühendisliğinde kullanılan astarlar. Yorumlarda belirtilen kısıtlama sitelerinin dizileri altı çizilmiştir. Küçük harfler, DNA şablonlarında tamamlayıcı olmayan dizileri gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/table1.xlsx" target="_blank">Bu tabloyu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklayın).</a>
Tablo 2: Protokolde kullanılacak PCR reaksiyonlarının koşulları. Tm = astar erime sıcaklığı (Tm astarlar için farklıise, alt Tm kullanılmalıdır). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/table2.xlsx" target="_blank">Bu tabloyu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklayın).</a>
Tablo 3: Bölünmüş ve karışım stratejisi ile sentezlenen iki mutajenik astarın kalite kontrolü sonuçları. Mutajenize kodonlar [XXX] ile gösterilir. Daha düşük bir indeks numarası kodlanmış bir amino asitkonumunu gösterir. Elsevier'in izniyle Czapinska ve ark.8'den uyarlanmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/table3.xlsx" target="_blank">Bu tabloyu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklayın).</a>
Tablo 4: EP-PCR sonuçları. ECS'nin 22 klonunun dizi analizinden elde edilen ana parametreler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/table4.xlsx" target="_blank">Bu tabloyu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklayın).</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Directed Evolution of a Restriction Endonuclease with More Stringent Specificity at JoVE.com

In Vitro Directed Evolution of a Restriction Endonuclease with More Stringent Specificity

Yeni dizi özgüllüğü olan restriksiyon endokleazları kısmen dejenere olmuş bir diziyi tanıyan enzimlerden geliştirilebilir. Burada, NlaIV enziminin dizi özgüllüğünü değiştirmek için başarıyla kullandığımız ayrıntılı bir protokol salıyoruz. Protokolün temel bileşenleri transkripsiyon/çeviri reaksiyonunun in vitro bölümleme ve yeni dizi özellikleri ile varyantların seçimidir.

In Vitro Yönettiği Evrim bir Kısıtlama Enonuklelease Daha Sıkı Özgüllük ile

Restriction endonuclease (REase) specificity engineering is extremely difficult. Here we describe a multistep protocol that helps to produce REase ...

Protokolümüz, in vitro kompartalizasyon ve yönlendirilmiş evrimde benzersiz bir seçim stratejisi kullanarak değiştirilmiş, daha sıkı dizi özellikleri ile restriksiyon enzimlerinin oluşturulmasına olanak sağlar. Herhangi bir kısıtlama enonuklez ve seçim orijinal bir cognate dizisinin daha sıkı sürümü doğru yönlendirilebilir olması gerektiği gibi potansiyel olarak, oldukça evrenseldir. Yeni oluşturulan varyantlar in vitro transkripsiyon-çeviri ile ifade edilirse, protokol yalnızca özgüllüğü daraltmak için değil, aynı zamanda özgüllüğü değiştirmek için de uygundur.Subsatürasyon mutagenez için sitelere karar vermek için, sitelerin varsayımsal önemine göre mutagenez frekanslarını seçin ve genel kütüphane karmaşıklığını göz önünde bulundurun. Senteze başlamak için, synthesizer içine yeni rezorin ile paketlenmiş sütunlar ekleyin. Oligonükleotidleri üçüzsütuna kadar sentezlemek, ikinci subsatürasyon mutagenez bölgesinden hemen önce üç asal uçtan sayma.Synthesize, sonunda beş-prime trityl grubu bırakarak. Koruma grubu bir sonraki sentez döngüsünün başında kaldırılacaktır. Reçine toplamak için sentez sütunları açın ve kuru 1,5 mililitre tüpler içine kısaca santrifüj.CpG sentez desteğini çekin ve girdap ile karıştırın. Karışık CpG recininyeni sentez sütunlarına yeniden bölünmesi. Genel verimi azaltacağı için nemi tanıtmaktan kaçının.Subsatürasyon mutagenesis site üçlü başlayarak, sentezdevam edin. İstenilen mutagenez frekansına göre rastgele NNS üçüzlerine veya yabani tip üçüzlere sütunatr. Ek subsatürasyon alanları varsa, sadece bir sonraki subsatürasyon mutagenesis bölgesinden önceki üçüz bölgeye ilerleyin.Akıntının aşağısında başka subsatürasyon alanı yoksa, sentezi tamamlayın ve sonunda beş asal tritil grubu bırakın. 15 mililitrelik konik bir tüpe 225 mikrolitre Span 80 ve 25 mikrolitre Tween 80 ila beş mililitre mineral yağ ekleyerek bir yağ sürfaktan karışımı hazırlamak için geniş delikli pipet ipuçları kullanın. Nazik inversiyon 15 kez iyice karıştırın.Bu adımda karışım yarı saydam olmalıdır. Her kütüphane için, iki mililitre yuvarlak alt kriyojenik şişe ye yağ sürfaktan karışımı 950 mikrolitre aktarın. Bir kütüphane adı ve buz transferi ile etiket.Her şişe içine küçük bir silindirik karıştırma çubuğu koyun. Üreticinin önerilerine göre bir in vitro transkripsiyon-çeviri reaksiyon karışımı hazırlayın. 1.5 milimolar son konsantrasyona magnezyum klorür ile karışımı tamamlayın.Reaksiyon karışımının 50 mikrolitrelik aliquotlarını buz üzerinde 1,5 mililitrelik tüplere dağıtın. Buz üzerindeki reaksiyon karışımına kütüphanenin 1,7 femtomol'lerini ekleyin. İlk 1150 RPM için ayarlanan karıştırma hızı ile manyetik karıştırıcı üzerine buz dolu küçük bir beher yerleştirerek her kütüphane için art arda su-in-oil emülsiyon hazırlayın.Daha sonra 950 mikrolitre yağ yüzey aktif karışımı ve küçük bir karıştırma çubuğu içeren kriyojenik bir şişeyi manyetik karıştırıcıdaki buz gibi bir kabına aktarın. Karıştırma çubuğunun döndüğünü kontrol edin. 30 saniye aralıklarla iki dakikalık bir süre içinde in vitro kütüphane transkripsiyon-çeviri karışımı beş 10 mikrolitre aliquots ekleyin ve ek bir dakika karıştırmaya devam edin.Emülsiyon ile şişeyi bir buz kabına aktarın. Bu noktada, sıvı opak değil, yarı saydam olmalıdır. Daha sonra bir sonraki kütüphaneye devam edin.Tüm kütüphaneler işlendikten sonra, kit üreticisinin önerilerine göre tüm kütüphanelerin kuluçkaya yatmasını başlatın. En az 10 dakika buz üzerine yerleştirmeden önce ek bir iki saat için tasarlanmış enonukleaz için optimum sıcaklık şişeleri aktarın. Kriyojenik şişelerden emülsiyonları 1,5 mililitrelik tüplere aktarın.5 molar EDTA bir mikrolitre ekleyin. Ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca 13,000 kez g santrifüj. Santrifüjden sonra su yağı arayüzünü net bir şekilde göremiyorsanız, üst yağ fazının aspirasyonundan önce karışımı dondurun.Bir pipet ile üst yağ fazını hareket ettirin ve atın. Hemen sulu faza fenol kloroform 150 mikrolitre ve 100 mikrolitre 10 milimolar Tris-HCl ekleyerek ekstraksiyon gerçekleştirin. Girdap ve daha sonra 13, 000 kez g 30 saniyelik santrifüj ile faz ayırma gerçekleştirmek.Üst sulu faz toplayın. Üç molar sodyum asetat 15 mikrolitre, glikojen 2,5 ila beş mikrogram ve etanol 375 mikrolitre ekleyerek DNA çökelti. Numuneleri eksi-20 derecede bir saat kuluçkaya yattıktan sonra 13, 000 kat g, 4 santigrat derecede 15 dakika santrifüj.Supernatant atın ve kısaca soğuk bir mililitre ile pelet yıkayın 70%etanol. DNA glikojen peletini bir hız vac veya hava kurutucusunda beş dakikadan daha uzun süre kurutun. Sonra 10 milimolar Tris-HCl 50 mikrolitre pelet eritin.Sonra, üreticinin talimatlarına göre hazırlanan streptavidin manyetik boncuklar, beş mikrolitre ekleyin. Oda sıcaklığında bir saat, tercihen bir atlıkarınca mikseri veya nazik girdap ile karıştırın. Boncukları ayırmak için tüpleri manyetik bir standa aktarın.Sonra biotin olmadan DNA ile zenginleştirilmiş sıvı toplamak. Bu protokol, inaktif enzimleri ve ensonükleazları değişmemiş yabani tip dizi özgüllüğü ile tüketerek mühendislik kondisyon ensonükleazlarının istenilen varyantlarının sıklığını artırmak için bir araçtır. Başarılı tarama, gelecek vaat eden varyantların %20'sine kadarını belirleyebilir.Varyantlar, yabani tip enzimden farklı bir dekolte deseni üretirlerse umut verici varyantlar olarak etiketlenirler. Sıra tercihini değiştirmiş olabilecek türevleri de etiketlenir. Burada gösterilen varyans inaktif çoğunluğu ve görünüşte değişmemiş dekolte deseni ile bir varyant ı ile başarısız bir tarama.Bu durumda, kütüphaneler büyük olasılıkla streptavidin yakalama seçim adımı kaçtı inaktif varyantları hakimdir. Seçilen ve karşı seçilen dizileri dikkatle tasarlamak ve yalnızca birkaç seçili pozisyonda ikame oluşturan mutagenez stratejisi ile kütüphane çeşitliliğini sınırlamak çok önemlidir. Seçilen en iyi varyantlar, ilk taramanın sonuçlarına göre tercih edilen ve ayrılmayan dizilerde bağlayıcı ve dekolte kinetik leri için iyice karakterize edilmelidir.Test olgumuzda homoloji modeline göre mutagenez bölgeleri seçilmiştir. Şaşırtıcı bir şekilde, bir kristal yapısı daha sonra bazı değiştirilmiş kalıntılar büyük olasılıkla DNA ile doğrudan temas olmadığını gösterdi.

Research

JoVE Journal

Genetics

Design and Use of a Low Cost, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution of Bacteria Under Antibiotic Drug Selection

Tasarım ve Düşük Maliyetli kullanımı, Otomatik Morbidostat Bakterilerin Adaptif Evolution için antibiyotik ilaç Seçimi Altında

We describe a low cost, configurable morbidostat for characterizing the evolutionary pathway of antibiotic resistance. The morbidostat is a bacterial ...

Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat

Bir Kemostat kullanarak Mikroorganizmaların Adaptif Laboratuvarı Evolution Prosedürü

Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) ...

Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development

İnsan Pankreas Geliştirme Lineage Belirleyicileri sorgulanması için Genom Düzenleme ve hPSCs arasında Yönetmen Farklılaşma

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding ...

Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans

Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans

C. elegans gen ifade seviyeleri sırasında ömrü modülasyon altında geniş menzilli diyet kısıtlama tarafından kodlanmış bilginin bir miktar

Sensory systems allow animals to detect, process, and respond to their environment. Food abundance is an environmental cue that has profound effects on ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Nesil bir gen kesintiye Streptococcus mutans çoğunlukla zorlanma olmadan Gen Klonlama

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Testing the Role of Multicopy Plasmids in the Evolution of Antibiotic Resistance

Multicopy plazmid rolü antibiyotik direnci gelişimi test

Multicopy plasmids are extremely abundant in prokaryotes but their role in bacterial evolution remains poorly understood. We recently showed that the ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Ökaryotlarda transkripsiyon hataları genom çapında gözetim

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

Escherichia coli Excisable antibiyotik direnci kasetleri ile P1 iletim tarafından üreten gen silme

A first approach to study the function of an unknown gene in bacteria is to create a knock-out of this gene. Here, we describe a robust and fast protocol ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

İn vitro ve hücre içi şeklinde küçük molekül araştırmak için kullanarak Pre-mRNA yapısal değişiklikler indüklenen

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Using Sniper-Cas9 to Minimize Off-target Effects of CRISPR-Cas9 Without the Loss of On-target Activity Via Directed Evolution

Keskin nişancı-Cas9 CRISPR-Cas9 hedef olarak faaliyet yönlendirilmiş evrim yoluyla kaybı olmadan hedef kapalı etkilerini en aza indirmek için kullanma

The development of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated protein 9 (Cas9) into therapeutic modalities requires the ...