Name: a co-culture method to study neurite outgrowth in response to dental pulp paracrine signals
Uploaded: 2020-02-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Co-Culture Method to Study Neurite Outgrowth in Response to Dental Pulp Paracrine Signals at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من قبل أ) المعاهد الوطنية للصحة / NIAMS (أرقام المنحR01 AR062507 و R01 AR053860 إلى RS) ، ب) جامعة ألاباما في برمنغهام التدريب الأكاديمي للبحوث الأكاديمية (DART) منحة (رقم T90DE0022736 (PI MacDougall)) إلى SBP من المعهد الوطني لبحوث الأسنان والعناية بالجمجمة / المعاهد الوطنية للصحة ، ج) مركز الجامعة العربية العربية العالمي لاضطرابات الوجه القحفي والفم والأسنان (GC-CODED) نموذج تجريبي ومنحة جدوى لSBP و d) المعهد الوطني لطب الأسنان والوجه القحفي البحوث / المعاهد الوطنية للصحة K99 DE024406 منحة إلى SBP.

تمت الموافقة على جميع التجارب على الفئران من قبل لجنة رعاية الحيوانات المؤسسية واستخدامها في البنك العربي المتحد (IACUC).
1. إعداد لوحة
ملاحظة: يمكن استخدام قسائم التغطيات لتصوير خلايا DP في نهاية الفحص. تأكد من أن غطاء اللوحة موجود أثناء جميع خطوات الحضانة والإنض?...

<ol>
	<li>Moe, K., Sijaona, A., Shrestha, A., Kettunen, P., Taniguchi, M., Luukko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semaphorin+3A+controls+timing+and+patterning+of+the+dental+pulp+innervation.">Semaphorin 3A controls timing and patterning of the dental pulp innervation.</a> Differentiation. 84 (5), 371-379 (2012).</li><li>Kollar, E. J., Lumsden, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tooth+morphogenesis:+the+role+of+the+innervation+during+induction+and+pattern+formation.">Tooth morphogenesis: the role of the innervation during induction and pattern formation.</a> Journal de biologie buccale. 7 (1), 49-60 (1979).</li><li>Lillesaar, C., Fried, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurites+from+trigeminal+ganglion+explants+grown+in+vitro+are+repelled+or+attracted+by+tooth-related+tissues+depending+on+developmental+stage.">Neurites from trigeminal ganglion explants grown in vitro are repelled or attracted by tooth-related tissues depending on developmental stage.</a> Neuroscience. 125 (1), 149-161 (2004).</li><li>Fried, K., Lillesaar, C., Sime, W., Kaukua, N., Patarroyo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+finding+of+pain+nerve+fibers:+Neural+growth+mechanisms+in+the+tooth+pulp.">Target finding of pain nerve fibers: Neural growth mechanisms in the tooth pulp.</a> Physiology &amp; Behavior. 92 (1-2), 40-45 (2007).</li><li>Pagella, P., Jim&#233;nez-Rojo, L., Mitsiadis, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+innervation+in+developing+and+regenerating+orofacial+tissues.">Roles of innervation in developing and regenerating orofacial tissues.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (12), 2241-2251 (2014).</li><li>Luukko, K., Kettunen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+tooth+morphogenesis+and+innervation+by+local+tissue+interactions,+signaling+networks,+and+semaphorin+3A.">Integration of tooth morphogenesis and innervation by local tissue interactions, signaling networks, and semaphorin 3A.</a> Cell Adhesion &amp; Migration. , 1-9 (2016).</li><li>Smit, M., Leng, J., Klemke, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+for+neurite+outgrowth+quantification.">Assay for neurite outgrowth quantification.</a> BioTechniques. 35 (2), 254-256 (2003).</li><li>de Almeida, J. F. A., Chen, P., Henry, M. A., Diogenes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+of+the+apical+papilla+regulate+trigeminal+neurite+outgrowth+and+targeting+through+a+BDNF-dependent+mechanism.">Stem cells of the apical papilla regulate trigeminal neurite outgrowth and targeting through a BDNF-dependent mechanism.</a> Tissue engineering. Part A. 20 (23-24), 3089-3100 (2014).</li><li>Pagella, P., Miran, S., Mitsiadis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Developing+Tooth+Germ+Innervation+Using+Microfluidic+Co-culture+Devices.">Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices.</a> Journal of Visualized Experiments. (102), e53114 (2015).</li><li>Coelen, R. J., Jose, D. G., May, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+hexadimethrine+bromide+(polybrene)+on+the+infection+of+the+primate+retroviruses+SSV+1/SSAV+1+and+BaEV.">The effect of hexadimethrine bromide (polybrene) on the infection of the primate retroviruses SSV 1/SSAV 1 and BaEV.</a> Archives of Virology. 75 (4), 307-311 (1983).</li><li>Caroni, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+growth-associated+proteins+in+the+neurons+of+adult+transgenic+mice.">Overexpression of growth-associated proteins in the neurons of adult transgenic mice.</a> Journal of neuroscience methods. 71 (1), 3-9 (1997).</li><li>Ali&#263;, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+from+mouse+strain+Thy1+YFP-16+are+a+valuable+tool+to+monitor+and+evaluate+neuronal+differentiation+and+morphology.">Neural stem cells from mouse strain Thy1 YFP-16 are a valuable tool to monitor and evaluate neuronal differentiation and morphology.</a> Neuroscience Letters. 634, 32-41 (2016).</li><li>Howroyd, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+the+Trigeminal+Ganglion+of+Nonrodent+Species+Used+in+Toxicology+Studies.">Dissection of the Trigeminal Ganglion of Nonrodent Species Used in Toxicology Studies.</a> Toxicologic Pathology. , (2019).</li><li>Schwieger, J., Esser, K. H., Lenarz, T., Scheper, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+long-term+spiral+ganglion+neuron+culture+with+reduced+glial+cell+number:+Effects+of+AraC+on+cell+composition+and+neurons.">Establishment of a long-term spiral ganglion neuron culture with reduced glial cell number: Effects of AraC on cell composition and neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 268, 106-116 (2016).</li><li>Liu, R., Lin, G., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Efficient+Method+for+Dorsal+Root+Ganglia+Neurons+Purification+with+a+One-Time+Anti-Mitotic+Reagent+Treatment.">An Efficient Method for Dorsal Root Ganglia Neurons Purification with a One-Time Anti-Mitotic Reagent Treatment.</a> PLoS ONE. 8 (4), 60558 (2013).</li><li>Burry, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimitotic+drugs+that+enhance+neuronal+survival+in+olfactory+bulb+cell+cultures.">Antimitotic drugs that enhance neuronal survival in olfactory bulb cell cultures.</a> Brain Research. 261 (2), 261-275 (1983).</li><li>Katzenell, S., Cabrera, J. R., North, B. J., Leib, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+Purification,+and+Culture+of+Primary+Murine+Sensory+Neurons.">Isolation, Purification, and Culture of Primary Murine Sensory Neurons.</a> Methods in molecular biology. 1656, 229-251 (2017).</li><li>Dussor, G. O., Price, T. J., Flores, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+transcription+factor+3+mRNA+is+upregulated+in+primary+cultures+of+trigeminal+ganglion+neurons.">Activating transcription factor 3 mRNA is upregulated in primary cultures of trigeminal ganglion neurons.</a> Molecular Brain Research. 118 (1-2), 156-159 (2003).</li><li>Lillesaar, C., Arenas, E., Hildebrand, C., Fried, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+rat+trigeminal+neurones+to+dental+pulp+cells+or+fibroblasts+overexpressing+neurotrophic+factors+in+vitro.">Responses of rat trigeminal neurones to dental pulp cells or fibroblasts overexpressing neurotrophic factors in vitro.</a> Neuroscience. 119 (2), 443-451 (2003).</li><li>Lillesaar, C., Eriksson, C., Fried, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+tooth+pulp+cells+elicit+neurite+growth+from+trigeminal+neurones+and+express+mRNAs+for+neurotrophic+factors+in+vitro.">Rat tooth pulp cells elicit neurite growth from trigeminal neurones and express mRNAs for neurotrophic factors in vitro.</a> Neuroscience Letters. 308 (3), (2001).</li><li>Lillesaar, C., Eriksson, C., Johansson, C. S., Fried, K., Hildebrand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tooth+pulp+tissue+promotes+neurite+outgrowth+from+rat+trigeminal+ganglia+in+vitro.">Tooth pulp tissue promotes neurite outgrowth from rat trigeminal ganglia in vitro.</a> Journal of neurocytology. 28 (8), 663-670 (1999).</li><li>Chmilewsky, F., Ayaz, W., Appiah, J., About, I., Chung, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+Growth+Factor+Secretion+From+Pulp+Fibroblasts+is+Modulated+by+Complement+C5a+Receptor+and+Implied+in+Neurite+Outgrowth.">Nerve Growth Factor Secretion From Pulp Fibroblasts is Modulated by Complement C5a Receptor and Implied in Neurite Outgrowth.</a> Scientific reports. 6, 31799 (2016).</li><li>Pagella, P., Neto, E., Jim&#195;&#169;nez-Rojo, L., Lamghari, M., Mitsiadis, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+co-culture+systems+for+studying+tooth+innervation.">Microfluidics co-culture systems for studying tooth innervation.</a> Frontiers in Physiology. 5, 326 (2014).</li><li>Miura, T., Yokokawa, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+culture+on+a+chip:+Developmental+biology+applications+of+self-organized+capillary+networks+in+microfluidic+devices.">Tissue culture on a chip: Developmental biology applications of self-organized capillary networks in microfluidic devices.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 58 (6), 505-515 (2016).</li></ol>

تتطلب الأنشطة اليومية لتجويف الفم أن تستشعر الأسنان المحفزات الخارجية والالتهاب اتّهات داخليًا من أجل السماح بالاستخدام السليم والصيانة. ومع ذلك ، لا تتوفر سوى معلومات محدودة بشأن الإشارات التي تحرك عمليات تطوير تعصيب الأسنان. يوفر هذا البروتوكول طريقة لعزل والمشاركة في زراعة خلايا DP ا?...

يسمح تعصيب الأسنان للأسنان باستشعار الضغط ودرجة الحرارة والالتهاب ، وكلها حاسمة لاستخدام وصيانة جهاز الأسنان. يؤدي الفشل في الشعور بألم الأسنان المرتبط بتسوس الأسنان والصدمات النفسية إلى تطور المرض. وبالتالي ، فإن التعصيب السليم هو شرط لنمو الأسنان العادية ، وظيفة والرعاية.
في حين أن معظم الأجهزة تعمل بكامل طاقتها وتُدمج بحلول وقت الولادة ، فإن تطور الأسنان يمتد إلى حياة البالغين ، مع تعصيب الأسنان والتمعدن الذي يحدث بالتنسيق خلال مراحل ما بعد الولادة1،2. ومن المثير للاهتمام أن اللب الأسنان (DP) mesenchyme تفرز في البداية إشارات طاردة أثناء تكوين الأجنة لمنع دخول محور عصبي إلى جهاز الأسنان النامية ، والتي تتحول في وقت لاحق إلى إفراز عوامل جذب مع اقتراب الأسنان من ثوران3،4. خلال مراحل ما بعد الولادة ، تخترق المحاور المحورية من العصب الثلاثي التوائم (TG) في الأسنان وفي جميع أنحاء هافيالوقت الذي يبدأ فيه ترسب دنتين (تمت مراجعته في باجيلا ، P. وآخرون5). وقد أظهرت العديد من الدراسات في الجسم الحي أن التفاعلات العصبية-mesenchymal دليل تعصيب الأسنان في الفئران (استعرضت في لوكو، K. وآخرون6)،ولكن تفاصيل قليلة من الآليات الجزيئية المتاحة.
توفر الثقافات المشتركة للخلايا بيئات خاضعة للرقابة حيث يمكن للمحققين التعامل مع التفاعلات بين الخلايا العصبية والسكان الميسينشيم. تجعل تجارب الثقافة المشتركة من الممكن التعمق في مسارات الإشارات التي توجه تعصيب الأسنان وتطورها. ومع ذلك، فإن العديد من الأساليب التقليدية المستخدمة لدراسة الخلايا في الثقافة المشتركة تطرح تحديات تقنية. على سبيل المثال، يمكن تلطيخ الكريستال البنفسجي من النيوريت outgrowth غير محددة وصمة عار شوان الخلايا المدرجة في تشتت حزمة TG، وربما يكون هناك قمم في كثافة اللون مع استجابات صغيرة نسبيا7. تقدم غرف Microfluidic خيارًا جذابًا ، ولكنها أكثر تكلفة بكثير من مرشحات ترانسويل8،9 وتسمح فقط بالتحقيق في استجابات الخلايا العصبية لإفرازات DP. لمعالجة هذه القضايا، وضعنا بروتوكوليسمح ل: أ) تلطيخ دقيق والتصوير من نمو TG neurite استجابة لإفرازات DP، ب) التعديل الوراثي للخلايا DP و / أو الخلايا العصبية TG للتحقيق في مسارات إشارة محددة، و ج) التحقيق في استجابات خلايا DP للعوامل التي تفرزها الخلايا العصبية TG. يوفر هذا البروتوكول القدرة على التحقيق بدقة في العديد من ميزات تعصيب الأسنان في البيئة الخاضعة للرقابة في فحص الثقافة المشتركة في المختبر.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-Fluoro-2&#39;-deoxyuridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0503</td>
			<td>Used as a mitotic Inhibitor at 15 &#956;M concentration in co-culture media, Day 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td>Co-culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-546 anti-chicken</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11040</td>
			<td>Secondary to stain neurite outgrowth labeled by anti-GFP antibody, 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP Antibody</td>
			<td>Aves Lab, Inc</td>
			<td>GFP-1010</td>
			<td>Primary antibody to label Thy1-YFP neurons, 1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Neurofilament 200 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NO142</td>
			<td>Monoclonal primary antibody to label neurons, 1:1000 dilution, alternative if YFP mice are not available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6;129- Tgfbr2tm1Karl/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>12603</td>
			<td>Tgfbr2f/f mouse model used for dental pulp cells in optimized protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>3709</td>
			<td>Thy1-YFP mouse model genotype used for trigeminal neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type II</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>234155-100MG</td>
			<td>Used to disperse trigeminal neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437</td>
			<td>Additive to co-culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11413-11</td>
			<td>Fine forceps for TG dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td>Coats the transwell inserts at final concentration of 10 &#956;g/ml, stock solution is assumed at 1.5 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis Buffer (Buffer RLT)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td>Extracts RNA from dental pulp cells post co-culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030081</td>
			<td>Additive to co-culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-dissecting scissors</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3146-1EA</td>
			<td>Dissection scissors to open skull</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-545-81</td>
			<td>Circlular coverslip for optional cell culturing and immunofluorescence processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimal Essential Medium a</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12571063</td>
			<td>Co-culture media base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td>Antibiotic additive to co-culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase Inhibitor</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>04 906 837 001</td>
			<td>Additive to RIPA Buffer for extracting protein from dental pulp cells post co-culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td>Used to aid in dental pulp cell transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7280</td>
			<td>Coverslip coating to aid dental pulp cellular adhesion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitors</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05 892 791 001</td>
			<td>Additive to RIPA Buffer for extracting protein from dental pulp cells post co-culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse/DNAse free eppendorf tubes</td>
			<td>Denville</td>
			<td>C-2172</td>
			<td>Presterilized 1.7 ml tubes for RNA, DNA or protein collection at the end of assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThinCert Cell Culture Insert</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>662631</td>
			<td>Transwell inserts for trigeminal neurons in co-culture assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td>Used fto disperse dental pulp cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Type II</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T-7409</td>
			<td>Used to disperse trigeminal neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11370-40</td>
			<td>Ultra fine forceps for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U3750</td>
			<td>Used as a mitotic Inhibitor at 1 &#956;M concentration in co-culture media, Day 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Filtration System</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCNY00060</td>
			<td>Steriflip disposable filter, 50 &#956;m nylon net filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>110006-15</td>
			<td>Long forceps for tissue transfer to conicals</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a co-culture method to study neurite outgrowth in response to dental pulp paracrine signals

يسمح تعصيب الأسنان للأسنان باستشعار الضغط ودرجة الحرارة والالتهاب ، وكلها حاسمة لاستخدام وصيانة جهاز الأسنان. بدون تعصيب حسي ، فإن الأنشطة الشفوية اليومية ستسبب ضررًا لا يمكن إصلاحه. على الرغم من أهميتها ، تم تجاهل أدوار التعصيب في تطوير الأسنان وصيانتها إلى حد كبير. وقد أظهرت العديد من الدراسات أن خلايا DP تفرز بروتينات مصفوفة خارج الخلية وإشارات الباراكرين لجذب وتوجيه محاور TG في جميع أنحاء السن. ومع ذلك ، قدمت دراسات قليلة نظرة مفصلة في الحديث المتبادل بين mesenchyme DP والخلايا العصبية afferents. ولمعالجة هذه الفجوة في المعرفة، بدأ الباحثون في استخدام الثقافات المشتركة ومجموعة متنوعة من التقنيات للتحقيق في هذه التفاعلات. هنا، ونحن نشرح الخطوات المتعددة المشاركة في الزراعة المشتركة الخلايا DP الأولية مع الخلايا العصبية TG المنتشرة على مرشح عبر ويل فوقمع المسام قطرها كبيرة للسماح نمو محور عصبي من خلال المسام. تم استخدام خلايا DP الأولية مع جين الفائدة محاطة بمواقع loxP لتسهيل حذف الجينات باستخدام نظام الـ Adenovirus-Cre-GFP recombinase. باستخدام الخلايا العصبية TG من الماوس Thy1-YFP يسمح للتصوير afferent دقيقة، مع التعبير أعلى بكثير من مستويات الخلفية عن طريق المجهر confocal. يمكن التحقيق في استجابات DP من خلال جمع وتحليل البروتين أو الحمض النووي الريبي ، أو بدلاً من ذلك ، من خلال تلطيخ الفلورسنت المناعي لخلايا DP المطلية على قسائم الأغطية الزجاجية القابلة للإزالة. يمكن تحليل وسائل الإعلام باستخدام تقنيات مثل التحليلات البروتينية ، على الرغم من أن هذا سيتطلب استنفاد الزلال بسبب وجود مصل الأبقار الجنينفي في وسائل الإعلام. يوفر هذا البروتوكول طريقة بسيطة يمكن التلاعب بها لدراسة الاستجابات المورفولوجية والوراثية والهيكلية للخلايا العصبية TG وخلايا DP استجابة للبيئة الخاضعة للرقابة من تحليل الثقافة المشتركة.

هذه النتائج تبين أن TG neurite النمرة قد زاد في وجود خلايا DP الأولية في البئر الكامنة مقارنة مع السيطرة على TG النوريت أحادية الاستزراع(الشكل 2A, C). هناك بعض التقلبات من أجل التقافي في نمو النيوت. وهكذا، ينبغي إدراج الثقافة العصبية TG monoculture في جميع المقالات كتحكم للكشف عن ...

Watch this Scientific Journal Video about A Co-Culture Method to Study Neurite Outgrowth in Response to Dental Pulp Paracrine Signals at JoVE.com

A Co-Culture Method to Study Neurite Outgrowth in Response to Dental Pulp Paracrine Signals

نحن نصف العزلة والتشتت والطلاء من الخلايا الأولية لب الأسنان (DP) مع الخلايا العصبية ثلاثية التوائم (TG) المستزرعة فوق مرشحات عبر ويل فوق. يمكن تحليل الاستجابات الخلوية لخلايا DP مع الفلور المناعي أو تحليل الحمض النووي الريبي / البروتين. الفلور المناعي من علامات الخلايا العصبية مع المجهر المعالبؤر يسمح تحليل استجابات نمو النيوتر.

طريقة الثقافة المشتركة لدراسة النيرايت الناء في الاستجابة لإشارات اللب الأسنان باراكرين

Tooth innervation allows teeth to sense pressure, temperature and inflammation, all of which are crucial to the use and maintenance of the tooth organ. ...

يوفر هذا البروتوكول الخطوط التفصيلية لكيفية المشاركة في زراعة الخلايا الجذعية لب الأسنان مع الخلايا العصبية ثلاثية التوائم. مع ذلك ، يمكننا التحقيق في ردود متعددة مدفوعة بتوكهم المتبادل. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي القدرة على دراسة ومعالجة أي من مجموعات الخلايا أو كليهما وقياس النتائج بدقة.هذه الطريقة لها صلة مباشرة بالبحوث العصبية ويمكن أن توفر نظرة ثاقبة في البحوث حول كيفية إصلاح الخلايا الجذعية لب الأسنان الأنسجة العصبية التالفة من الأحداث المؤلمة أو الأمراض العصبية. هناك عدة مراحل من هذه التقنية للتعلم ويمكن أن يكون من الصعب الحفاظ على قطعة من كل منهم. هذا البروتوكول تفاصيل كل مرحلة للمساعدة في ذلك.من الصعب تفريق لب الأسنان و ganglia وتتطلب دوامة مختلفة و pipetting. حتى ذلك الحين سوف لا تحصل على التشتت الكامل حتى التحسين والتكرار سوف تكون هناك حاجة. بعد القتل الرحيم من الماوس، ووضع الرأس على underpad المتاح بحيث الفم هو نحو السقف وقاعدة الرقبة مسطحة على سطح العمل.استخدم شفرة حلاقة حركة منشارة لفصل الفكي عن الفك العلوي. إزالة اللسان مع مقص أو ملقط للسماح الوصول إلى الأضراس أسهل. ضع الرأس المفتوح في الطبق فوق وسادة شاش معقمة ووضع العينة تحت المجهر التشريحي.إزالة الأنسجة العظمية السنخية المحيطة الأضراس الأولى. إدراج ملقط في فتحة السنخية وندف الأنسجة بعيدا عن الأسنان نحو جانب بوكلي أو اللغة من الفم. جمع جميع الأضراس الفك العلوي الأول ونقل بلطف الأضراس الأولى submandibular وmaxillary إلى طبق ثقافة الخلية منفصلة مع 1X PBS على الجليد.إزالة الجهاز الخارجي المينا المحيطة خارج كل الضرس الفكي الأول. مع مجموعة من ملقط تدوير الضرس بحيث cusps هي أسفل ويتم كشف الجذر المفتوح. هناك فتحة بيضاوية على الجزء السفلي من أنسجة لب الأسنان المبهمة والمعتمة مغلفة بطبقة رقيقة من العاج والمينا.باستخدام طرف من ملقط، وتخفيف بلطف لب الأسنان عن طريق تشغيل ذراع واحدة من ملقط حول محيط الداخلية من الأنسجة المعدنية. إزالة أنسجة لب الأسنان من الهيكل الممعدن ونقلها إلى طبق ثالث يحتوي على 1X PBS. إزالة الجهاز الخارجي المينا إذا لم يكن بالفعل فصل.نقل جميع أنسجة لب الأسنان إلى 0.25٪ التربسين EDTA في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر. دوامة الخليط ووضعها في 37 درجة مئوية حمام الماء الدافئ لمدة 10 دقائق. تحت غطاء معقمة، إضافة وسائل الإعلام المشتركة الدافئة إلى نسبة نهائية من واحد إلى واحد على الأقل وسائل الإعلام إلى التربسين لإلغاء تنشيط الإنزيم.Pipet وسائل الإعلام صعودا وهبوطا عدة مرات مع pipet 10 ملليلتر لمزيد من تفريق لب الأسنان في وسائل الإعلام، وتجنب فقاعات كبيرة. نقل ملليلتر واحد من لب الأسنان مشتتة إلى كل بئر من 24 بئرا لوحة الأنسجة. ضع الطبق في حاضنة عند درجة 37 مئوية.وتسمح للخلايا بإرفاق وهجرة من الأنسجة غير المُجرّفة لمدة 48 ساعة قبل تغيير الوسائط. بعد القتل الرحيم وإزالة الجلد، إدراج غيض من زوج من مقص تشريح الدقيقة في قاعدة الجمجمة. قطع على طول خياطة القوس من الجمجمة.جعل أربعة تخفيضات أفقية صغيرة على طول الغرز التاجية من الأذنين حتى على طول الغرز لامدويد من قاعدة الجمجمة. هذا يخلق اثنين من اللوحات من العظام. استخدام ملقط لقشر مرة أخرى اثنين من اللوحات من العظام للكشف عن الدماغ.تحديد موقع ganglia ثلاثية التوائم التي تقع في ماتر دورا بين الدماغ والعظام من عملية الفك العلوي. قطع الفروع الثلاثة التي تسافر إلى العينين، وماكسيلا، وفك الفك. واستخدام ملقط حافة مستقيمة لنقل ganglia إلى PBS 1X الباردة في طبق على الجليد.مرة واحدة يتم حصادها جميع حزم ثلاثية التوائم استخدام ملقط ملف لنقل ganglia إلى 50 ملليلتر أنبوب مخروطي يحتوي على خمسة ملليغرام لكل ملليلتر من نوع الكولاجين المصفى العقيمة II.Vortex الخليط ووضع الأنبوب في حمام الماء 37 درجة مئوية لمدة 25 إلى 30 دقيقة. كل خمس إلى عشر دقائق، أخرج الأنبوب من الحمام المائي، دوامة، والعودة إلى الحمام. الطرد المركزي الحل الخلايا العصبية ثلاثية التوائم الكولاجين لمدة دقيقتين في 643xg.تحت غطاء محرك السيارة ثقافة الأنسجة، وpire بلطف collagenase مع micropipet وإضافة خمسة ملليلتر من 1٪ معقم تنقية نوع II.Then وضع الأنبوب في حمام الماء 37 درجة مئوية لمدة 25 إلى 30 دقيقة وخلال هذا الإطار الزمني دوامة الأنبوب لفترة وجيزة كل خمس دقائق. إضافة وسائط بنسبة واحد إلى واحد من التربسين إلى الوسائط لإلغاء تنشيط التبسين المتبقي. عد عدد الخلايا وتمييع الخليط إلى 200، 000 خلية لكل ملليلتر في وسائل الإعلام.ضع مرشحات ترانسويل مغلفة في الآبار مع لب الأسنان. Pipet 250 ميكرولتر على مرشح transwell والثقافة الخلايا في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، استبدل وسائل الإعلام بميليلتر واحد من وسائل الإعلام المشاركة في الثقافة المكملة مع أوريدين ميكرومولار واحد و 15 ميكرومولار 5-Fluoro-2'deoxyuridine لوقف الانتشار المفرط للخلايا المتوسطة التي قد تمنع نوريتوث.يجب إضافة مثبطات الميتوتيك في اليوم الثاني أو لن يحدث نمو نيوريت. في هذه الدراسة، تم زيادة نمو ثلاثي التوائم النوري في وجود خلايا لب الأسنان الأولية في البئر الأساسي مقارنة بالسيطرة على تربية أحادية ثلاثية التوائم. وكانت الخلايا الأولية المعزولة من مستقبلات TGF-beta 2 flox/ flox الماوس ما يعادل في عدد بعد حقن إما ade-Cre-GFP أو ade-eGFP.PCR شبه كمية يوضح أن adenovirus-Cre-GFP حذف الجينات يحيط تحويل مستقبلات بيتا عامل النمو 2 مع adenovirus-eGFP بمثابة ناقل الفيروسية مكافحة. في الثقافات مع تحويل عامل النمو مستقبلات بيتا 2 الحذف، انخفض نوريت outgrowth. التصوير في المجال الساطع من مرشحات ترانسويل بعد تلطيخ البنفسجية البلورية من مجموعات الخلايا يظهر أن المسام الكبيرة هي السائدة.يشير السهم الكبير إلى خلية مع مورفولوجيا mesenchymal في حين يشير السهم الصغير إلى خلية من مورفولوجيا الخلايا العصبية. اللون البنفسجي الكريستال كلا الخلايا دون تحيز. بالإضافة إلى ذلك ، يظهر تلطيخ الفلوروس المناعي من توبيولين بيتا-3 مع جسم مضاد ثانوي alexa 488 تلطيخ غير محدد للخلايا المتعددة مما يجعل تصوير الهياكل afferent صعبًا.لأن لا خلايا لب الأسنان ولا الخلايا العصبية ثلاثية التوائم تفريق بسهولة، كل باحث سوف تحتاج إلى تحسين إجراءاتها الطلاء. إذا كنت زراعة خلايا لب الأسنان وحدها في آبار منفصلة يمكنك استخدام immunofluorescence أو يمكنك تحديد الحمض النووي الريبي أو مستويات البروتين لتحديد كيفية استجابة خلايا لب الأسنان إلى الخلايا العصبية. تذكر أن تبيض أي حاويات أو نصائح التي تأتي في اتصال مع الفيروس الغدي.تأكد من التخلص من شفرات الحلاقة بشكل صحيح في سلة حادة.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

مقاربة Optogenetic لتقييم تشكيل الوصلات العصبية في نظام المشارك الثقافة

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

توليد كريسبر / Cas9 ساطة Monoallelic الحذف لدراسة وظيفة محسن في الخلايا الجذعية الجنينية الماوس

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

Using Touch-evoked Response and Locomotion Assays to Assess Muscle Performance and Function in Zebrafish

عن طريق الاستجابة أثار اللمس والحركة فحوصات لتقييم أداء العضلات وظيفة في الزرد

Zebrafish muscle development is highly conserved with mammalian systems making them an excellent model to study muscle function and disease. Many ...

Application of Impermeable Barriers Combined with Candidate Factor Soaked Beads to Study Inductive Signals in the Chick

تطبيق الحواجز غير نفاذ جنبا إلى جنب مع المرشح عامل الخرز غارقة لدراسة إشارات الاستقرائي في الفرخ

The chick embryo provides a superb vertebrate model that can be used to dissect developmental questions in a direct way. Its accessibility and robustness ...

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

والرزن ثقافة المشارك خاتم الابهري: أداة ملائمة تقييم إمكانات الأوعية الوسيطة Stromal الخلايا في المختبر

Angiogenesis is a complex, highly regulated process responsible for providing and maintaining adequate tissue perfusion. Insufficient vasculature ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

أسلوب الثقافة أورجانوتيبيك لدراسة تطوير الأنسجة الجنينية الدجاج

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

أسلوب في فيفو لدراسة سلامة حاجز الدم-الخصية الماوس

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...

Isolation, Propagation, and Prion Protein Expression During Neuronal Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells

عزل وإكثار بريون البروتين التعبير خلال تمايز الخلايا العصبية من الخلايا الجذعية البشرية لب الأسنان

Bioethical issues related to the manipulation of embryonic stem cells have hindered advances in the field of medical research. For this reason, it is very ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

تقييم الضرر التأكسدي في الخلايا السطحية الرئيسية للفأرة /الخلايا الجذعية استجابة للأضرار فوق البنفسجية-C (UV-C)

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

An Enhanced Green Fluorescence Protein-based Assay for Studying Neurite Outgrowth in Primary Neurons

فحص قائم علي بروتين الفلورية الخضراء المعززة لدراسة نمو العصب في الخلايا العصبية الاوليه

Neurite outgrowth is a fundamental event in the formation of the neural circuits during nervous system development. Severe neurite damage and synaptic ...