Name: a co-culture method to study neurite outgrowth in response to dental pulp paracrine signals
Uploaded: 2020-02-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Co-Culture Method to Study Neurite Outgrowth in Response to Dental Pulp Paracrine Signals at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af a) National Institutes of Health / NIAMS (tilskud numre R01 AR062507 og R01 AR053860 til RS), b) University of Alabama på Birmingham Dental Academic Research Training (DART) tilskud (nummer T90DE022736 (PI MacDougall)) til SBP fra National Institute of Dental og Craniofacial Research / National Institutes of Health, c) et UAB Global Center for Kraniofacial, Oral og Dental Disorders (GC-KODET) Pilot- og feasibilitytilskud til SBP og d) National Institute of Dental and Craniofacial Forsknings-/nationale sundhedsinstitutk99 DE024406-tilskud til SBP.

Alle forsøg med mus blev godkendt af UAB Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Pladeforberedelse
BEMÆRK: Coverslips kan bruges til at afbilde DP-celler i slutningen af analysen. Sørg for, at pladelåget er tændt under alle inkubationer og skylningstrin uden for den sterile vævskulturhætte for at forhindre kontaminering under prøvebehandling.
<ol><li>
Forberedelse af dæksel
	<ol>
<li>Autoklave cirkulære dæksedler.</li>
	...

<ol>
	<li>Moe, K., Sijaona, A., Shrestha, A., Kettunen, P., Taniguchi, M., Luukko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semaphorin+3A+controls+timing+and+patterning+of+the+dental+pulp+innervation.">Semaphorin 3A controls timing and patterning of the dental pulp innervation.</a> Differentiation. 84 (5), 371-379 (2012).</li><li>Kollar, E. J., Lumsden, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tooth+morphogenesis:+the+role+of+the+innervation+during+induction+and+pattern+formation.">Tooth morphogenesis: the role of the innervation during induction and pattern formation.</a> Journal de biologie buccale. 7 (1), 49-60 (1979).</li><li>Lillesaar, C., Fried, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurites+from+trigeminal+ganglion+explants+grown+in+vitro+are+repelled+or+attracted+by+tooth-related+tissues+depending+on+developmental+stage.">Neurites from trigeminal ganglion explants grown in vitro are repelled or attracted by tooth-related tissues depending on developmental stage.</a> Neuroscience. 125 (1), 149-161 (2004).</li><li>Fried, K., Lillesaar, C., Sime, W., Kaukua, N., Patarroyo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+finding+of+pain+nerve+fibers:+Neural+growth+mechanisms+in+the+tooth+pulp.">Target finding of pain nerve fibers: Neural growth mechanisms in the tooth pulp.</a> Physiology &amp; Behavior. 92 (1-2), 40-45 (2007).</li><li>Pagella, P., Jim&#233;nez-Rojo, L., Mitsiadis, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+innervation+in+developing+and+regenerating+orofacial+tissues.">Roles of innervation in developing and regenerating orofacial tissues.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (12), 2241-2251 (2014).</li><li>Luukko, K., Kettunen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+tooth+morphogenesis+and+innervation+by+local+tissue+interactions,+signaling+networks,+and+semaphorin+3A.">Integration of tooth morphogenesis and innervation by local tissue interactions, signaling networks, and semaphorin 3A.</a> Cell Adhesion &amp; Migration. , 1-9 (2016).</li><li>Smit, M., Leng, J., Klemke, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+for+neurite+outgrowth+quantification.">Assay for neurite outgrowth quantification.</a> BioTechniques. 35 (2), 254-256 (2003).</li><li>de Almeida, J. F. A., Chen, P., Henry, M. A., Diogenes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+of+the+apical+papilla+regulate+trigeminal+neurite+outgrowth+and+targeting+through+a+BDNF-dependent+mechanism.">Stem cells of the apical papilla regulate trigeminal neurite outgrowth and targeting through a BDNF-dependent mechanism.</a> Tissue engineering. Part A. 20 (23-24), 3089-3100 (2014).</li><li>Pagella, P., Miran, S., Mitsiadis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Developing+Tooth+Germ+Innervation+Using+Microfluidic+Co-culture+Devices.">Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices.</a> Journal of Visualized Experiments. (102), e53114 (2015).</li><li>Coelen, R. J., Jose, D. G., May, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+hexadimethrine+bromide+(polybrene)+on+the+infection+of+the+primate+retroviruses+SSV+1/SSAV+1+and+BaEV.">The effect of hexadimethrine bromide (polybrene) on the infection of the primate retroviruses SSV 1/SSAV 1 and BaEV.</a> Archives of Virology. 75 (4), 307-311 (1983).</li><li>Caroni, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+growth-associated+proteins+in+the+neurons+of+adult+transgenic+mice.">Overexpression of growth-associated proteins in the neurons of adult transgenic mice.</a> Journal of neuroscience methods. 71 (1), 3-9 (1997).</li><li>Ali&#263;, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+from+mouse+strain+Thy1+YFP-16+are+a+valuable+tool+to+monitor+and+evaluate+neuronal+differentiation+and+morphology.">Neural stem cells from mouse strain Thy1 YFP-16 are a valuable tool to monitor and evaluate neuronal differentiation and morphology.</a> Neuroscience Letters. 634, 32-41 (2016).</li><li>Howroyd, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+the+Trigeminal+Ganglion+of+Nonrodent+Species+Used+in+Toxicology+Studies.">Dissection of the Trigeminal Ganglion of Nonrodent Species Used in Toxicology Studies.</a> Toxicologic Pathology. , (2019).</li><li>Schwieger, J., Esser, K. H., Lenarz, T., Scheper, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+long-term+spiral+ganglion+neuron+culture+with+reduced+glial+cell+number:+Effects+of+AraC+on+cell+composition+and+neurons.">Establishment of a long-term spiral ganglion neuron culture with reduced glial cell number: Effects of AraC on cell composition and neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 268, 106-116 (2016).</li><li>Liu, R., Lin, G., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Efficient+Method+for+Dorsal+Root+Ganglia+Neurons+Purification+with+a+One-Time+Anti-Mitotic+Reagent+Treatment.">An Efficient Method for Dorsal Root Ganglia Neurons Purification with a One-Time Anti-Mitotic Reagent Treatment.</a> PLoS ONE. 8 (4), 60558 (2013).</li><li>Burry, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimitotic+drugs+that+enhance+neuronal+survival+in+olfactory+bulb+cell+cultures.">Antimitotic drugs that enhance neuronal survival in olfactory bulb cell cultures.</a> Brain Research. 261 (2), 261-275 (1983).</li><li>Katzenell, S., Cabrera, J. R., North, B. J., Leib, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+Purification,+and+Culture+of+Primary+Murine+Sensory+Neurons.">Isolation, Purification, and Culture of Primary Murine Sensory Neurons.</a> Methods in molecular biology. 1656, 229-251 (2017).</li><li>Dussor, G. O., Price, T. J., Flores, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+transcription+factor+3+mRNA+is+upregulated+in+primary+cultures+of+trigeminal+ganglion+neurons.">Activating transcription factor 3 mRNA is upregulated in primary cultures of trigeminal ganglion neurons.</a> Molecular Brain Research. 118 (1-2), 156-159 (2003).</li><li>Lillesaar, C., Arenas, E., Hildebrand, C., Fried, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+rat+trigeminal+neurones+to+dental+pulp+cells+or+fibroblasts+overexpressing+neurotrophic+factors+in+vitro.">Responses of rat trigeminal neurones to dental pulp cells or fibroblasts overexpressing neurotrophic factors in vitro.</a> Neuroscience. 119 (2), 443-451 (2003).</li><li>Lillesaar, C., Eriksson, C., Fried, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+tooth+pulp+cells+elicit+neurite+growth+from+trigeminal+neurones+and+express+mRNAs+for+neurotrophic+factors+in+vitro.">Rat tooth pulp cells elicit neurite growth from trigeminal neurones and express mRNAs for neurotrophic factors in vitro.</a> Neuroscience Letters. 308 (3), (2001).</li><li>Lillesaar, C., Eriksson, C., Johansson, C. S., Fried, K., Hildebrand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tooth+pulp+tissue+promotes+neurite+outgrowth+from+rat+trigeminal+ganglia+in+vitro.">Tooth pulp tissue promotes neurite outgrowth from rat trigeminal ganglia in vitro.</a> Journal of neurocytology. 28 (8), 663-670 (1999).</li><li>Chmilewsky, F., Ayaz, W., Appiah, J., About, I., Chung, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+Growth+Factor+Secretion+From+Pulp+Fibroblasts+is+Modulated+by+Complement+C5a+Receptor+and+Implied+in+Neurite+Outgrowth.">Nerve Growth Factor Secretion From Pulp Fibroblasts is Modulated by Complement C5a Receptor and Implied in Neurite Outgrowth.</a> Scientific reports. 6, 31799 (2016).</li><li>Pagella, P., Neto, E., Jim&#195;&#169;nez-Rojo, L., Lamghari, M., Mitsiadis, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+co-culture+systems+for+studying+tooth+innervation.">Microfluidics co-culture systems for studying tooth innervation.</a> Frontiers in Physiology. 5, 326 (2014).</li><li>Miura, T., Yokokawa, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+culture+on+a+chip:+Developmental+biology+applications+of+self-organized+capillary+networks+in+microfluidic+devices.">Tissue culture on a chip: Developmental biology applications of self-organized capillary networks in microfluidic devices.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 58 (6), 505-515 (2016).</li></ol>

De daglige aktiviteter i mundhulen kræver, at tænderne fornemmer eksterne stimuli og intern inflammation for at tillade korrekt brug og vedligeholdelse. Der foreligger dog kun begrænsede oplysninger om de signaler, der driver de udviklingsmæssige processer i tandinfisk. Denne protokol giver en metode til at isolere og co-kultur primære DP celler og TG neuroner med henblik på at studere krydskommunikation mellem de to populationer. Flere variabler blev optimeret og efterlade åbne yderligere muligheder for forskning...

Tand inderblod giver tænderne til at fornemme tryk, temperatur og betændelse, som alle er afgørende for brugen og vedligeholdelsen af tandorgel. Manglende følelse tandsmerter forbundet med karies og traumer fører til sygdomsprogression. Således korrekt innervation er et krav for normal tandvækst, funktion og pleje.
Mens de fleste organer er fuldt funktionelle og innervated ved fødslen, tand udvikling strækker sig ind i voksenlivet, med tand innervation og mineralisering forekommer i koncert i postnatal fase1,2. Interessant, dental pulp (DP) mesenchyme i første omgang udskiller frastødende signaler under embryogenese for at forhindre axon indrejse i udviklingslandene tandorgel, som senere skifter til udskillelsen af attractant faktorer som tanden nærmer udbrud3,4. Under postnatale stadier trænger afferent axoner fra trigeminusnerven ind i og hele tanden omkring det tidspunkt, hvor dentinaflejring begynder (gennemgået i Pagella, P. et al.5). Flere in vivo undersøgelser har vist, at neuronal-mesenchymal interaktioner guide tand innervation i mus (gennemgået i Luukko, K. et al.6), men få detaljer om de molekylære mekanismer er tilgængelige.
Celle co-kulturer giver kontrollerede miljøer, hvor efterforskere kan manipulere interaktioner mellem neuronal og mesenchymal populationer. Co-kultur eksperimenter gør det muligt at dykke dybere ned i signalering veje vejlede tand innervation og udvikling. Flere af de konventionelle metoder, der anvendes til at studere celler i samkultur, udgør dog tekniske udfordringer. For eksempel kan krystal violet farvning af nitrit udvækst ikke-specifikt pletteSchwann celler indgår i TG bundt dispersions, og der kan være toppe i farveintensitet med relativt små svar7. Mikrofluidic kamre tilbyder en attraktiv mulighed, men er betydeligt dyrere end transwell filtre8,9 og kun tillade undersøgelse af neuronal svar på DP sekreter. For at løse disse problemer har vi udviklet en protokol, der giver mulighed for: a) præcis farvning og billeddannelse af TG nitrit udvækst som reaktion på DP sekreter, b) genetisk modifikation af DP-celler og / eller TG neuroner til at undersøge specifikke signalering veje, og c) undersøgelse af DP celle reaktioner på faktorer udskilles af TG neuroner. Denne protokol giver mulighed for præcist at undersøge flere funktioner i tand innervation i det kontrollerede miljø af en in vitro co-kultur assay.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-Fluoro-2&#39;-deoxyuridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0503</td>
			<td>Used as a mitotic Inhibitor at 15 &#956;M concentration in co-culture media, Day 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td>Co-culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-546 anti-chicken</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11040</td>
			<td>Secondary to stain neurite outgrowth labeled by anti-GFP antibody, 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP Antibody</td>
			<td>Aves Lab, Inc</td>
			<td>GFP-1010</td>
			<td>Primary antibody to label Thy1-YFP neurons, 1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Neurofilament 200 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NO142</td>
			<td>Monoclonal primary antibody to label neurons, 1:1000 dilution, alternative if YFP mice are not available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6;129- Tgfbr2tm1Karl/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>12603</td>
			<td>Tgfbr2f/f mouse model used for dental pulp cells in optimized protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>3709</td>
			<td>Thy1-YFP mouse model genotype used for trigeminal neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type II</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>234155-100MG</td>
			<td>Used to disperse trigeminal neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437</td>
			<td>Additive to co-culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11413-11</td>
			<td>Fine forceps for TG dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td>Coats the transwell inserts at final concentration of 10 &#956;g/ml, stock solution is assumed at 1.5 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis Buffer (Buffer RLT)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td>Extracts RNA from dental pulp cells post co-culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030081</td>
			<td>Additive to co-culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-dissecting scissors</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3146-1EA</td>
			<td>Dissection scissors to open skull</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-545-81</td>
			<td>Circlular coverslip for optional cell culturing and immunofluorescence processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimal Essential Medium a</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12571063</td>
			<td>Co-culture media base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td>Antibiotic additive to co-culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase Inhibitor</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>04 906 837 001</td>
			<td>Additive to RIPA Buffer for extracting protein from dental pulp cells post co-culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td>Used to aid in dental pulp cell transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7280</td>
			<td>Coverslip coating to aid dental pulp cellular adhesion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitors</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05 892 791 001</td>
			<td>Additive to RIPA Buffer for extracting protein from dental pulp cells post co-culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse/DNAse free eppendorf tubes</td>
			<td>Denville</td>
			<td>C-2172</td>
			<td>Presterilized 1.7 ml tubes for RNA, DNA or protein collection at the end of assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThinCert Cell Culture Insert</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>662631</td>
			<td>Transwell inserts for trigeminal neurons in co-culture assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td>Used fto disperse dental pulp cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Type II</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T-7409</td>
			<td>Used to disperse trigeminal neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11370-40</td>
			<td>Ultra fine forceps for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U3750</td>
			<td>Used as a mitotic Inhibitor at 1 &#956;M concentration in co-culture media, Day 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Filtration System</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCNY00060</td>
			<td>Steriflip disposable filter, 50 &#956;m nylon net filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>110006-15</td>
			<td>Long forceps for tissue transfer to conicals</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a co-culture method to study neurite outgrowth in response to dental pulp paracrine signals

Tand inderblod giver tænderne til at fornemme tryk, temperatur og betændelse, som alle er afgørende for brugen og vedligeholdelsen af tandorgel. Uden sensorisk innervation, daglige orale aktiviteter ville forårsage uoprettelig skade. På trods af sin betydning, rollerne innervation i tand udvikling og vedligeholdelse er stort set overset. Flere undersøgelser har vist, at DP celler udskiller ekstracellulære matrix proteiner og paracrine signaler til at tiltrække og guide TG axoner i og i hele tanden. Men, få undersøgelser har givet detaljeret indsigt i krydstale mellem DP mesenchyme og neuronal afferents. For at afhjælpe denne kløft i viden, forskere er begyndt at udnytte co-kulturer og en række teknikker til at undersøge disse interaktioner. Her viser vi de mange trin, der er involveret i co-turing primære DP-celler med TG neuroner spredt på en overliggende transwell filter med stor diameter porer til at tillade axonal vækst gennem porerne. Primære DP-celler med genet af interesse flankeret af loxP steder blev udnyttet til at lette gensletning ved hjælp af en Adenovirus-Cre-GFP rekombinase system. Brug af TG-neuroner fra Thy1-YFP-musen tillod præcis afferent billeddannelse med udtryk et godt stykke over baggrundsniveauerne ved konfokalmikroskopi. DP-responserne kan undersøges via protein- eller RNA-indsamling og -analyse eller alternativt gennem immunfluorescerende farvning af DP-celler belagt med aftagelige glasdækslips. Medier kan analyseres ved hjælp af teknikker såsom proteomiske analyser, selv om dette vil kræve albumin udtynding på grund af tilstedeværelsen af føtal kvæg serum i medierne. Denne protokol giver en simpel metode, der kan manipuleres til at studere morfologiske, genetiske og cytoskeletal reaktioner af TG neuroner og DP celler som reaktion på det kontrollerede miljø af en co-kultur analyse.

Disse resultater viser, at TG neutrit udvækst blev øget i tilstedeværelsen af primære DP celler i den underliggende brønd i forhold til kontrol af TG nitrit monokultur (Figur 2A,C). Der er nogle analyse-til-assay variation i nitrit udvækst. Således bør en TG neuron monokultur indgå i alle analyser som en kontrol til at opdage de basale niveauer af nitrit udvækst. Primære celler fra Tgfbr2f/f-musen blev anvendt i denne protokol, efter at infektionen i Ad...

Watch this Scientific Journal Video about A Co-Culture Method to Study Neurite Outgrowth in Response to Dental Pulp Paracrine Signals at JoVE.com

A Co-Culture Method to Study Neurite Outgrowth in Response to Dental Pulp Paracrine Signals

Vi beskriver isolation, spredning og plating af dental pulp (DP) primære celler med trigeminus (TG) neuroner dyrket oven overliggende transwell filtre. Cellulære reaktioner af DP-celler kan analyseres med immunfluorescens eller RNA/proteinanalyse. Immunfluorescens af neuronale markører med konfokal mikroskopi tillader analyse af nitrit udvækst reaktioner.

En co-kultur metode til at studere Neurite Udvækst som reaktion på Dental Pulp Paracrine Signaler

Tooth innervation allows teeth to sense pressure, temperature and inflammation, all of which are crucial to the use and maintenance of the tooth organ. ...

Denne protokol giver detaljerede retningslinjer for, hvordan man co-kultur dental papirmasse stamceller med trigeminus neuroner. Med det, kan vi undersøge flere svar drevet af deres krydstale. Den største fordel ved denne teknik er evnen til at studere og manipulere den ene eller begge cellepopulationer og præcist måle resultaterne.Denne metode har direkte relevans for neural forskning og kunne give indsigt i forskning i, hvordan dental papirmasse stamceller reparere neurale væv beskadiget af traumatiske begivenheder eller neurodegenerative sygdomme. Der er flere faser af denne teknik til at lære, og det kan være svært at holde tarmkanalen af dem alle. Denne protokol beskriver hver fase for at hjælpe med det.Den dental papirmasse og ganglier er vanskelige at sprede og kræver forskellige vortexing og pipettering. Selv da vil du ikke få fuld spredning, så optimering og replikerer vil være påkrævet. Efter aflivning af musen, placere hovedet på engangstændere underplade, således at munden er mod loftet og bunden af halsen er flad på arbejdsfladen.Brug et barberblad og en savning bevægelse til at adskille underkæben fra maxilla. Fjern tungen med en saks eller en saks for at give lettere adgang til kindtænderne. Placer det åbne hoved i skålen oven på en steril gazepude, og anse prøven under det dissekerende mikroskop.Fjern alveolær knoglevæv omkring de første kindtænder. Indsæt sceceitter i alveolær åbning og drille vævet væk fra tanden mod buccle eller lingual side af munden. Saml alle maxillary første kindtænder og forsigtigt overføre submandibulære og maxillary første kindtænder til en separat celle kultur fad med 1X PBS på is.Fjern emalje ydre organ omkring ydersiden af hver maxillary første kindtand. Med et sæt af snævle rotere kindtandet, så cusps er nede og den åbne rod er udsat. Der er en oval åbning på bunden af tanden og uigennemsigtigt tandkødsvæv indkapslet af et tyndt lag dentin og emalje.Ved hjælp af spidsen af snævle, forsigtigt løsne dental papirmasse ved at køre den ene arm af snævnheden omkring den indre omkreds af mineraliseret væv. Fjern tandkødsvævet ud af den mineraliserede struktur og overfør det til en tredje skål, der indeholder 1X PBS. Fjern emalje ydre organ, hvis det ikke allerede var adskilt.Overfør alt tandkødsvæv til 0,25 % trypsin EDTA i et 50 milliliter konisk rør. Vortex blandingen og placere den i en 37 graders Celsius varmt vandbad i 10 minutter. Under en steril hætte, tilføje varmet co-kultur medier til et endeligt forhold på mindst en-til-en medier til trypsin at inaktivere enzymet.Pipet medierne op og ned flere gange med en 10 milliliter pipet til yderligere at sprede dental papirmasse i medierne, undgå store bobler. Overfør en milliliter af den spredte tandmasse til hver brønd af 24-godt væv kultur plade. Anbring pladen i en kuvøse ved 37 grader Celsius.Og lad cellerne til at vedhæfte og migrere ud fra det uperserede væv i 48 timer, før du skifter medie. Efter aflivning og fjernelse af huden, indsætte spidsen af et par mikro dissekere saks i bunden af kraniet. Skær langs kraniumets sagittale sutur.Lav fire små vandrette nedskæringer til langs koronale suturer af ørerne, indtil langs lambdoid suturer af bunden af kraniet. Dette skaber to flapper af knogle. Brug de vicesser til at skrælle tilbage de to flapper af knogle til at afsløre hjernen.Find trigeminus ganglier til huse i dura mater mellem hjernen og knoglen af maxillary proces. Skær de tre grene, der rejser til øjnene, maxillae, og underkæbe. Og brug lige kant fine kraftbefædre til at overføre ganglier til kolde 1X PBS i en skål på is.Når alle trigeminusbundter er høstet bruge fil kraftbuske til at overføre ganglier til 50 milliliter koniske rør, der indeholder fem milligram pr milliliter sterilt filtreret kollagen type II.Vortex blandingen og placere røret i 37 grader Celsius vandbad i 25 til 30 minutter. Hver fem til ti minutter, tage røret ud af vandbad, vortex, og vende tilbage til badet. Centrifuge kollagent trigeminus neuron opløsning i to minutter ved 643xg.Under en vævskultur hætte, forsigtigt aspirere kollagenase med en mikropipet og tilsæt fem milliliter 1% sterilfiltreret trypsin type II.Derefter placere røret i en 37 grader Celsius vandbad i 25 til 30 minutter og inden for denne tidsramme vortex røret kort hvert femte minut. Tilføj medier med et en-til-en-forhold på trypsin til medier for at deaktivere de resterende trypsin. Tæl antallet af celler og fortynde blandingen til 200.000 celler pr. milliliter i medier.Placer belagte transwell filtre i brønde med dental pulp. Pipet 250 mikroliter på transwell filter og kultur cellerne på 37 grader Celsius natten over. Den næste dag, erstatte medierne med en milliliter af co-kultur medier suppleret med en mikromolar uridine og 15 mikromolar 5-Fluoro-2'deoxyuridin at stoppe over spredning af mesenkymale celler, der kan forhindre neurite udvækst.Du skal tilføje mitotiske hæmmere på dag to eller neurite vækst vil ikke forekomme. I denne undersøgelse, trigeminus neurite udvækst blev øget i nærvær af primære dental papirmasse celler i den underliggende brønd sammenlignet med kontrol af trigeminus neurite monokultur. Primærceller, der var isoleret fra TGF-beta-receptoren 2 flox/floxmus, var ækvivalente i antal efter injektioner af enten ade-Cre-GFP eller ade-eGFP.Semi-kvantitative PCR viser, at adenovirus-Cre-GFP slettet den flankerede gen omdanne vækstfaktor beta receptor 2 med adenovirus-eGFP tjener som en kontrol viral vektor. I kulturer med transformerende vækstfaktor beta receptor 2 sletning, neurite udvækst blev reduceret. Bright-field billeddannelse af transwell filtre efter krystal violet farvning af cellepopulationer viser, at store porer er fremherskende.Den store pil peger på en celle med mesenkymal morfologi, mens den lille pil peger på en celle af neuronal morfologi. Krystal violet farves begge celler uden bias. Desuden immunfluorescens farvning af beta-III tubulin med en alexa 488 sekundært antistof viser ikke-specifikke farvning af flere celler gør billeddannelse af afferente strukturer vanskelig.Fordi hverken dental papirmasse celler eller trigeminus neuroner sprede let, hver forsker bliver nødt til at optimere deres plating procedurer. Hvis du kultur dental papirmasse celler alene i separate brønde kan du bruge immunfluorescens eller du kan kvantificere RNA eller protein niveauer for at bestemme, hvordan dental papirmasse celler reagerer på neuroner. Husk at blege eventuelle beholdere eller tips, der kommer i kontakt med adenovirus.Sørg for at kassere barbermaskiner ordentligt i en skarp bin.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

En optogenetic fremgangsmåde for vurdering af Dannelse af neuronal forbindelser i en co-kultur System

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

Generering CRISPR / Cas9 Mediated monoallelisk Sletninger til Studieinformationen Enhancer funktion i mus embryonale stamceller

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

Using Touch-evoked Response and Locomotion Assays to Assess Muscle Performance and Function in Zebrafish

Brug Touch-fremkaldt reaktion og Locomotion Analyser til Vurdere Muskel Ydeevne og funktion i zebrafisk

Zebrafish muscle development is highly conserved with mammalian systems making them an excellent model to study muscle function and disease. Many ...

Application of Impermeable Barriers Combined with Candidate Factor Soaked Beads to Study Inductive Signals in the Chick

Anvendelse af impermeable barrierer Kombineret med Candidate Factor Soaked Perler til at studere Induktive Signaler i Chick

The chick embryo provides a superb vertebrate model that can be used to dissect developmental questions in a direct way. Its accessibility and robustness ...

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

Aorta Ring Co kultur Assay: Et praktisk værktøj til at vurdere angiogene af mesenchymale stromale celler In Vitro

Angiogenesis is a complex, highly regulated process responsible for providing and maintaining adequate tissue perfusion. Insufficient vasculature ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

Organotypic kultur metode til at studere udviklingen af embryonale kylling væv

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

En In Vivo -metode til at studere mus blod-Testis barriere integritet

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...

Isolation, Propagation, and Prion Protein Expression During Neuronal Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells

Isolation, formering og Prion Protein ekspression løbet Neuronal differentiering af menneskelige Dental Pulp stamceller

Bioethical issues related to the manipulation of embryonic stem cells have hindered advances in the field of medical research. For this reason, it is very ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

Vurdering af oxidative skader i den primære mus okulære overfladeceller / stamceller som reaktion på Ultraviolet-C (UV-C) Skader

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

An Enhanced Green Fluorescence Protein-based Assay for Studying Neurite Outgrowth in Primary Neurons

En forbedret grøn fluorescens protein-baseret assay til at studere Neurite udvækst i primære neuroner

Neurite outgrowth is a fundamental event in the formation of the neural circuits during nervous system development. Severe neurite damage and synaptic ...