Name: a co-culture method to study neurite outgrowth in response to dental pulp paracrine signals
Uploaded: 2020-02-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Co-Culture Method to Study Neurite Outgrowth in Response to Dental Pulp Paracrine Signals at JoVE.com

עבודה זו היתה נתמכת על ידי) המוסדות הלאומיים לבריאות/NIAMS (להעניק מספרים R01 AR062507 ו R01 AR053860 ל RS), ב) אוניברסיטת אלבמה הדרכה המחקר האקדמי של ברמינגהאם (DART) מענק (מספר T90DE022736 (PI MacDougall) כדי SBP מן המכון הלאומי לרפואת שיניים, מכוני בריאות הלאומי, ג) מרכז עולמי UAB עבור הגולגולת, אוראלי הפרעות שיניים (GC-מקודד) פיילוט והיתכנות מענק SBP ו-d) המכון הלאומי לרפואת שיניים וקרניו Ofacial מחקר/מכוני לאומי של בריאות K99 DE024406 מענק SBP.

כל הניסויים עם עכברים אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים UAB והשתמש הוועדה (IACUC).
1. הכנת צלחות
הערה: ניתן להשתמש בכיסויים לתאי DP של תמונה בסוף הטיפול. להיות בטוח מכסה הצלחת הוא על במהלך כל הדגירה ושטיפה צעדים מחוץ המכסה התרבות סטרילי רקמה כדי למנוע זיהום במהלך ע?...

<ol>
	<li>Moe, K., Sijaona, A., Shrestha, A., Kettunen, P., Taniguchi, M., Luukko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semaphorin+3A+controls+timing+and+patterning+of+the+dental+pulp+innervation.">Semaphorin 3A controls timing and patterning of the dental pulp innervation.</a> Differentiation. 84 (5), 371-379 (2012).</li><li>Kollar, E. J., Lumsden, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tooth+morphogenesis:+the+role+of+the+innervation+during+induction+and+pattern+formation.">Tooth morphogenesis: the role of the innervation during induction and pattern formation.</a> Journal de biologie buccale. 7 (1), 49-60 (1979).</li><li>Lillesaar, C., Fried, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurites+from+trigeminal+ganglion+explants+grown+in+vitro+are+repelled+or+attracted+by+tooth-related+tissues+depending+on+developmental+stage.">Neurites from trigeminal ganglion explants grown in vitro are repelled or attracted by tooth-related tissues depending on developmental stage.</a> Neuroscience. 125 (1), 149-161 (2004).</li><li>Fried, K., Lillesaar, C., Sime, W., Kaukua, N., Patarroyo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+finding+of+pain+nerve+fibers:+Neural+growth+mechanisms+in+the+tooth+pulp.">Target finding of pain nerve fibers: Neural growth mechanisms in the tooth pulp.</a> Physiology &amp; Behavior. 92 (1-2), 40-45 (2007).</li><li>Pagella, P., Jim&#233;nez-Rojo, L., Mitsiadis, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+innervation+in+developing+and+regenerating+orofacial+tissues.">Roles of innervation in developing and regenerating orofacial tissues.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (12), 2241-2251 (2014).</li><li>Luukko, K., Kettunen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+tooth+morphogenesis+and+innervation+by+local+tissue+interactions,+signaling+networks,+and+semaphorin+3A.">Integration of tooth morphogenesis and innervation by local tissue interactions, signaling networks, and semaphorin 3A.</a> Cell Adhesion &amp; Migration. , 1-9 (2016).</li><li>Smit, M., Leng, J., Klemke, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+for+neurite+outgrowth+quantification.">Assay for neurite outgrowth quantification.</a> BioTechniques. 35 (2), 254-256 (2003).</li><li>de Almeida, J. F. A., Chen, P., Henry, M. A., Diogenes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+of+the+apical+papilla+regulate+trigeminal+neurite+outgrowth+and+targeting+through+a+BDNF-dependent+mechanism.">Stem cells of the apical papilla regulate trigeminal neurite outgrowth and targeting through a BDNF-dependent mechanism.</a> Tissue engineering. Part A. 20 (23-24), 3089-3100 (2014).</li><li>Pagella, P., Miran, S., Mitsiadis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Developing+Tooth+Germ+Innervation+Using+Microfluidic+Co-culture+Devices.">Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices.</a> Journal of Visualized Experiments. (102), e53114 (2015).</li><li>Coelen, R. J., Jose, D. G., May, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+hexadimethrine+bromide+(polybrene)+on+the+infection+of+the+primate+retroviruses+SSV+1/SSAV+1+and+BaEV.">The effect of hexadimethrine bromide (polybrene) on the infection of the primate retroviruses SSV 1/SSAV 1 and BaEV.</a> Archives of Virology. 75 (4), 307-311 (1983).</li><li>Caroni, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+growth-associated+proteins+in+the+neurons+of+adult+transgenic+mice.">Overexpression of growth-associated proteins in the neurons of adult transgenic mice.</a> Journal of neuroscience methods. 71 (1), 3-9 (1997).</li><li>Ali&#263;, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+from+mouse+strain+Thy1+YFP-16+are+a+valuable+tool+to+monitor+and+evaluate+neuronal+differentiation+and+morphology.">Neural stem cells from mouse strain Thy1 YFP-16 are a valuable tool to monitor and evaluate neuronal differentiation and morphology.</a> Neuroscience Letters. 634, 32-41 (2016).</li><li>Howroyd, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+the+Trigeminal+Ganglion+of+Nonrodent+Species+Used+in+Toxicology+Studies.">Dissection of the Trigeminal Ganglion of Nonrodent Species Used in Toxicology Studies.</a> Toxicologic Pathology. , (2019).</li><li>Schwieger, J., Esser, K. H., Lenarz, T., Scheper, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+long-term+spiral+ganglion+neuron+culture+with+reduced+glial+cell+number:+Effects+of+AraC+on+cell+composition+and+neurons.">Establishment of a long-term spiral ganglion neuron culture with reduced glial cell number: Effects of AraC on cell composition and neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 268, 106-116 (2016).</li><li>Liu, R., Lin, G., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Efficient+Method+for+Dorsal+Root+Ganglia+Neurons+Purification+with+a+One-Time+Anti-Mitotic+Reagent+Treatment.">An Efficient Method for Dorsal Root Ganglia Neurons Purification with a One-Time Anti-Mitotic Reagent Treatment.</a> PLoS ONE. 8 (4), 60558 (2013).</li><li>Burry, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimitotic+drugs+that+enhance+neuronal+survival+in+olfactory+bulb+cell+cultures.">Antimitotic drugs that enhance neuronal survival in olfactory bulb cell cultures.</a> Brain Research. 261 (2), 261-275 (1983).</li><li>Katzenell, S., Cabrera, J. R., North, B. J., Leib, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+Purification,+and+Culture+of+Primary+Murine+Sensory+Neurons.">Isolation, Purification, and Culture of Primary Murine Sensory Neurons.</a> Methods in molecular biology. 1656, 229-251 (2017).</li><li>Dussor, G. O., Price, T. J., Flores, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+transcription+factor+3+mRNA+is+upregulated+in+primary+cultures+of+trigeminal+ganglion+neurons.">Activating transcription factor 3 mRNA is upregulated in primary cultures of trigeminal ganglion neurons.</a> Molecular Brain Research. 118 (1-2), 156-159 (2003).</li><li>Lillesaar, C., Arenas, E., Hildebrand, C., Fried, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+rat+trigeminal+neurones+to+dental+pulp+cells+or+fibroblasts+overexpressing+neurotrophic+factors+in+vitro.">Responses of rat trigeminal neurones to dental pulp cells or fibroblasts overexpressing neurotrophic factors in vitro.</a> Neuroscience. 119 (2), 443-451 (2003).</li><li>Lillesaar, C., Eriksson, C., Fried, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+tooth+pulp+cells+elicit+neurite+growth+from+trigeminal+neurones+and+express+mRNAs+for+neurotrophic+factors+in+vitro.">Rat tooth pulp cells elicit neurite growth from trigeminal neurones and express mRNAs for neurotrophic factors in vitro.</a> Neuroscience Letters. 308 (3), (2001).</li><li>Lillesaar, C., Eriksson, C., Johansson, C. S., Fried, K., Hildebrand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tooth+pulp+tissue+promotes+neurite+outgrowth+from+rat+trigeminal+ganglia+in+vitro.">Tooth pulp tissue promotes neurite outgrowth from rat trigeminal ganglia in vitro.</a> Journal of neurocytology. 28 (8), 663-670 (1999).</li><li>Chmilewsky, F., Ayaz, W., Appiah, J., About, I., Chung, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+Growth+Factor+Secretion+From+Pulp+Fibroblasts+is+Modulated+by+Complement+C5a+Receptor+and+Implied+in+Neurite+Outgrowth.">Nerve Growth Factor Secretion From Pulp Fibroblasts is Modulated by Complement C5a Receptor and Implied in Neurite Outgrowth.</a> Scientific reports. 6, 31799 (2016).</li><li>Pagella, P., Neto, E., Jim&#195;&#169;nez-Rojo, L., Lamghari, M., Mitsiadis, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+co-culture+systems+for+studying+tooth+innervation.">Microfluidics co-culture systems for studying tooth innervation.</a> Frontiers in Physiology. 5, 326 (2014).</li><li>Miura, T., Yokokawa, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+culture+on+a+chip:+Developmental+biology+applications+of+self-organized+capillary+networks+in+microfluidic+devices.">Tissue culture on a chip: Developmental biology applications of self-organized capillary networks in microfluidic devices.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 58 (6), 505-515 (2016).</li></ol>

הפעילויות היומיומיות של חלל הפה דורשים כי תחושת השיניים גירויים חיצוניים דלקת פנימית על מנת לאפשר שימוש נאות ותחזוקה. עם זאת, רק מידע מוגבל זמין לגבי האותות הנוהגים בתהליכים ההתפתחותיים של השימור השן. פרוטוקול זה מספק שיטה לבידוד ושיתוף של התאים העיקריים של DP ו-TG הנוירונים כדי ללמוד את הת?...

אינבציה שן מאפשר לשיניים לחוש לחץ, טמפרטורה ודלקת, כולם חיוניים לשימוש ותחזוקה של איבר השן. אי תחושה של כאב שיניים הקשורים עששת וטראומה מוביל התקדמות המחלה. לכן, אינבציה נכונה היא דרישה לצמיחה שן רגילה, תפקוד וטיפול.
בעוד רוב האיברים הם פונקציונליים לחלוטין innervated על ידי זמן הלידה, התפתחות שיניים מרחיב לחיי מבוגרים, עם אינבציה שן ומינרליזציה המתרחשים בקונצרט במהלך השלבים לידה1,2. באופן מעניין, עיסת שיניים (DP) מזנכימה בתחילה מפריש אותות דוחה במהלך embryogenesis כדי למנוע כניסה אקסון לתוך האיבר המתפתח השיניים, אשר מאוחר יותר משתנה הפרשה של גורמים מושכים כמו השן התקרבות התפרצות3,4. במהלך השלבים לאחר הלידה, כלי לימפה אקסונים מתוך העצבים המשולש (TG) לחדור לתוך ולאורך השן סביב הזמן דנטט התצהיר מתחיל (נבדקו pagella, P. et al.5). מספר מחקרים vivo הוכיחו כי התקשורת העצבית-mesenchymal מדריך שיניים מורה בעכברים (נבדקו ב Luukko, K. et al.6), אבל כמה פרטים של מנגנונים מולקולריים זמינים.
שיתוף התרבויות הסלולארי מספק סביבות מבוקרות שבהן החוקרים יכולים להשפיע על האינטראקציות בין אוכלוסיות נירואליות לבין אוכלוסיית מסנצ'יאל. שיתוף האמנות ניסויים לאפשר להתעמק עמוק יותר לתוך משעולים איתות המנחה השן ופיתוח. עם זאת, כמה מהשיטות הקונבנציונליות המשמשות לחקר התאים בתרבות המשותף מציגים אתגרים טכניים. למשל, כתמים קריסטל סגול של neurite מוצלח יכול לא במיוחד הכתמים שתאי schwann כלולים בדיסיות הצרור TG, וייתכנו פסגות בחוזק צבע עם תגובות קטנות יחסית7. חדרי מיקרופלואידיג מציעים אופציה אטרקטיבית, אבל הם הרבה יותר יקרים מאשר מסנני העברה של8,9 ורק לאפשר את החקירה של תגובות נוירואליות הפרשות העקורים. כדי לטפל בנושאים אלה, פיתחנו פרוטוקול המאפשר: a) כתמים מדויקים והדמיה של TG neurite מוצלח בתגובה הפרשות DP, b) שינוי גנטי של תאים dp ו/או הנוירונים TG לחקור מסלולים מסוימים איתות, ו c) חקירה של תגובות תא DP הגורמים מופרש על ידי TG נוירונים. פרוטוקול זה מספק את היכולת לחקור במדויק מספר תכונות של אינבציה שן בסביבה מבוקרת של שיתוף תרבות חוץ-גופית.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-Fluoro-2&#39;-deoxyuridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0503</td>
			<td>Used as a mitotic Inhibitor at 15 &#956;M concentration in co-culture media, Day 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td>Co-culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-546 anti-chicken</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11040</td>
			<td>Secondary to stain neurite outgrowth labeled by anti-GFP antibody, 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP Antibody</td>
			<td>Aves Lab, Inc</td>
			<td>GFP-1010</td>
			<td>Primary antibody to label Thy1-YFP neurons, 1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Neurofilament 200 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NO142</td>
			<td>Monoclonal primary antibody to label neurons, 1:1000 dilution, alternative if YFP mice are not available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6;129- Tgfbr2tm1Karl/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>12603</td>
			<td>Tgfbr2f/f mouse model used for dental pulp cells in optimized protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>3709</td>
			<td>Thy1-YFP mouse model genotype used for trigeminal neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type II</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>234155-100MG</td>
			<td>Used to disperse trigeminal neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437</td>
			<td>Additive to co-culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11413-11</td>
			<td>Fine forceps for TG dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td>Coats the transwell inserts at final concentration of 10 &#956;g/ml, stock solution is assumed at 1.5 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis Buffer (Buffer RLT)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td>Extracts RNA from dental pulp cells post co-culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030081</td>
			<td>Additive to co-culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-dissecting scissors</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3146-1EA</td>
			<td>Dissection scissors to open skull</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-545-81</td>
			<td>Circlular coverslip for optional cell culturing and immunofluorescence processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimal Essential Medium a</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12571063</td>
			<td>Co-culture media base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td>Antibiotic additive to co-culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase Inhibitor</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>04 906 837 001</td>
			<td>Additive to RIPA Buffer for extracting protein from dental pulp cells post co-culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td>Used to aid in dental pulp cell transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7280</td>
			<td>Coverslip coating to aid dental pulp cellular adhesion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitors</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05 892 791 001</td>
			<td>Additive to RIPA Buffer for extracting protein from dental pulp cells post co-culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse/DNAse free eppendorf tubes</td>
			<td>Denville</td>
			<td>C-2172</td>
			<td>Presterilized 1.7 ml tubes for RNA, DNA or protein collection at the end of assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThinCert Cell Culture Insert</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>662631</td>
			<td>Transwell inserts for trigeminal neurons in co-culture assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td>Used fto disperse dental pulp cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Type II</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T-7409</td>
			<td>Used to disperse trigeminal neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11370-40</td>
			<td>Ultra fine forceps for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U3750</td>
			<td>Used as a mitotic Inhibitor at 1 &#956;M concentration in co-culture media, Day 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Filtration System</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCNY00060</td>
			<td>Steriflip disposable filter, 50 &#956;m nylon net filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>110006-15</td>
			<td>Long forceps for tissue transfer to conicals</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a co-culture method to study neurite outgrowth in response to dental pulp paracrine signals

אינבציה שן מאפשר לשיניים לחוש לחץ, טמפרטורה ודלקת, כולם חיוניים לשימוש ותחזוקה של איבר השן. ללא שימור חושי, פעילות שבעל פה יומית. תגרום נזק בלתי הפיך למרות חשיבותו, תפקידי האינבציה בהתפתחות השן ותחזוקתו התעלמו במידה רבה. מספר מחקרים הוכיחו כי תאים DP להפריש חלבונים מטריקס מטריצות ואותות הפרדרין כדי למשוך ולהנחות TG אקסונים לתוך ולאורך השן. עם זאת, מחקרים מעטים סיפקו תובנה מפורטת לתוך הטבלת הצלבות בין מספר העקורים לבין האפיפראנטים העצביים. כדי לטפל בפער זה בידע, החוקרים החלו לנצל שיתוף תרבויות ומגוון של טכניקות כדי לחקור את האינטראקציות האלה. כאן, אנו להדגים את השלבים מרובים מעורבים בתאי DP הראשי של העקורים עם הנוירונים TG התפזרו על מסנן מעבר היטב עם נקבוביות בקוטר גדול כדי לאפשר צמיחה סיבי דרך הנקבוביות. בתאי DP העיקרי עם הגן של הריבית מוקף האתרים loxP היו מנוצלים כדי להקל על מחיקת גנים באמצעות אדנווירוס-recombinase GFP מערכת. שימוש בנוירונים TG מהעכבר Thy1-yfp מותר לדימות מדויק של כלי לימפה, עם ביטוי היטב מעל רמות הרקע על ידי המיקרוסקופיה. תגובות DP ניתן לחקור באמצעות חלבון או או RNA איסוף וניתוח, או לחילופין, באמצעות כתמים immunofluorescent של תאים DP מצופה על כיסוי זכוכית נשלפת. מדיה ניתן לנתח באמצעות טכניקות כגון ניתוח פרוטאומית, למרות זה ידרוש המחסור אלבומין בשל נוכחותם של סרום העוברי העובר במדיה. פרוטוקול זה מספק שיטה פשוטה שיכולה להיות מניפולציות כדי ללמוד את התגובות מורפולוגית, גנטית, השלד ואת התשובות של הנוירונים TG ותאי DP בתגובה לסביבה מבוקרת של שיתוף תרבות שיטת.

תוצאות אלה מראות כי הגדילה TG neurite מוצלח הוגדלה בנוכחות תאים DP העיקרי בבסיס היטב לעומת השליטה של TG neurite מונוקולטורה (איור 2א, ג). יש כמה שינויים בneurite הצמיחה. לפיכך, יש לכלול את מרחב העצב הTG של החברה באופן קבוע כפקד כדי לזהות את רמות הבסיס של neurite outgrowth. התאים הראשוניים מ?...

Watch this Scientific Journal Video about A Co-Culture Method to Study Neurite Outgrowth in Response to Dental Pulp Paracrine Signals at JoVE.com

A Co-Culture Method to Study Neurite Outgrowth in Response to Dental Pulp Paracrine Signals

אנו מתארים את הבידוד, פיזור וציפוי של התאים הראשוניים של שיניים (DP) בתאי הראשי עם מסננים (TG) נוירונים תרבותי על גבי מסנני transwell יטב. התגובות הסלולר של תאים DP ניתן לנתח עם immunofluorescence או בניתוח RNA/חלבון. אימונואופלונציה של סמנים עצביים עם מיקרוסקופ קונפוקלית מאפשר ניתוח של תגובות neurite מוצלח.

שיטת שיתוף התרבות כדי ללמוד Neurite Outgrowth בתגובה שיניים זולה הקרנף סימנים

Tooth innervation allows teeth to sense pressure, temperature and inflammation, all of which are crucial to the use and maintenance of the tooth organ. ...

פרוטוקול זה מספק מתאר מפורט של איך לתאי גזע עיסת שיניים שיתוף עם נוירונים trigeminal. עם זאת, אנחנו יכולים לחקור תגובות מרובות מונע על ידי crosstalk שלהם. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היכולת ללמוד ולתפעל אוכלוסיות תאים או שתיהן ולמדוד במדויק את התוצאות.שיטה זו יש רלוונטיות ישירה למחקר עצבי והוא יכול לספק תובנה לתוך מחקר על איך תאי גזע עיסת שיניים לתקן רקמה עצבית פגום על ידי אירועים טראומטיים או מחלות ניווניות. יש כמה שלבים של טכניקה זו ללמוד וזה יכול להיות קשה לשמור על דרכי כולם. פרוטוקול זה מפרט כל שלב כדי לעזור עם זה.עיסת שיניים וגנגסטרים קשה לפזר ודורשים מערבולות שונות pipetting. גם אז לא תקבל פיזור מלא כך אופטימיזציה ושכפולים יידרשו. לאחר המתת חום של העכבר, מניחים את הראש על האנדרפד החד פעמי, כך שהפה הוא לכיוון התקרה ואת הבסיס של הצוואר שטוח על משטח העבודה.השתמש בסכין גילוח ותהל מנסר כדי להפריד את הגמלייה מהמקסילה. הסר את הלשון עם מספריים או מדפים כדי לאפשר גישה קלה יותר לטוחנות. מניחים את הראש הפתוח בצלחת על משטח גזה סטרילי ומ מניחים את הדגימה מתחת למיקרוסקופ הניתוח.הסר את רקמת העצם המהותית המקיפה את הטוחנות הראשונות. הכנס מלקחיים לתוך פתח מכתשיים להקניט את הרקמה מן השן לכיוון buccle או בצד ה לשוני של הפה. לאסוף את כל הטוחנות הראשונות maxillary בעדינות להעביר את התת-מנדבי ואת טוחנות תחילה maxillary לצלחת תרבות תאים נפרדת עם 1X PBS על קרח.הסר את האיבר החיצוני אמייל המקיף את החלק החיצוני של כל טוחן תחילה maxillary. עם קבוצה של מדפים לסובב את הטוסר כך cusps הם למטה ואת השורש הפתוח חשוף. יש פתח אליפטי בתחתית השן ורמת עיסת שיניים אטומה עגמה על ידי שכבה דקה של דנטין ואמייל.באמצעות קצה המדפים, בעדינות לשחרר את עיסת השיניים על ידי הפעלת זרוע אחת של המדפים סביב ההיקף הפנימי של הרקמה מינרלית. מוציאים את רקמת העיסה הדנטלית מהמבנה המינרלי ומעבירים לצלחת שלישית המכילה 1X PBS. הסר את האיבר החיצוני אמייל אם זה לא היה כבר מופרד.מעבירים את כל רקמת עיסת השיניים ל-0.25% טריפסין EDTA בצינור חרוטי של 50 מיליליטר. Vortex את התערובת ומ מניחים אותו באמבט מים חמים 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. מתחת למכסה המנוע הסטרילי, הוסף מדיה מחוממת של תרבות-משותף ליחס סופי של מדיה של אחד לאחד לפחות כדי לנסות להשבית את האנזים.צינור התקשורת למעלה ולמטה מספר פעמים עם צינור 10 מיליליטר כדי לפזר עוד יותר את עיסת שיניים בתקשורת, למנוע בועות גדולות. מעבירים מיליליטר אחד של עיסת השיניים המפוזרת לכל באר של צלחת תרבות רקמות 24 באר. מניחים את הצלחת באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס.ולאפשר לתאים לצרף ולעבר החוצה מן הרקמה undispersed במשך 48 שעות לפני שינוי מדיה. לאחר המתת יתד והסרה של העור, הכנס את קצה זוג מספריים לנתח מיקרו לתוך הבסיס של הגולגולת. חותכים לאורך התפר הסגיטלי של הגולגולת.בצע ארבעה חתכים אופקיים קטנים לאורך התפרים הכתר על ידי האוזניים עד לאורך התפרים lambdoid של בסיס הגולגולת. זה יוצר שני מדפים של עצם. השתמש במקלפים כדי לקלף בחזרה את שני מדפים של עצם כדי לחשוף את המוח.אתר את הגנגמליה הטריגמינאלית שוכנת בדורה מאטר בין המוח לעצם של תהליך מקסילרי. חותכים את שלושת הענפים שנוסעים לעיניים, מקסילה, ו mandible. ולהשתמש במטליות עדין קצה ישר להעביר את הגנגליה קר 1X PBS בצלחת על קרח.לאחר כל החבילות trigeminal נקצרים להשתמש מטליות קובץ להעביר גרעינים ל 50 צינור חרוט מיליליטר המכיל חמישה מיליגרם למיליליטר של קולגנס מסונן סטרילי סוג II.Vortex את התערובת ולמקם את הצינור באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 25 עד 30 דקות. כל חמש עד עשר דקות, תוציא את הצינור מהאמבטיה, המערבולת, ותחזור לאמבטיה. צנטריפוגה פתרון נוירון טריגמינלי קולגן במשך שתי דקות ב 643xg.מתחת למכסה המנוע של תרבות הרקמה, שאפו בעדינות את הקולגן עם מיקרופיפט והוסיפו חמישה מיליליטר של 1% טריפסין מסונן סטרילי II.Then מניחים את הצינור באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 25 עד 30 דקות ובתוך פרק זמן זה מערבולת הצינור לזמן קצר כל חמש דקות. הוסף מדיה ביחס של אחד לאחד של טריפסין למדיה כדי לבטל את ההפעלה של טריפסין הנותר. לספור את מספר התאים לדלל את התערובת ל 200, 000 תאים למיליליטר במדיה.מניחים מסנני טרנסוול מצופים לתוך בארות עם עיסת שיניים. Pipet 250 microliters על מסנן transwell ותרבות התאים ב 37 מעלות צלזיוס לילה. למחרת, להחליף את התקשורת עם מיליליטר אחד של מדיה שיתוף תרבות בתוספת uridine micromolar אחד ו 15 micromolar 5-Fluoro-2'deoxyuridine כדי לעצור את התפשטות יתר של תאים mesenchymal שעשוי למנוע נויריט יצוק.אתה חייב להוסיף מעכבי מיוטי ביום השני או צמיחה neurite לא יתרחשו. במחקר זה, נויריט trigeminal גדל בנוכחות תאי עיסת שיניים ראשוניים הבאר הבסיסית לעומת השליטה של מונוקולטורה neurite trigeminal. תאים ראשוניים מבודדים קולטן TGF-בטא 2 פלוקס / פלוקס העכבר היו שווים במספר לאחר זריקות של ade-Cre-GFP או ade-eGFP.PCR כמותי למחצה מדגים כי adenovirus-Cre-GFP מחק את הגן אגף הפיכת קולטן בטא גורם גדילה 2 עם אדנווירוס-eGFP משמש וקטור ויראלי שליטה. בתרבויות עם שינוי פקטורי גדילה קולטן בטא 2 מחיקה, צמיחה neurite ירד. הדמיה שדה בהיר של מסנני transwell לאחר הכתמת סגול גביש של אוכלוסיות תאים מראה כי נקבוביות גדולות נפוצים.החץ הגדול מצביע על תא עם מורפולוגיה mesenchymal ואילו החץ הקטן מצביע על תא של מורפולוגיה עצבית. סגול קריסטל מוכתם בשני התאים ללא הטיה. בנוסף, כתמי שפעת חיסונית של בטא-III tubulin עם נוגדן משני alexa 488 מראה כתמים לא ספציפיים של תאים מרובים מה שהופך הדמיה של מבנים afferent קשה.מכיוון שלא תאי עיסת שיניים ולא נוירונים טריגמינליים להתפזר בקלות, כל חוקר יצטרך לייעל את הליכי הציפוי שלהם. אם אתה תרבות תאי עיסת שיניים לבד בארות נפרדות אתה יכול להשתמש immunofluorescence או שאתה יכול לכמת RNA או רמות חלבון כדי לקבוע כיצד תאי עיסת שיניים מגיבים הנוירונים. זכור להלבין את כל מיכלים או טיפים שבאים במגע עם אדנווירוס.הקפד להשליך סכיני גילוח כראוי בפח חד.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

גישת optogenetic להערכת יצירת קשרים עצביים במערכת Co-תרבות

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

יצירת CRISPR / Cas9 מתווכת Monoallelic מחיקות ללמוד לתפקד Enhancer בתאי עכבר גזע עובריים

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

Using Touch-evoked Response and Locomotion Assays to Assess Muscle Performance and Function in Zebrafish

באמצעות תגובת מגע עוררת ו תנועת מבחנים להעריך שריר ביצועים ופונקציות של דג זברה

Zebrafish muscle development is highly conserved with mammalian systems making them an excellent model to study muscle function and disease. Many ...

Application of Impermeable Barriers Combined with Candidate Factor Soaked Beads to Study Inductive Signals in the Chick

יישום של חסמים בלתי חדירים בשילוב עם חרוזים ספוגים פקטור מועמד ללמוד איתותי אינדוקטיבי של צ&#39;יק

The chick embryo provides a superb vertebrate model that can be used to dissect developmental questions in a direct way. Its accessibility and robustness ...

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

וזמינותו תרבות משותפת הטבעת אבי העורקים: כלי נוח כדי להעריך את הפוטנציאל אנגיוגנזה של תאי סטרומה Mesenchymal במבחנה

Angiogenesis is a complex, highly regulated process responsible for providing and maintaining adequate tissue perfusion. Insufficient vasculature ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

שיטת Organotypic תרבות ללמוד על התפתחות עובריים עוף רקמות

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

שיטת In Vivo ללמוד העכבר דם Testis מכשול שלמות

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...

Isolation, Propagation, and Prion Protein Expression During Neuronal Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells

בידוד, הפצת וביטוי חלבונים פריון במהלך עצביים התמיינות של תאי גזע אנושי זולה שיניים

Bioethical issues related to the manipulation of embryonic stem cells have hindered advances in the field of medical research. For this reason, it is very ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

הערכה של נזק חמצוני בעכבר הראשי פני השטח העינית/תאים גזע בתגובה אולטרה סגול (UV-C) נזק

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

An Enhanced Green Fluorescence Protein-based Assay for Studying Neurite Outgrowth in Primary Neurons

משופרת ירוק מבוסס חלבון פלואורסצנטית מבוססת על לימוד Neurite Outgrowth בנוירונים ראשוניים

Neurite outgrowth is a fundamental event in the formation of the neural circuits during nervous system development. Severe neurite damage and synaptic ...