Name: a co-culture method to study neurite outgrowth in response to dental pulp paracrine signals
Uploaded: 2020-02-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Co-Culture Method to Study Neurite Outgrowth in Response to Dental Pulp Paracrine Signals at JoVE.com

この研究は、a)国立衛生研究所/NIAMS(助成金番号R01 AR062507とR01 AR053860からRSへ)、b)アラバマ大学バーミンガム歯科学術研究トレーニング(DART)助成金(番号T90DE022736(PI MacDougall))によって、国立歯科・頭蓋顔面研究研究所/クリオフェイシャル研究研究所/SBPに支援されました。 c) UABグローバル・センター・フォー・クラニオ顔面・口腔・歯科障害センター(GC-CODED)パイロットおよびD)国立歯科頭蓋顔面研究所SBPに対する研究/国立衛生研究所K99 DE024406助成金。

マウスを用いた実験はすべて、UAB機関動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認された。
1. プレートの準備
注: カバースリップは、アッセイの終了時に DP セルをイメージするために使用できます。サンプル処理中の汚染を防ぐために、滅菌組織培養フードの外側のすべてのインキュベーションとリンスのステップ中にプレート蓋がオンになってい?...

<ol>
	<li>Moe, K., Sijaona, A., Shrestha, A., Kettunen, P., Taniguchi, M., Luukko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semaphorin+3A+controls+timing+and+patterning+of+the+dental+pulp+innervation.">Semaphorin 3A controls timing and patterning of the dental pulp innervation.</a> Differentiation. 84 (5), 371-379 (2012).</li><li>Kollar, E. J., Lumsden, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tooth+morphogenesis:+the+role+of+the+innervation+during+induction+and+pattern+formation.">Tooth morphogenesis: the role of the innervation during induction and pattern formation.</a> Journal de biologie buccale. 7 (1), 49-60 (1979).</li><li>Lillesaar, C., Fried, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurites+from+trigeminal+ganglion+explants+grown+in+vitro+are+repelled+or+attracted+by+tooth-related+tissues+depending+on+developmental+stage.">Neurites from trigeminal ganglion explants grown in vitro are repelled or attracted by tooth-related tissues depending on developmental stage.</a> Neuroscience. 125 (1), 149-161 (2004).</li><li>Fried, K., Lillesaar, C., Sime, W., Kaukua, N., Patarroyo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+finding+of+pain+nerve+fibers:+Neural+growth+mechanisms+in+the+tooth+pulp.">Target finding of pain nerve fibers: Neural growth mechanisms in the tooth pulp.</a> Physiology &amp; Behavior. 92 (1-2), 40-45 (2007).</li><li>Pagella, P., Jim&#233;nez-Rojo, L., Mitsiadis, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+innervation+in+developing+and+regenerating+orofacial+tissues.">Roles of innervation in developing and regenerating orofacial tissues.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (12), 2241-2251 (2014).</li><li>Luukko, K., Kettunen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+tooth+morphogenesis+and+innervation+by+local+tissue+interactions,+signaling+networks,+and+semaphorin+3A.">Integration of tooth morphogenesis and innervation by local tissue interactions, signaling networks, and semaphorin 3A.</a> Cell Adhesion &amp; Migration. , 1-9 (2016).</li><li>Smit, M., Leng, J., Klemke, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+for+neurite+outgrowth+quantification.">Assay for neurite outgrowth quantification.</a> BioTechniques. 35 (2), 254-256 (2003).</li><li>de Almeida, J. F. A., Chen, P., Henry, M. A., Diogenes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+of+the+apical+papilla+regulate+trigeminal+neurite+outgrowth+and+targeting+through+a+BDNF-dependent+mechanism.">Stem cells of the apical papilla regulate trigeminal neurite outgrowth and targeting through a BDNF-dependent mechanism.</a> Tissue engineering. Part A. 20 (23-24), 3089-3100 (2014).</li><li>Pagella, P., Miran, S., Mitsiadis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Developing+Tooth+Germ+Innervation+Using+Microfluidic+Co-culture+Devices.">Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices.</a> Journal of Visualized Experiments. (102), e53114 (2015).</li><li>Coelen, R. J., Jose, D. G., May, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+hexadimethrine+bromide+(polybrene)+on+the+infection+of+the+primate+retroviruses+SSV+1/SSAV+1+and+BaEV.">The effect of hexadimethrine bromide (polybrene) on the infection of the primate retroviruses SSV 1/SSAV 1 and BaEV.</a> Archives of Virology. 75 (4), 307-311 (1983).</li><li>Caroni, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+growth-associated+proteins+in+the+neurons+of+adult+transgenic+mice.">Overexpression of growth-associated proteins in the neurons of adult transgenic mice.</a> Journal of neuroscience methods. 71 (1), 3-9 (1997).</li><li>Ali&#263;, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+from+mouse+strain+Thy1+YFP-16+are+a+valuable+tool+to+monitor+and+evaluate+neuronal+differentiation+and+morphology.">Neural stem cells from mouse strain Thy1 YFP-16 are a valuable tool to monitor and evaluate neuronal differentiation and morphology.</a> Neuroscience Letters. 634, 32-41 (2016).</li><li>Howroyd, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+the+Trigeminal+Ganglion+of+Nonrodent+Species+Used+in+Toxicology+Studies.">Dissection of the Trigeminal Ganglion of Nonrodent Species Used in Toxicology Studies.</a> Toxicologic Pathology. , (2019).</li><li>Schwieger, J., Esser, K. H., Lenarz, T., Scheper, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+long-term+spiral+ganglion+neuron+culture+with+reduced+glial+cell+number:+Effects+of+AraC+on+cell+composition+and+neurons.">Establishment of a long-term spiral ganglion neuron culture with reduced glial cell number: Effects of AraC on cell composition and neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 268, 106-116 (2016).</li><li>Liu, R., Lin, G., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Efficient+Method+for+Dorsal+Root+Ganglia+Neurons+Purification+with+a+One-Time+Anti-Mitotic+Reagent+Treatment.">An Efficient Method for Dorsal Root Ganglia Neurons Purification with a One-Time Anti-Mitotic Reagent Treatment.</a> PLoS ONE. 8 (4), 60558 (2013).</li><li>Burry, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimitotic+drugs+that+enhance+neuronal+survival+in+olfactory+bulb+cell+cultures.">Antimitotic drugs that enhance neuronal survival in olfactory bulb cell cultures.</a> Brain Research. 261 (2), 261-275 (1983).</li><li>Katzenell, S., Cabrera, J. R., North, B. J., Leib, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+Purification,+and+Culture+of+Primary+Murine+Sensory+Neurons.">Isolation, Purification, and Culture of Primary Murine Sensory Neurons.</a> Methods in molecular biology. 1656, 229-251 (2017).</li><li>Dussor, G. O., Price, T. J., Flores, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+transcription+factor+3+mRNA+is+upregulated+in+primary+cultures+of+trigeminal+ganglion+neurons.">Activating transcription factor 3 mRNA is upregulated in primary cultures of trigeminal ganglion neurons.</a> Molecular Brain Research. 118 (1-2), 156-159 (2003).</li><li>Lillesaar, C., Arenas, E., Hildebrand, C., Fried, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+rat+trigeminal+neurones+to+dental+pulp+cells+or+fibroblasts+overexpressing+neurotrophic+factors+in+vitro.">Responses of rat trigeminal neurones to dental pulp cells or fibroblasts overexpressing neurotrophic factors in vitro.</a> Neuroscience. 119 (2), 443-451 (2003).</li><li>Lillesaar, C., Eriksson, C., Fried, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+tooth+pulp+cells+elicit+neurite+growth+from+trigeminal+neurones+and+express+mRNAs+for+neurotrophic+factors+in+vitro.">Rat tooth pulp cells elicit neurite growth from trigeminal neurones and express mRNAs for neurotrophic factors in vitro.</a> Neuroscience Letters. 308 (3), (2001).</li><li>Lillesaar, C., Eriksson, C., Johansson, C. S., Fried, K., Hildebrand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tooth+pulp+tissue+promotes+neurite+outgrowth+from+rat+trigeminal+ganglia+in+vitro.">Tooth pulp tissue promotes neurite outgrowth from rat trigeminal ganglia in vitro.</a> Journal of neurocytology. 28 (8), 663-670 (1999).</li><li>Chmilewsky, F., Ayaz, W., Appiah, J., About, I., Chung, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+Growth+Factor+Secretion+From+Pulp+Fibroblasts+is+Modulated+by+Complement+C5a+Receptor+and+Implied+in+Neurite+Outgrowth.">Nerve Growth Factor Secretion From Pulp Fibroblasts is Modulated by Complement C5a Receptor and Implied in Neurite Outgrowth.</a> Scientific reports. 6, 31799 (2016).</li><li>Pagella, P., Neto, E., Jim&#195;&#169;nez-Rojo, L., Lamghari, M., Mitsiadis, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+co-culture+systems+for+studying+tooth+innervation.">Microfluidics co-culture systems for studying tooth innervation.</a> Frontiers in Physiology. 5, 326 (2014).</li><li>Miura, T., Yokokawa, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+culture+on+a+chip:+Developmental+biology+applications+of+self-organized+capillary+networks+in+microfluidic+devices.">Tissue culture on a chip: Developmental biology applications of self-organized capillary networks in microfluidic devices.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 58 (6), 505-515 (2016).</li></ol>

口腔の日々の活動は、歯が適切な使用と維持を可能にするために外的刺激と内部炎症を感知することを必要とする。しかし、歯の内膜の発達過程を促進する信号に関する情報は限られています。このプロトコルは、2つの集団間の相互通信を研究するために、プライマリDP細胞およびTGニューロンを分離および共培養する方法を提供する。いくつかの変数が最適化され、以下に説明されるよう?...

歯のインナーブは、歯の内部が圧力、温度および炎症を感知することを可能にし、そのすべてが歯器官の使用および維持にとって重要である。虫歯や外傷に伴う歯の痛みを感知しないと、病気の進行につながります。したがって、適切な内線は、正常な歯の成長、機能およびケアのための要件である。
ほとんどの臓器は出生時までに完全に機能し、内臓化されていますが、歯の発達は成人生活にまで及び、出生後段階1、2の間に協調して歯の内膜とミネラル化が起こる。興味深いことに、歯髄(DP)間感覚は、最初は胚発生時に反発シグナルを分泌し、発達中の歯器官への軸索の侵入を防ぎ、後に歯が噴火に近づくにつれて誘引因子の分泌に移行する3,4。出生後の段階では、象牙質沈着が始まる頃に歯牙(TG)神経から逸脱した軸索が歯に浸透する(Pagella,P.いくつかの生体内研究では、神経間葉相互作用がマウスの歯の内膜化を導く(Luukko,K.al.
細胞共培養は、研究者が神経集団と間葉集団間の相互作用を操作できる制御された環境を提供する。共培養実験により、歯のインナーブと発達を導くシグナル伝達経路をより深く掘り下げることができます。しかし、いくつかの従来の方法は、共培養で細胞を研究するために使用される技術的な課題を提示する。例えば、ニューライトの結晶バイオレット染色は、TGバンドル分散液に含まれるシュワン細胞を非特異的に染色することができ、また、比較的小さな応答で色強度のピークが7に有する可能性がある。マイクロ流体室は魅力的なオプションを提供しますが、トランスウェルフィルタ8、9よりもかなり高価であり、DP分泌物に対する神経応答の調査のみを許可します。これらの問題に対処するために、a)DP分泌物に応答したTG神経突起の正確な染色およびイメージング、b)DP細胞および/またはTGニューロンの遺伝子改変による特定のシグナル経路の調査、およびc)TGニューロンによって分泌された因子に対するDP細胞応答の調査を可能にするプロトコルを開発した。このプロトコルは、in vitro共培養アッセイの制御された環境における歯のインナーブの複数の特徴を正確に調査する能力を提供する。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-Fluoro-2&#39;-deoxyuridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0503</td>
			<td>Used as a mitotic Inhibitor at 15 &#956;M concentration in co-culture media, Day 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td>Co-culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-546 anti-chicken</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11040</td>
			<td>Secondary to stain neurite outgrowth labeled by anti-GFP antibody, 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP Antibody</td>
			<td>Aves Lab, Inc</td>
			<td>GFP-1010</td>
			<td>Primary antibody to label Thy1-YFP neurons, 1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Neurofilament 200 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NO142</td>
			<td>Monoclonal primary antibody to label neurons, 1:1000 dilution, alternative if YFP mice are not available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6;129- Tgfbr2tm1Karl/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>12603</td>
			<td>Tgfbr2f/f mouse model used for dental pulp cells in optimized protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>3709</td>
			<td>Thy1-YFP mouse model genotype used for trigeminal neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type II</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>234155-100MG</td>
			<td>Used to disperse trigeminal neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437</td>
			<td>Additive to co-culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11413-11</td>
			<td>Fine forceps for TG dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td>Coats the transwell inserts at final concentration of 10 &#956;g/ml, stock solution is assumed at 1.5 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis Buffer (Buffer RLT)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td>Extracts RNA from dental pulp cells post co-culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030081</td>
			<td>Additive to co-culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-dissecting scissors</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3146-1EA</td>
			<td>Dissection scissors to open skull</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-545-81</td>
			<td>Circlular coverslip for optional cell culturing and immunofluorescence processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimal Essential Medium a</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12571063</td>
			<td>Co-culture media base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td>Antibiotic additive to co-culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase Inhibitor</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>04 906 837 001</td>
			<td>Additive to RIPA Buffer for extracting protein from dental pulp cells post co-culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td>Used to aid in dental pulp cell transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7280</td>
			<td>Coverslip coating to aid dental pulp cellular adhesion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitors</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05 892 791 001</td>
			<td>Additive to RIPA Buffer for extracting protein from dental pulp cells post co-culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse/DNAse free eppendorf tubes</td>
			<td>Denville</td>
			<td>C-2172</td>
			<td>Presterilized 1.7 ml tubes for RNA, DNA or protein collection at the end of assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThinCert Cell Culture Insert</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>662631</td>
			<td>Transwell inserts for trigeminal neurons in co-culture assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td>Used fto disperse dental pulp cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Type II</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T-7409</td>
			<td>Used to disperse trigeminal neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11370-40</td>
			<td>Ultra fine forceps for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U3750</td>
			<td>Used as a mitotic Inhibitor at 1 &#956;M concentration in co-culture media, Day 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Filtration System</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCNY00060</td>
			<td>Steriflip disposable filter, 50 &#956;m nylon net filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>110006-15</td>
			<td>Long forceps for tissue transfer to conicals</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a co-culture method to study neurite outgrowth in response to dental pulp paracrine signals

歯のインナーブは、歯の内部が圧力、温度および炎症を感知することを可能にし、そのすべてが歯器官の使用および維持にとって重要である。感覚的な内膜がなければ、毎日の口腔活動は回復不可能な損傷を引き起こすであろう。その重要性にもかかわらず、歯の発達と維持における内膜の役割はほとんど見過ごされてきた。いくつかの研究は、DP細胞がTG軸索を引き付け、歯全体に導くために細胞外マトリックスタンパク質およびパラクリンシグナルを分泌することを実証している。しかし、DP間質と神経の薬効との間のクロストークに関する詳細な洞察を提供した研究はほとんどありません。この知識のギャップに対処するために、研究者は共文化と様々な技術を活用してこれらの相互作用を調査し始めました。ここでは、大口径の細孔を有するトランスウェルフィルターに分散したTGニューロンを用いて一次DP細胞を共培養し、細孔を通して軸索成長を可能にする複数のステップを実証する。loxP部位によって隣接した目的の遺伝子を有する原発性DP細胞は、アデノウイルス-Cre-GFPリコンビナーゼ系を用いて遺伝子欠失を促進するために利用された。Thy1-YFPマウスのTGニューロンを使用すると、共焦点顕微鏡によるバックグラウンドレベルをはるかに上回る発現を有する正確なアフェレントイメージングが可能となった。DP応答は、取り外し可能なガラスカバースリップにメッキされたDP細胞の免疫蛍光染色を介して、タンパク質またはRNAの収集および分析、または代替的に調査することができる。培地はプロテオーム分析などの手法を用いて分析できますが、これはウシ胎児血清の存在によるアルブミンの枯渇を必要とします。このプロトコルは、共培養アッセイの制御された環境に応答して、TGニューロンおよびDP細胞の形態学的、遺伝的、および細胞骨格応答を研究するために操作することができる簡単な方法を提供する。

これらの結果は、TGニューライト単一培養の制御と比較して、基礎となるウェル中の一次DP細胞の存在下でTGニューライトの成長が増加したことを示している(図2A、C)。ニューライトの成長には、いくつかのアッセイ・ツー・アッセイの変動があります。したがって、TGニューロン単一培養は、神経突起の成長の基底レベルを検出するためのコントロールとし?...

Watch this Scientific Journal Video about A Co-Culture Method to Study Neurite Outgrowth in Response to Dental Pulp Paracrine Signals at JoVE.com

A Co-Culture Method to Study Neurite Outgrowth in Response to Dental Pulp Paracrine Signals

我々は、トランスウェルフィルター上に培養された三叉(TG)ニューロンを用いた歯科パルプ(DP)一次細胞の分離、分散およびめっきについて述べた。DP細胞の細胞応答は、免疫蛍光またはRNA/タンパク質分析で分析することができる。共焦点顕微鏡を用いた神経細胞マーカーの免疫蛍光は、神経突起の成長応答の解析を可能にする。

歯髄パラクリン信号に反応した神経突起の成長を研究する共培養法

Tooth innervation allows teeth to sense pressure, temperature and inflammation, all of which are crucial to the use and maintenance of the tooth organ. ...

このプロトコルは、歯髄幹細胞を三叉神経細胞と共存させる方法の詳細な概要を提供する。それを使って、クロストークによって駆動される複数の応答を調査することができます。この技術の主な利点は、一方または両方の細胞集団を研究および操作し、結果を正確に測定する能力である。この方法は神経研究に直接関連しており、歯科パルプ幹細胞が外傷性イベントや神経変性疾患によって損傷を受けた神経組織をどのように修復するかの研究に関する洞察を提供する可能性があります。このテクニックには学ぶ段階がいくつかあり、それらのすべてを維持するのは難しいかもしれません。このプロトコルは、それを支援するために各段階を詳述します。歯髄および神経節は分散が困難であり、様々な渦およびピペットを必要とする。それでも、あなたは完全な分散を得ることはありませんので、最適化と複製が必要になります。マウスの安楽死後、口が天井に向かって、首のベースが作業面に平らになるように、使い捨ての下パッドに頭を置きます。カミソリの刃と鋸の動きを使用して、下顎骨と上顎骨を分離します。大臼歯への容易なアクセスを可能にするためにはさみや鉗子で舌を取り除きます。無菌ガーゼパッドの上に皿の中に開いた頭を置き、解剖顕微鏡の下に標本を置きます。最初の臼歯を取り囲む歯槽骨組織を取り除く。歯槽の開口部に鉗子を挿入し、口の頬または言語側に向かって歯から離れて組織をいじめます。すべての上顎第一の大臼歯を収集し、氷の上に1X PBSと別の細胞培養皿に顎下および上顎の最初の臼歯を穏やかに移す。各上顎第一大臼歯の外側を囲むエナメル外側器官を取り除きます。鉗子のセットでカスプが下がって開いているルートが露出するように、大臼歯を回転させます。歯の底に楕円形の開口部があり、歯垢とエナメル質の薄い層によってカプセル化された不透明な歯髄組織があります。鉗子の先端を使用して、鉱化された組織の内部円周の周りに鉗子の片腕を動かすことによって歯科パルプを穏やかに緩める。ミネラル化構造から歯髄組織を取り出し、1X PBSを含む第3の皿に移します。エナメル質の外器官がまだ分離されていない場合は、外器官を取り除きます。50ミリリットルの円錐管で0.25%トリプシンEDTAにすべての歯髄組織を移す。混合物をボルテックスし、10分間摂氏37度の温水浴に入れます。無菌フードの下で、酵素を不活性化するためにトリプシンに少なくとも1対1の培地の最終比率に温めた共培養培地を加える。10ミリリットルのピペットでメディアを何度も上下にピペストして、さらにメディアに歯科パルプを分散させ、大きな泡を避ける。分散した歯科パルプの1ミリリットルを24ウェル組織培養プレートの各ウェルに移す。プレートを37°Cのインキュベーターに入れなさい。そして、細胞がメディアを交換する前に48時間、未分散組織から取り付けて移動することを可能にする。安楽死と皮膚の除去後、頭蓋骨の基部にマイクロ解剖ハサミの先端を挿入します。頭蓋骨の矢状縫合に沿ってカットします。頭蓋骨の基部のラムドイド縫合糸に沿って耳でコロナ縫合糸に沿って4つの小さな水平カットを行います。これにより、2 つのフラップのボーンが作成されます。鉗子を使用して骨の2つのフラップを剥がして脳を明らかにする。上顎プロセスの脳と骨の間の硬膜に収容された三叉神経節を見つける。目、上顎、下顎下に移動する3つの枝をカットします。そして、氷の上の皿で冷たい1X PBSに神経節を転送するためにストレートエッジファイン鉗子を使用してください。すべての三叉束が収穫されると、ファイル鉗子を使用して、無菌濾過されたコラゲターゼの1ミリリットル当たり5ミリグラムを含む50ミリリットルの円錐状チューブに神経節を移し、混合物を37°Cの水浴に入れます。5~10分ごとに、水浴からチューブを取り出し、渦を出して、お風呂に戻ります。643xgで2分間コラゲターゼ三叉ニューロン溶液を遠心分離する。組織培養フードの下で、クロピペットでコラゲレーターーゼを軽く吸引し、1%無菌濾過トリプシンIIの5ミリリットルを加え、チューブを37°Cの水浴に25〜30分間置き、この時間枠内でチューブを5分ごとに短時間渦液します。メディアに対するトリプシンの1対1の比率でメディアを追加し、残りのトリプシンを無効にします。細胞数を数え、培地中の1ミリリットル当たり200,000細胞に希釈する。コーティングされたトランスウェルフィルターを歯科パルプ付きの井戸に入れる。トランスウェルフィルターに250マイクロリットルをピペットし、一晩摂氏37度で細胞を培養する。翌日、培地を1ミクロモルウリジンと15マイクロモル5-Fluoro-2'deoxyuridineを補った共培養培地の1ミリリットルに置き換え、中中性突起増殖を防ぐ可能性のある間葉細胞の過剰増殖を止める。2日目に有糸分裂抑制剤を追加しないと、神経突起の増殖は起こらない。本研究では、三叉神経突起単培養の制御と比較して、基礎下層の一次歯髄細胞の存在下で三叉状の神経突起伸長が増加した。TGF-β受容体2フロックス/フロックスマウスから単離された初等細胞は、ade-Cre-GFPまたはade-eGFPのいずれかの注射後に数で同等であった。半定量的PCRは、アデノウイルス-Cre-GFPが、コントロールウイルスベクターとして機能するアデノウイルスeGFPを用いた成長因子β受容体2を変換する横置遺伝子を削除したことを示す。成長因子β受容体2欠失を変化させる培養において、神経突起伸長は減少した。細胞集団の結晶紫色染色後のトランスウェルフィルターの明視野イメージングは、大きな細孔が流行していることを示している。大きな矢印は間葉系形態を持つ細胞を指し示し、小さな矢印は神経形態の細胞を指している。結晶バイオレットは、バイアスなしで両方の細胞を染色しました。また、アレクサ488二次抗体を用いたβ-IIIチューブリンの免疫蛍光染色は、異性体のイメージングを困難にする複数の細胞の非特異的染色を示す。歯髄細胞も三叉神経細胞も容易に分散しないので、各研究者はめっき手順を最適化する必要があります。歯科用パルプ細胞を別々のウェルで培養するだけで、免疫蛍光を使用するか、RNAまたはタンパク質レベルを定量化して、歯髄細胞がニューロンにどのように反応しているかを判断することができます。アデノウイルスに接触する容器や先端を漂白することを忘れないでください。鋭利なビンにカミソリを適切に捨ててください。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

共培養系における神経結合の形成を評価するための光遺伝学的アプローチ

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

生成CRISPR / Cas9媒介1アレル欠失マウス胚性幹細胞でエンハンサー機能を研究するために、

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

Using Touch-evoked Response and Locomotion Assays to Assess Muscle Performance and Function in Zebrafish

ゼブラフィッシュで筋肉のパフォーマンスと機能を評価するためにタッチ誘発応答と歩行アッセイを使用して

Zebrafish muscle development is highly conserved with mammalian systems making them an excellent model to study muscle function and disease. Many ...

Application of Impermeable Barriers Combined with Candidate Factor Soaked Beads to Study Inductive Signals in the Chick

チックに誘導シグナルを研究するために、候補因子浸しビーズと組み合わせることで不浸透性の障壁の応用

The chick embryo provides a superb vertebrate model that can be used to dissect developmental questions in a direct way. Its accessibility and robustness ...

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

大動脈リング共培養アッセイ:体外間葉系間質細胞の血管新生の可能性を評価するために便利なツール

Angiogenesis is a complex, highly regulated process responsible for providing and maintaining adequate tissue perfusion. Insufficient vasculature ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

ニワトリ胚組織の開発培養法

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

マウス血液精巣関門の整合性を研究するIn Vivo法

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...

Isolation, Propagation, and Prion Protein Expression During Neuronal Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells

分離、伝達、およびプリオン蛋白質発現ひと歯髄幹細胞の神経分化

Bioethical issues related to the manipulation of embryonic stem cells have hindered advances in the field of medical research. For this reason, it is very ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

紫外C(UV-C)損傷に対する主なマウス眼表面細胞/幹細胞における酸化的損傷の評価

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

An Enhanced Green Fluorescence Protein-based Assay for Studying Neurite Outgrowth in Primary Neurons

原発性ニューロンにおける神経質の増殖を研究するための強化された緑色蛍光タンパク質ベースのアッセイ

Neurite outgrowth is a fundamental event in the formation of the neural circuits during nervous system development. Severe neurite damage and synaptic ...