Name: a co-culture method to study neurite outgrowth in response to dental pulp paracrine signals
Uploaded: 2020-02-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Co-Culture Method to Study Neurite Outgrowth in Response to Dental Pulp Paracrine Signals at JoVE.com

이 작품은 a) 국립 보건 원 (보조금 번호 R01 AR062507 및 R01 AR053860 에 RS), b) 버밍엄 치과 학술 연구 교육 (DART) 보조금 (번호 T90DE022736 (PI 맥두걸)) 국립 치과 연구소에서 SBP에 알라바마 대학 c) UAB 글로벌 두개안면, 구강 및 치과 장애 센터(GC-CODED) SBP 및 d에 대한 파일럿 및 타당성 보조금) 국립 치과 및 두개안면 연구소 연구/국립 보건원 K99 DE024406 SBP 에 대한 보조금.

마우스를 사용한 모든 실험은 UAB 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)에 의해 승인되었습니다.
1. 플레이트 준비
참고: 커버슬립은 분석의 끝에 있는 DP 세포를 이미지화하는 데 사용될 수 있습니다. 시료 처리 중 오염을 방지하기 위해 멸균 조직 배양 후드 외부의 모든 인큐베이션 및 헹구 단계 동안 플레이트 뚜껑이 켜져 있는지 확인하십시오.
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	<li>Moe, K., Sijaona, A., Shrestha, A., Kettunen, P., Taniguchi, M., Luukko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semaphorin+3A+controls+timing+and+patterning+of+the+dental+pulp+innervation.">Semaphorin 3A controls timing and patterning of the dental pulp innervation.</a> Differentiation. 84 (5), 371-379 (2012).</li><li>Kollar, E. J., Lumsden, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tooth+morphogenesis:+the+role+of+the+innervation+during+induction+and+pattern+formation.">Tooth morphogenesis: the role of the innervation during induction and pattern formation.</a> Journal de biologie buccale. 7 (1), 49-60 (1979).</li><li>Lillesaar, C., Fried, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurites+from+trigeminal+ganglion+explants+grown+in+vitro+are+repelled+or+attracted+by+tooth-related+tissues+depending+on+developmental+stage.">Neurites from trigeminal ganglion explants grown in vitro are repelled or attracted by tooth-related tissues depending on developmental stage.</a> Neuroscience. 125 (1), 149-161 (2004).</li><li>Fried, K., Lillesaar, C., Sime, W., Kaukua, N., Patarroyo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+finding+of+pain+nerve+fibers:+Neural+growth+mechanisms+in+the+tooth+pulp.">Target finding of pain nerve fibers: Neural growth mechanisms in the tooth pulp.</a> Physiology &amp; Behavior. 92 (1-2), 40-45 (2007).</li><li>Pagella, P., Jim&#233;nez-Rojo, L., Mitsiadis, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+innervation+in+developing+and+regenerating+orofacial+tissues.">Roles of innervation in developing and regenerating orofacial tissues.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (12), 2241-2251 (2014).</li><li>Luukko, K., Kettunen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+tooth+morphogenesis+and+innervation+by+local+tissue+interactions,+signaling+networks,+and+semaphorin+3A.">Integration of tooth morphogenesis and innervation by local tissue interactions, signaling networks, and semaphorin 3A.</a> Cell Adhesion &amp; Migration. , 1-9 (2016).</li><li>Smit, M., Leng, J., Klemke, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+for+neurite+outgrowth+quantification.">Assay for neurite outgrowth quantification.</a> BioTechniques. 35 (2), 254-256 (2003).</li><li>de Almeida, J. F. A., Chen, P., Henry, M. A., Diogenes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+of+the+apical+papilla+regulate+trigeminal+neurite+outgrowth+and+targeting+through+a+BDNF-dependent+mechanism.">Stem cells of the apical papilla regulate trigeminal neurite outgrowth and targeting through a BDNF-dependent mechanism.</a> Tissue engineering. Part A. 20 (23-24), 3089-3100 (2014).</li><li>Pagella, P., Miran, S., Mitsiadis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Developing+Tooth+Germ+Innervation+Using+Microfluidic+Co-culture+Devices.">Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices.</a> Journal of Visualized Experiments. (102), e53114 (2015).</li><li>Coelen, R. J., Jose, D. G., May, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+hexadimethrine+bromide+(polybrene)+on+the+infection+of+the+primate+retroviruses+SSV+1/SSAV+1+and+BaEV.">The effect of hexadimethrine bromide (polybrene) on the infection of the primate retroviruses SSV 1/SSAV 1 and BaEV.</a> Archives of Virology. 75 (4), 307-311 (1983).</li><li>Caroni, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+growth-associated+proteins+in+the+neurons+of+adult+transgenic+mice.">Overexpression of growth-associated proteins in the neurons of adult transgenic mice.</a> Journal of neuroscience methods. 71 (1), 3-9 (1997).</li><li>Ali&#263;, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+from+mouse+strain+Thy1+YFP-16+are+a+valuable+tool+to+monitor+and+evaluate+neuronal+differentiation+and+morphology.">Neural stem cells from mouse strain Thy1 YFP-16 are a valuable tool to monitor and evaluate neuronal differentiation and morphology.</a> Neuroscience Letters. 634, 32-41 (2016).</li><li>Howroyd, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+the+Trigeminal+Ganglion+of+Nonrodent+Species+Used+in+Toxicology+Studies.">Dissection of the Trigeminal Ganglion of Nonrodent Species Used in Toxicology Studies.</a> Toxicologic Pathology. , (2019).</li><li>Schwieger, J., Esser, K. H., Lenarz, T., Scheper, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+long-term+spiral+ganglion+neuron+culture+with+reduced+glial+cell+number:+Effects+of+AraC+on+cell+composition+and+neurons.">Establishment of a long-term spiral ganglion neuron culture with reduced glial cell number: Effects of AraC on cell composition and neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 268, 106-116 (2016).</li><li>Liu, R., Lin, G., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Efficient+Method+for+Dorsal+Root+Ganglia+Neurons+Purification+with+a+One-Time+Anti-Mitotic+Reagent+Treatment.">An Efficient Method for Dorsal Root Ganglia Neurons Purification with a One-Time Anti-Mitotic Reagent Treatment.</a> PLoS ONE. 8 (4), 60558 (2013).</li><li>Burry, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimitotic+drugs+that+enhance+neuronal+survival+in+olfactory+bulb+cell+cultures.">Antimitotic drugs that enhance neuronal survival in olfactory bulb cell cultures.</a> Brain Research. 261 (2), 261-275 (1983).</li><li>Katzenell, S., Cabrera, J. R., North, B. J., Leib, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+Purification,+and+Culture+of+Primary+Murine+Sensory+Neurons.">Isolation, Purification, and Culture of Primary Murine Sensory Neurons.</a> Methods in molecular biology. 1656, 229-251 (2017).</li><li>Dussor, G. O., Price, T. J., Flores, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+transcription+factor+3+mRNA+is+upregulated+in+primary+cultures+of+trigeminal+ganglion+neurons.">Activating transcription factor 3 mRNA is upregulated in primary cultures of trigeminal ganglion neurons.</a> Molecular Brain Research. 118 (1-2), 156-159 (2003).</li><li>Lillesaar, C., Arenas, E., Hildebrand, C., Fried, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+rat+trigeminal+neurones+to+dental+pulp+cells+or+fibroblasts+overexpressing+neurotrophic+factors+in+vitro.">Responses of rat trigeminal neurones to dental pulp cells or fibroblasts overexpressing neurotrophic factors in vitro.</a> Neuroscience. 119 (2), 443-451 (2003).</li><li>Lillesaar, C., Eriksson, C., Fried, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+tooth+pulp+cells+elicit+neurite+growth+from+trigeminal+neurones+and+express+mRNAs+for+neurotrophic+factors+in+vitro.">Rat tooth pulp cells elicit neurite growth from trigeminal neurones and express mRNAs for neurotrophic factors in vitro.</a> Neuroscience Letters. 308 (3), (2001).</li><li>Lillesaar, C., Eriksson, C., Johansson, C. S., Fried, K., Hildebrand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tooth+pulp+tissue+promotes+neurite+outgrowth+from+rat+trigeminal+ganglia+in+vitro.">Tooth pulp tissue promotes neurite outgrowth from rat trigeminal ganglia in vitro.</a> Journal of neurocytology. 28 (8), 663-670 (1999).</li><li>Chmilewsky, F., Ayaz, W., Appiah, J., About, I., Chung, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+Growth+Factor+Secretion+From+Pulp+Fibroblasts+is+Modulated+by+Complement+C5a+Receptor+and+Implied+in+Neurite+Outgrowth.">Nerve Growth Factor Secretion From Pulp Fibroblasts is Modulated by Complement C5a Receptor and Implied in Neurite Outgrowth.</a> Scientific reports. 6, 31799 (2016).</li><li>Pagella, P., Neto, E., Jim&#195;&#169;nez-Rojo, L., Lamghari, M., Mitsiadis, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+co-culture+systems+for+studying+tooth+innervation.">Microfluidics co-culture systems for studying tooth innervation.</a> Frontiers in Physiology. 5, 326 (2014).</li><li>Miura, T., Yokokawa, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+culture+on+a+chip:+Developmental+biology+applications+of+self-organized+capillary+networks+in+microfluidic+devices.">Tissue culture on a chip: Developmental biology applications of self-organized capillary networks in microfluidic devices.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 58 (6), 505-515 (2016).</li></ol>

구강의 일상 적인 활동은 치아가 적절한 사용과 유지 보수를 허용하기 위해 외부 자극과 내부 염증을 감지해야합니다. 그러나 치아 내막의 발달 과정을 이끄는 신호와 관련하여 제한된 정보만 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 두 집단 간의 교차 통신을 연구하기 위해 1차 DP 세포 및 TG 뉴런을 분리하고 공동 배양하는 방법을 제공한다. 몇 가지 변수가 최적화되었고 아래에 설명된 대로 연구의 ?...

치아 의 식구는 치아가 압력, 온도 및 염증을 감지 할 수 있게하며, 이 모든 것이 치아 기관의 사용 및 유지 보수에 중요합니다. 치과 충치및 외상과 관련되었던 치아 고통을 감지하지 못하면 질병 진행으로 이끌어 냅니다. 따라서 적절한 내면화는 정상적인 치아 성장, 기능 및 관리를위한 요구 사항입니다.
대부분의 장기는 출생 시부터 완벽하게 기능하고 자극되지만, 치아 발달은 출생 후1,2단계에서 치아 내피와 미네랄화가 동시에 발생하는 성인 생활로 확장됩니다. 흥미롭게도, 치과 펄프 (DP) mesenchyme는 처음에 개발 치아 기관으로 축삭 진입을 방지하기 위해 배아 발생 동안 발충제 신호를 분비, 이는 나중에 치아가분화에가까워짐에 따라 유치인자의 분비로 이동3,4. 출생 후 단계 동안, 삼차 (TG) 신경에서 구심성 축축은 상아질 침착이 시작되는 시간 의 주위에 치아에 침투합니다 (Pagella에서 검토, P.외. 5). 몇몇 생체 내 연구는 뉴런 -mesenchymal 상호 작용이 마우스에서 치아 내심을 안내한다는 것을 입증했다 (Luukko에서 검토, K. 외6),그러나 분자 메커니즘의 몇 가지 세부 사항을 사용할 수 있습니다.
세포 공동 배양은 조사자가 신경과 중간 엽 인구 사이 상호 작용을 조작할 수 있는 통제된 환경을 제공합니다. 공동 배양 실험을 통해 치아 내심 및 발달을 유도하는 신호 경로에 대해 더 깊이 파고들 수 있습니다. 그러나, 공동 배양에서 세포를 연구하기 위하여 이용된 몇몇 전통적인 방법은 기술적인 도전을 제출합니다. 예를 들어, 뉴라이트 의 크리스탈 바이올렛 염색은 TG 번들 분산에 포함된 비특이적 슈완 세포를 비특이적으로 염색할 수 있으며, 상대적으로 작은 반응으로 색 강도가 피크일 수 있다7. 미세 유체 챔버는 매력적인 옵션을 제공하지만 트랜스웰 필터8,9보다 상당히 비싸고 DP 분비에 대한 신경 반응의 조사만 허용합니다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 우리는 허용하는 프로토콜을 개발했습니다: a) DP 분비에 대한 응답으로 TG 뉴라이트 의 정확한 염색 및 이미징, b) DP 세포 및/또는 TG 뉴런의 유전자 변형은 특정 신호 전달 경로를 조사하고, c) TG 뉴런에 의해 분비되는 요인에 대한 DP 세포 반응의 조사. 이 프로토콜은 시험관 내 공동 배양 분석법의 조절된 환경에서 치아 내피의 여러 특징을 정밀하게 조사하는 기능을 제공한다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-Fluoro-2&#39;-deoxyuridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0503</td>
			<td>Used as a mitotic Inhibitor at 15 &#956;M concentration in co-culture media, Day 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td>Co-culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-546 anti-chicken</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11040</td>
			<td>Secondary to stain neurite outgrowth labeled by anti-GFP antibody, 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP Antibody</td>
			<td>Aves Lab, Inc</td>
			<td>GFP-1010</td>
			<td>Primary antibody to label Thy1-YFP neurons, 1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Neurofilament 200 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NO142</td>
			<td>Monoclonal primary antibody to label neurons, 1:1000 dilution, alternative if YFP mice are not available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6;129- Tgfbr2tm1Karl/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>12603</td>
			<td>Tgfbr2f/f mouse model used for dental pulp cells in optimized protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>3709</td>
			<td>Thy1-YFP mouse model genotype used for trigeminal neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type II</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>234155-100MG</td>
			<td>Used to disperse trigeminal neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437</td>
			<td>Additive to co-culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11413-11</td>
			<td>Fine forceps for TG dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td>Coats the transwell inserts at final concentration of 10 &#956;g/ml, stock solution is assumed at 1.5 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis Buffer (Buffer RLT)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td>Extracts RNA from dental pulp cells post co-culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030081</td>
			<td>Additive to co-culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-dissecting scissors</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3146-1EA</td>
			<td>Dissection scissors to open skull</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-545-81</td>
			<td>Circlular coverslip for optional cell culturing and immunofluorescence processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimal Essential Medium a</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12571063</td>
			<td>Co-culture media base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td>Antibiotic additive to co-culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase Inhibitor</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>04 906 837 001</td>
			<td>Additive to RIPA Buffer for extracting protein from dental pulp cells post co-culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td>Used to aid in dental pulp cell transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7280</td>
			<td>Coverslip coating to aid dental pulp cellular adhesion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitors</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05 892 791 001</td>
			<td>Additive to RIPA Buffer for extracting protein from dental pulp cells post co-culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse/DNAse free eppendorf tubes</td>
			<td>Denville</td>
			<td>C-2172</td>
			<td>Presterilized 1.7 ml tubes for RNA, DNA or protein collection at the end of assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThinCert Cell Culture Insert</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>662631</td>
			<td>Transwell inserts for trigeminal neurons in co-culture assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td>Used fto disperse dental pulp cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Type II</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T-7409</td>
			<td>Used to disperse trigeminal neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11370-40</td>
			<td>Ultra fine forceps for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U3750</td>
			<td>Used as a mitotic Inhibitor at 1 &#956;M concentration in co-culture media, Day 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Filtration System</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCNY00060</td>
			<td>Steriflip disposable filter, 50 &#956;m nylon net filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>110006-15</td>
			<td>Long forceps for tissue transfer to conicals</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a co-culture method to study neurite outgrowth in response to dental pulp paracrine signals

치아 의 식구는 치아가 압력, 온도 및 염증을 감지 할 수 있게하며, 이 모든 것이 치아 기관의 사용 및 유지 보수에 중요합니다. 감각 적인 내면없이, 매일 구강 활동은 돌이킬 수없는 손상을 일으킬 것입니다. 그 중요성에도 불구하고 치아 발달 및 유지 보수에서 의한 내면화의 역할은 크게 간과되었습니다. 여러 연구는 DP 세포가 치아 안팎으로 TG 축을 유치하고 안내하기 위해 세포외 매트릭스 단백질과 파라크린 신호를 분비한다는 것을 입증했습니다. 그러나, 몇몇 연구 결과는 DP mesenchyme와 신경 구심질 사이 크로스토크에 상세한 통찰력을 제공했습니다. 지식의 이 격차를 해결하기 위하여는, 연구원은 이 상호 작용을 조사하기 위하여 공동 문화 및 다양한 기술을 이용하기 시작했습니다. 여기에서, 우리는 기공을 통해 축산 성장을 허용하기 위하여 큰 직경 기공을 가진 오버리 트랜스웰 필터에 분산된 TG 뉴런을 가진 1 차적인 DP 세포를 공동 배양에서 관련시킨 다중 단계를 보여줍니다. loxP 부위에 의해 측면에 있는 관심 있는 유전자를 가진 1차 DP 세포는 아데노바이러스-Cre-GFP 재조합아제 시스템을 사용하여 유전자 결실을 용이하게 하기 위해 활용되었다. Thy1-YFP 마우스에서 TG 뉴런을 사용하여 공초점 현미경 검사법에 의한 배경 수준 보다 훨씬 높은 표정으로 정밀한 구심성 이미징을 허용했습니다. DP 반응은 단백질 또는 RNA 수집 및 분석을 통해 조사될 수 있고, 또는 탈착식 유리 커버슬립에 도금된 DP 세포의 면역형광 염색을 통해 조사될 수 있다. 미디어는 프로테오믹 분석과 같은 기술을 사용하여 분석할 수 있지만, 미디어에 태아 소 혈청의 존재로 인해 알부민 고갈이 필요합니다. 이 프로토콜은 공동 배양 분석의 조절된 환경에 반응하여 TG 뉴런 및 DP 세포의 형태학적, 유전적, 및 세포골격 반응을 연구하기 위해 조작될 수 있는 간단한 방법을 제공한다.

이러한 결과는 TG 뉴라이트 단문화의 대조군과 비교하여 기본에서 1차 DP 세포의 존재에서 TG 뉴라이트 의 자성장이 증가하였다는 것을보여준다(도 2A,C). 신경외 분석 결과에서 몇 가지 분석-대-분석 가변성이 있다. 따라서, TG 뉴런 단일배양은 뉴라이트 의 기저 수준을 검출하는 대조군으로서 모든 검역사에 포함되어야 한다. Tgfbr2f/f 마우스로부터의 1차 세...

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A Co-Culture Method to Study Neurite Outgrowth in Response to Dental Pulp Paracrine Signals

우리는 치과 펄프 (DP) 1 차 세포의 격리, 분산 및 도금이 지나치게 트랜스웰 필터 위에 배양된 삼차 (TG) 뉴런을 설명합니다. DP 세포의 세포 반응은 면역 형광 또는 RNA /단백질 분석으로 분석 될 수있다. 공초점 현미경검사법을 가진 신경 마커의 면역형광은 신경질성 파생 반응의 분석을 허용합니다.

치과 펄프 파라크린 신호에 대한 응답으로 노이라이트 의 성장을 연구하는 공동 문화 방법

Tooth innervation allows teeth to sense pressure, temperature and inflammation, all of which are crucial to the use and maintenance of the tooth organ. ...

이 프로토콜은 삼차 뉴런과 치과 펄프 줄기 세포를 공동 배양하는 방법에 대한 자세한 개요를 제공합니다. 이를 통해 우리는 그들의 크로스토크에 의해 구동되는 여러 응답을 조사할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 세포 집단 또는 두 세포 집단을 연구하고 조작하고 결과를 정확하게 측정하는 기능입니다.이 방법은 신경 연구에 직접적인 관련성을 가지고 있으며 치과 펄프 줄기 세포가 외상성 사건이나 신경 퇴행성 질환으로 손상된 신경 조직을 복구하는 방법에 대한 연구에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 이 기술의 여러 단계가 배울 수 있으며 그들 모두를 유지하기어려울 수 있습니다. 이 프로토콜은 이를 돕기 위해 각 단계에 자세히 설명합니다.치과 펄프와 중질은 분산하기 어렵고 다양한 소용돌이 및 파이펫팅이 필요합니다. 그럼에도 불구하고 전체 분산을 얻지 못하므로 최적화 및 복제가 필요합니다. 마우스의 안락사 후, 입이 천장쪽으로 향하고 목의 바닥이 작업 표면에 평평할 수 있도록 일회용 언더패드에 머리를 놓습니다.면도날과 톱질 동작을 사용하여 하악을 맥시라와 분리합니다. 어금니에 쉽게 접근할 수 있도록 가위 나 집게로 혀를 제거합니다. 멸균 거즈 패드 위에 열린 머리를 접시에 놓고 해부 현미경 아래에 표본을 놓습니다.첫 번째 어금니를 둘러싼 폐포 뼈 조직을 제거합니다. 폐포 개구부에 집게를 삽입하고 치아에서 부터 입의 부클 또는 언어 측면을 향해 조직을 애타게 합니다. 모든 상악 제1 어금을 수집하고 부드럽게 얼음에 1X PBS와 별도의 세포 배양 접시에 submandibular 및 상악 제 1 어금니를 전송합니다.각 상악 제1 어금니의 외부를 둘러싼 에나멜 외부 장기를 제거합니다. 집게 세트로 커프스가 다운되고 열린 루트가 노출되도록 어금니를 회전시다. 치아 바닥에 는 타원형 개구부가 있고 덴틴과 에나멜의 얇은 층으로 캡슐화 된 불투명한 치과 펄프 조직이 있습니다.집게의 끝을 사용하여, 미네랄 화 조직의 내부 둘레 주위에 집게의 한 쪽 팔을 실행하여 치과 펄프를 부드럽게 풀어. 미네랄 구조에서 치과 펄프 조직을 제거하고 1X PBS를 포함하는 제 3 접시로 옮김합니다. 이미 분리되지 않은 경우 에나멜 외부 장기를 제거합니다.모든 치과 펄프 조직을 50 밀리리터 원추형 튜브에 0.25%의 트립신 EDTA로 이송합니다. 혼합물을 소용돌이시키고 섭씨 37도의 따뜻한 수조에 10분 간 놓습니다. 멸균 후드 아래에서, 효소를 비활성화하기 위해 트립신에 적어도 일대일 미디어의 최종 비율에 따뜻한 공동 배양 매체를 추가합니다.미디어의 치과 펄프를 더욱 분산시키고 큰 거품을 피하기 위해 10 밀리리터 파이펫으로 미디어를 여러 번 위아래로 피하십시오. 분산된 치과 펄프의 1밀리리터를 24웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 옮기. 접시를 인큐베이터에 섭씨 37도에 놓습니다.그리고 세포가 미디어를 변경하기 전에 48 시간 동안 분산되지 않은 조직에서 부착하고 마이그레이션할 수 있도록 합니다. 안락사 및 피부 제거 후, 두개골의 기지에 마이크로 해부 가위의 쌍의 끝을 삽입합니다. 두개골의 처진 봉합사를 따라 잘라.두개골 기슭의 양두엽 봉합사를 따라 갈 때까지 귀에 의해 관상 봉합사를 따라 네 개의 작은 수평 컷을 만듭니다. 이렇게 하면 두 개의 골격 플랩이 생성됩니다. 집게를 사용하여 뼈의 두 플랩을 벗겨 뇌를 드러냅니다.상악 과정의 뇌와 뼈 사이의 두라 마터에 보관 된 삼차 중추를 찾습니다. 눈에 여행 세 가지, 맥아, 그리고 하악. 그리고 직선 가장자리 미세 집게를 사용하여 얼음 에 접시에 차가운 1X PBS에 간질을 전송합니다.모든 삼차 번들이 수확되면 살균 필터 콜라게나아제 타입 II.Vortex의 밀리리터 당 5밀리그램을 포함하는 50 밀리리터 원추형 튜브로 간리아를 전송하고 25~30분 동안 37도의 섭씨 수조에 튜브를 배치한다. 5~10분마다 수조, 소용돌이에서 튜브를 꺼내 목욕으로 돌아갑니다. 콜라게나제 삼차 뉴런 용액을 643xg에서 2분 동안 원심분리합니다.조직 배양 후드 아래, 부드럽게 마이크로 파이프와 콜라게나아아제를 흡인하고 1 % 멸균 여과 트립신 유형 II의 5 밀리리터를 추가.다음 25 ~ 30 분 동안 37도 섭씨 수조에 튜브를 배치하고이 시간 프레임 소용돌이 5 분마다 간략하게 튜브소용돌이. 나머지 트립신을 비활성화하기 위해 미디어에 트립신의 일대일 비율로 미디어를 추가합니다. 세포의 수를 계산하고 미디어에서 밀리리터 당 200, 000 세포로 혼합물을 희석시.코팅된 트랜스웰 필터를 치과 펄프로 우물에 넣습니다. 파이프 250 마이크로리터를 트랜스웰 필터에 대고 하룻밤 사이에 섭씨 37도에서 세포를 배양한다. 다음 날, 미디어를 1개의 마이크로몰러 uridine과 15 마이크로몰러 5-플루오로-2'deoxyuridine로 보충된 공동 배양 매체의 1밀리리터로 대체하여 중성염 의 성장을 방지할 수 있는 중간엽 세포의 과잉 증식을 중단합니다.당신은 둘째 날에 미토틱 억제제를 추가해야하거나 중성성 성장이 발생하지 않습니다. 이 연구에서는, 삼차 중성염 단배의 대조에 비해 기본 치과 펄프 세포의 존재에서 증가되었다. TGF-베타 수용체로부터 분리된 1차 세포 2 플로스/플록스 마우스는 아데-Cre-GFP 또는 아데-eGFP의 주사 후 수에 동등하였다.반정량 PCR은 아데노바이러스-Cre-GFP가 대조바이러스-eGFP를 대조바이러스-eGFP로 변형시키는 측면 유전자를 삭제하여 대조바이러스-eGFP가 대조바이러스 벡터로 작용한다는 것을 보여준다. 성장인자 베타 수용체 2 를 변화시키는 배양에서, 중성염 의 성장은 감소하였다. 세포 인구의 결정 보라색 염색 후 트랜스웰 필터의 밝은 필드 이미징은 큰 모공이 널리 퍼져 있음을 보여줍니다.큰 화살표는 중간 엽 형태를 가진 세포를 지적하는 반면 작은 화살표는 신경 형태세포를 가리킵니다. 크리스탈 바이올렛은 바이어스없이 두 세포를 염색했습니다. 또한, 알렉사 488 이차 항체를 가진 베타-III 튜불린의 면역불광 염색은 다중 세포의 비특이적 염색을 나타내어 포렌티드 구조의 이미징을 어렵게 만드는 다중 세포의 비특이적 염색을 보여준다.치과 펄프 세포나 삼차 뉴런이 쉽게 분산되지 않으므로 각 연구원은 도금 절차를 최적화해야합니다. 별도의 우물에서 치과 펄프 세포를 배양하는 경우 면역 형광을 사용하거나 RNA 또는 단백질 수준을 정량화하여 치과 펄프 세포가 뉴런에 어떻게 반응하는지 결정할 수 있습니다. 아데노바이러스와 접촉하는 용기나 팁을 표백하는 것을 기억하십시오.날카로운 쓰레기통에 면도기를 제대로 버리십시오.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

공동 문화 시스템에 신경 연결의 형성을 평가하기위한 Optogenetic 접근

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

연구

발생학

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

생성 CRISPR은 / Cas9 중재 Monoallelic 삭제할 경우는 마우스 배아 줄기 세포의 증강 기능을 연구하는

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

Using Touch-evoked Response and Locomotion Assays to Assess Muscle Performance and Function in Zebrafish

터치 유발 대응 및 로코 분석 실험을 사용하여 Zebrafish의 근육의 성능 및 기능을 평가하기 위해

Zebrafish muscle development is highly conserved with mammalian systems making them an excellent model to study muscle function and disease. Many ...

Application of Impermeable Barriers Combined with Candidate Factor Soaked Beads to Study Inductive Signals in the Chick

후보 인자 젖 구슬과 결합하여 불 침투성 장벽의 응용 프로그램은 병아리에서 유도 신호를 공부하기

The chick embryo provides a superb vertebrate model that can be used to dissect developmental questions in a direct way. Its accessibility and robustness ...

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

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대동맥 반지 공동 문화 분석 결과: Mesenchymal Stromal 세포에 생체 외에서 의 신생 잠재력을 평가 하는 편리한 도구

Angiogenesis is a complex, highly regulated process responsible for providing and maintaining adequate tissue perfusion. Insufficient vasculature ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

Organotypic 문화 메서드 배아 치킨 조직 개발 연구를

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Vivo에서 하는 방법 마우스 혈액 고환 방 벽 완전성을 공부

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...

Isolation, Propagation, and Prion Protein Expression During Neuronal Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells

절연, 전파, 그리고 인간의 치과 펄프의 줄기 세포의 신경 분화 동안 프리온 단백질 표정

Bioethical issues related to the manipulation of embryonic stem cells have hindered advances in the field of medical research. For this reason, it is very ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

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자외선-C (UV-C) 손상에 응하여 1 차 마우스 안구 표면 세포/줄기 세포에 있는 산화 손상의 평가

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

An Enhanced Green Fluorescence Protein-based Assay for Studying Neurite Outgrowth in Primary Neurons

1 차적인 뉴런에 있는 Neurite 파생을 공부를 위한 향상된 녹색 형광 단백질 기지를 둔 분석

Neurite outgrowth is a fundamental event in the formation of the neural circuits during nervous system development. Severe neurite damage and synaptic ...