Name: a co-culture method to study neurite outgrowth in response to dental pulp paracrine signals
Uploaded: 2020-02-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Co-Culture Method to Study Neurite Outgrowth in Response to Dental Pulp Paracrine Signals at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av a) National Institutes of Health / NIAMS (tilskuddsnummer R01 AR062507 og R01 AR053860 til RS), b) University of Alabama ved Birmingham Dental Academic Research Training (DART) stipend (nummer T90DE022736 (PI MacDougall)) til SBP fra National Institute of Dental og Craniofacial Research / National Institutes of Health, c) en UAB Global Center for Craniofacial, Oral and Dental Disorders (GC-CODED) Pilot og mulighet tilskudd til SBP og d) National Institute of Dental og Craniofacial Forskning/Nasjonale institutter for helse K99 DE024406 tilskudd til SBP.

Alle eksperimenter med mus ble godkjent av UAB Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Plate forberedelse
MERK: Coverslips kan brukes til å bilde DP-celler på slutten av analysen. Pass på at platelokket er på under alle inkubasjons- og sinsingtrinn utenfor den sterile vevskulturhetten for å forhindre kontaminering under prøvebehandling.
<ol><li>
Tilberedning av dekkslip
	<ol>
<li>Autoklav sirkulære dekkslips.</li>
		<li>Filt...

<ol>
	<li>Moe, K., Sijaona, A., Shrestha, A., Kettunen, P., Taniguchi, M., Luukko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semaphorin+3A+controls+timing+and+patterning+of+the+dental+pulp+innervation.">Semaphorin 3A controls timing and patterning of the dental pulp innervation.</a> Differentiation. 84 (5), 371-379 (2012).</li><li>Kollar, E. J., Lumsden, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tooth+morphogenesis:+the+role+of+the+innervation+during+induction+and+pattern+formation.">Tooth morphogenesis: the role of the innervation during induction and pattern formation.</a> Journal de biologie buccale. 7 (1), 49-60 (1979).</li><li>Lillesaar, C., Fried, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurites+from+trigeminal+ganglion+explants+grown+in+vitro+are+repelled+or+attracted+by+tooth-related+tissues+depending+on+developmental+stage.">Neurites from trigeminal ganglion explants grown in vitro are repelled or attracted by tooth-related tissues depending on developmental stage.</a> Neuroscience. 125 (1), 149-161 (2004).</li><li>Fried, K., Lillesaar, C., Sime, W., Kaukua, N., Patarroyo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+finding+of+pain+nerve+fibers:+Neural+growth+mechanisms+in+the+tooth+pulp.">Target finding of pain nerve fibers: Neural growth mechanisms in the tooth pulp.</a> Physiology &amp; Behavior. 92 (1-2), 40-45 (2007).</li><li>Pagella, P., Jim&#233;nez-Rojo, L., Mitsiadis, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+innervation+in+developing+and+regenerating+orofacial+tissues.">Roles of innervation in developing and regenerating orofacial tissues.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (12), 2241-2251 (2014).</li><li>Luukko, K., Kettunen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+tooth+morphogenesis+and+innervation+by+local+tissue+interactions,+signaling+networks,+and+semaphorin+3A.">Integration of tooth morphogenesis and innervation by local tissue interactions, signaling networks, and semaphorin 3A.</a> Cell Adhesion &amp; Migration. , 1-9 (2016).</li><li>Smit, M., Leng, J., Klemke, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+for+neurite+outgrowth+quantification.">Assay for neurite outgrowth quantification.</a> BioTechniques. 35 (2), 254-256 (2003).</li><li>de Almeida, J. F. A., Chen, P., Henry, M. A., Diogenes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+of+the+apical+papilla+regulate+trigeminal+neurite+outgrowth+and+targeting+through+a+BDNF-dependent+mechanism.">Stem cells of the apical papilla regulate trigeminal neurite outgrowth and targeting through a BDNF-dependent mechanism.</a> Tissue engineering. Part A. 20 (23-24), 3089-3100 (2014).</li><li>Pagella, P., Miran, S., Mitsiadis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Developing+Tooth+Germ+Innervation+Using+Microfluidic+Co-culture+Devices.">Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices.</a> Journal of Visualized Experiments. (102), e53114 (2015).</li><li>Coelen, R. J., Jose, D. G., May, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+hexadimethrine+bromide+(polybrene)+on+the+infection+of+the+primate+retroviruses+SSV+1/SSAV+1+and+BaEV.">The effect of hexadimethrine bromide (polybrene) on the infection of the primate retroviruses SSV 1/SSAV 1 and BaEV.</a> Archives of Virology. 75 (4), 307-311 (1983).</li><li>Caroni, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+growth-associated+proteins+in+the+neurons+of+adult+transgenic+mice.">Overexpression of growth-associated proteins in the neurons of adult transgenic mice.</a> Journal of neuroscience methods. 71 (1), 3-9 (1997).</li><li>Ali&#263;, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+from+mouse+strain+Thy1+YFP-16+are+a+valuable+tool+to+monitor+and+evaluate+neuronal+differentiation+and+morphology.">Neural stem cells from mouse strain Thy1 YFP-16 are a valuable tool to monitor and evaluate neuronal differentiation and morphology.</a> Neuroscience Letters. 634, 32-41 (2016).</li><li>Howroyd, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+the+Trigeminal+Ganglion+of+Nonrodent+Species+Used+in+Toxicology+Studies.">Dissection of the Trigeminal Ganglion of Nonrodent Species Used in Toxicology Studies.</a> Toxicologic Pathology. , (2019).</li><li>Schwieger, J., Esser, K. H., Lenarz, T., Scheper, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+long-term+spiral+ganglion+neuron+culture+with+reduced+glial+cell+number:+Effects+of+AraC+on+cell+composition+and+neurons.">Establishment of a long-term spiral ganglion neuron culture with reduced glial cell number: Effects of AraC on cell composition and neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 268, 106-116 (2016).</li><li>Liu, R., Lin, G., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Efficient+Method+for+Dorsal+Root+Ganglia+Neurons+Purification+with+a+One-Time+Anti-Mitotic+Reagent+Treatment.">An Efficient Method for Dorsal Root Ganglia Neurons Purification with a One-Time Anti-Mitotic Reagent Treatment.</a> PLoS ONE. 8 (4), 60558 (2013).</li><li>Burry, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimitotic+drugs+that+enhance+neuronal+survival+in+olfactory+bulb+cell+cultures.">Antimitotic drugs that enhance neuronal survival in olfactory bulb cell cultures.</a> Brain Research. 261 (2), 261-275 (1983).</li><li>Katzenell, S., Cabrera, J. R., North, B. J., Leib, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+Purification,+and+Culture+of+Primary+Murine+Sensory+Neurons.">Isolation, Purification, and Culture of Primary Murine Sensory Neurons.</a> Methods in molecular biology. 1656, 229-251 (2017).</li><li>Dussor, G. O., Price, T. J., Flores, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+transcription+factor+3+mRNA+is+upregulated+in+primary+cultures+of+trigeminal+ganglion+neurons.">Activating transcription factor 3 mRNA is upregulated in primary cultures of trigeminal ganglion neurons.</a> Molecular Brain Research. 118 (1-2), 156-159 (2003).</li><li>Lillesaar, C., Arenas, E., Hildebrand, C., Fried, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+rat+trigeminal+neurones+to+dental+pulp+cells+or+fibroblasts+overexpressing+neurotrophic+factors+in+vitro.">Responses of rat trigeminal neurones to dental pulp cells or fibroblasts overexpressing neurotrophic factors in vitro.</a> Neuroscience. 119 (2), 443-451 (2003).</li><li>Lillesaar, C., Eriksson, C., Fried, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+tooth+pulp+cells+elicit+neurite+growth+from+trigeminal+neurones+and+express+mRNAs+for+neurotrophic+factors+in+vitro.">Rat tooth pulp cells elicit neurite growth from trigeminal neurones and express mRNAs for neurotrophic factors in vitro.</a> Neuroscience Letters. 308 (3), (2001).</li><li>Lillesaar, C., Eriksson, C., Johansson, C. S., Fried, K., Hildebrand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tooth+pulp+tissue+promotes+neurite+outgrowth+from+rat+trigeminal+ganglia+in+vitro.">Tooth pulp tissue promotes neurite outgrowth from rat trigeminal ganglia in vitro.</a> Journal of neurocytology. 28 (8), 663-670 (1999).</li><li>Chmilewsky, F., Ayaz, W., Appiah, J., About, I., Chung, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+Growth+Factor+Secretion+From+Pulp+Fibroblasts+is+Modulated+by+Complement+C5a+Receptor+and+Implied+in+Neurite+Outgrowth.">Nerve Growth Factor Secretion From Pulp Fibroblasts is Modulated by Complement C5a Receptor and Implied in Neurite Outgrowth.</a> Scientific reports. 6, 31799 (2016).</li><li>Pagella, P., Neto, E., Jim&#195;&#169;nez-Rojo, L., Lamghari, M., Mitsiadis, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+co-culture+systems+for+studying+tooth+innervation.">Microfluidics co-culture systems for studying tooth innervation.</a> Frontiers in Physiology. 5, 326 (2014).</li><li>Miura, T., Yokokawa, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+culture+on+a+chip:+Developmental+biology+applications+of+self-organized+capillary+networks+in+microfluidic+devices.">Tissue culture on a chip: Developmental biology applications of self-organized capillary networks in microfluidic devices.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 58 (6), 505-515 (2016).</li></ol>

De daglige aktivitetene i munnhulen krever at tennene føler ytre stimuli og intern betennelse for å tillate riktig bruk og vedlikehold. Begrenset informasjon er imidlertid bare tilgjengelig når det gjelder signalene som driver utviklingsprosessene for tanninervasjon. Denne protokollen gir en metode for å isolere og co-kultur primære DP-celler og TG nevroner for å studere krysskommunikasjon mellom de to populasjonene. Flere variabler ble optimalisert og la åpne ytterligere veier for forskning, som beskrevet nedenfo...

Tanninervation gjør det mulig for tennene å føle trykk, temperatur og betennelse, som alle er avgjørende for bruk og vedlikehold av tannorganet. Unnlatelse av å føle tannsmerter forbundet med tannkaries og traumer fører til sykdomsprogresjon. Dermed er riktig innervering et krav for normal tannvekst, funksjon og omsorg.
Mens de fleste organer er fullt funksjonelle og innervated av fødselstidspunktet, strekker tannutviklingen seg inn i voksenlivet, med tanninervation og mineralisering som forekommer i konsert under postnatale stadier1,2. Interessant, tannmassen (DP) mesenchyme utskiller i utgangspunktet avstøtende signaler under embryogenese for å hindre akson inntreden i det utviklende tannorganet, som senere skifter til sekresjon av tiltrekkende faktorer som tannen nærmer utbrudd3,4. Under postnatale stadier, afferent aksoner fra trigeminus (TG) nerve trenge inn og gjennom tannen rundt dentin deponering begynner (anmeldt i Pagella, P. et al.5). Flere in vivo studier har vist at neuronal-mesenchymal interaksjoner guide tann inervation i mus (anmeldt i Luukko, K. et al.6), men få detaljer om molekylære mekanismer er tilgjengelig.
Celleco-kulturer gir kontrollerte miljøer der etterforskere kan manipulere interaksjoner mellom nevronale og mesenchymale populasjoner. Co-kultur eksperimenter gjør det mulig å dykke dypere inn i signalveiene guiding tann inervation og utvikling. Imidlertid presenterer flere av de konvensjonelle metodene som brukes til å studere celler i co-kultur tekniske utfordringer. For eksempel kan krystallfiolett farging av nøysom utvekst ikke-spesifikt flekker Schwann celler inkludert i TG bunt dispersjoner, og det kan være topper i fargeintensitet med relativt små svar7. Mikrofluidiske kamre tilbyr et attraktivt alternativ, men er betydelig dyrere enn transwell filtre8,9 og bare tillate undersøkelse av nevronale svar på DP sekreter. For å løse disse problemene har vi utviklet en protokoll som gjør det mulig for: a) presis farging og avbildning av TG nøysom tgrowth som svar på DP-sekreter, b) genetisk modifisering av DP-celler og / eller TG nevroner for å undersøke spesifikke signalveier, og c) undersøkelse av DP cellesvar på faktorer utskilt av TG nevroner. Denne protokollen gir muligheten til å undersøke nettopp flere funksjoner av tanninervation i det kontrollerte miljøet til en in vitro co-kultur analyse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-Fluoro-2&#39;-deoxyuridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0503</td>
			<td>Used as a mitotic Inhibitor at 15 &#956;M concentration in co-culture media, Day 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td>Co-culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-546 anti-chicken</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11040</td>
			<td>Secondary to stain neurite outgrowth labeled by anti-GFP antibody, 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP Antibody</td>
			<td>Aves Lab, Inc</td>
			<td>GFP-1010</td>
			<td>Primary antibody to label Thy1-YFP neurons, 1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Neurofilament 200 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NO142</td>
			<td>Monoclonal primary antibody to label neurons, 1:1000 dilution, alternative if YFP mice are not available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6;129- Tgfbr2tm1Karl/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>12603</td>
			<td>Tgfbr2f/f mouse model used for dental pulp cells in optimized protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>3709</td>
			<td>Thy1-YFP mouse model genotype used for trigeminal neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type II</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>234155-100MG</td>
			<td>Used to disperse trigeminal neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437</td>
			<td>Additive to co-culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11413-11</td>
			<td>Fine forceps for TG dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td>Coats the transwell inserts at final concentration of 10 &#956;g/ml, stock solution is assumed at 1.5 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis Buffer (Buffer RLT)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td>Extracts RNA from dental pulp cells post co-culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030081</td>
			<td>Additive to co-culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-dissecting scissors</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3146-1EA</td>
			<td>Dissection scissors to open skull</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-545-81</td>
			<td>Circlular coverslip for optional cell culturing and immunofluorescence processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimal Essential Medium a</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12571063</td>
			<td>Co-culture media base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td>Antibiotic additive to co-culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase Inhibitor</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>04 906 837 001</td>
			<td>Additive to RIPA Buffer for extracting protein from dental pulp cells post co-culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td>Used to aid in dental pulp cell transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7280</td>
			<td>Coverslip coating to aid dental pulp cellular adhesion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitors</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05 892 791 001</td>
			<td>Additive to RIPA Buffer for extracting protein from dental pulp cells post co-culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse/DNAse free eppendorf tubes</td>
			<td>Denville</td>
			<td>C-2172</td>
			<td>Presterilized 1.7 ml tubes for RNA, DNA or protein collection at the end of assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThinCert Cell Culture Insert</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>662631</td>
			<td>Transwell inserts for trigeminal neurons in co-culture assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td>Used fto disperse dental pulp cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Type II</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T-7409</td>
			<td>Used to disperse trigeminal neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11370-40</td>
			<td>Ultra fine forceps for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U3750</td>
			<td>Used as a mitotic Inhibitor at 1 &#956;M concentration in co-culture media, Day 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Filtration System</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCNY00060</td>
			<td>Steriflip disposable filter, 50 &#956;m nylon net filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>110006-15</td>
			<td>Long forceps for tissue transfer to conicals</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a co-culture method to study neurite outgrowth in response to dental pulp paracrine signals

Tanninervation gjør det mulig for tennene å føle trykk, temperatur og betennelse, som alle er avgjørende for bruk og vedlikehold av tannorganet. Uten sensorisk innervering ville daglige muntlige aktiviteter forårsake uopprettelig skade. Til tross for sin betydning, har rollene av innervering i tannutvikling og vedlikehold i stor grad blitt oversett. Flere studier har vist at DP-celler utskiller ekstracellulære matriseproteiner og paracrine signaler for å tiltrekke seg og veilede TG-aksoner inn og gjennom tannen. Imidlertid har få studier gitt detaljert innsikt i kryssforløpet mellom DP mesenchyme og nevronale afferents. For å løse dette gapet i kunnskap har forskere begynt å bruke medkulturer og en rekke teknikker for å undersøke disse interaksjonene. Her demonstrerer vi de mange trinnene som er involvert i å co-culturing primære DP-celler med TG nevroner spredt på en overliggende transwell filter med stor diameter porer for å tillate aksonal vekst gjennom porene. Primære DP-celler med genet av interesse flankert av loxP-nettsteder ble benyttet for å lette gensletting ved hjelp av et Adenovirus-Cre-GFP recombinase-system. Ved hjelp av TG-nevroner fra Thy1-YFP-musen tillatt for presis afferent bildebehandling, med uttrykk godt over bakgrunnsnivåer ved konfokal mikroskopi. DP-svarene kan undersøkes via protein- eller RNA-innsamling og -analyse, eller alternativt gjennom immunfluorescerende flekker av DP-celler belagt på flyttbare glassdekk. Media kan analyseres ved hjelp av teknikker som proteomiske analyser, selv om dette vil kreve albumin uttømming på grunn av tilstedeværelsen av føtal storfe serum i media. Denne protokollen gir en enkel metode som kan manipuleres for å studere morfologiske, genetiske og cytoskeletale responser fra TG-nevroner og DP-celler som svar på det kontrollerte miljøet i en co-kulturanalyse.

Disse resultatene viser at TG nøyritt utvekst ble økt i nærvær av primære DP-celler i den underliggende brønnen sammenlignet med kontroll av TG nøysom monkultur (Figur 2A,C). Det er noen analyse-til-analyse variabilitet i nøysom metriinvekst. Dermed bør en TG nevron monokultur inkluderes i alle analyser som en kontroll for å oppdage basalnivåene av nøyrite utvekst. Primærceller fra Tgfbr2f/f-musen ble brukt i denne protokollen etter infeksjon av Ad-Cr...

Watch this Scientific Journal Video about A Co-Culture Method to Study Neurite Outgrowth in Response to Dental Pulp Paracrine Signals at JoVE.com

A Co-Culture Method to Study Neurite Outgrowth in Response to Dental Pulp Paracrine Signals

Vi beskriver isolasjon, spredning og plating av dental pulp (DP) primære celler med trigeminus (TG) nevroner dyrket på toppen overliggende transwell filtre. Cellulære responser av DP-celler kan analyseres med immunfluorescens eller RNA/ proteinanalyse. Immunofluorescens av nevronale markører med konfokal mikroskopi tillater analyse av nøysome utvekstresponser.

En co-kultur metode for å studere neurite outgrowth som svar på dental pulp paracrine signaler

Tooth innervation allows teeth to sense pressure, temperature and inflammation, all of which are crucial to the use and maintenance of the tooth organ. ...

Denne protokollen gir detaljert oversikt over hvordan å co-kultur dental pulp stamceller med trigeminelle nevroner. Med det kan vi undersøke flere svar drevet av deres crosstalk. Den største fordelen med denne teknikken er evnen til å studere og manipulere enten eller begge cellepopulasjoner og nøyaktig måle resultatene.Denne metoden har direkte relevans for neural forskning og kan gi innsikt i forskning på hvordan dental pulp stamceller reparere nevrale vev skadet av traumatiske hendelser eller nevrodegenerative sykdommer. Det er flere stadier av denne teknikken for å lære, og det kan være vanskelig å holde traktaten av dem alle. Denne protokollen beskriver hvert trinn for å hjelpe til med det.Tannmassen og ganglia er vanskelig å spre og krever ulike virvlende og pipettering. Selv da vil du ikke få full spredning så optimalisering og replikerer vil være nødvendig. Etter euthanization av musen, plasser hodet på disponibel underpad slik at munnen er mot taket og bunnen av nakken er flat på arbeidsflaten.Bruk et barberblad og en sagbevegelse for å skille mandible fra maxilla. Fjern tungen med saks eller tang for å gi enklere tilgang til jekslene. Plasser det åpne hodet i fatet på toppen av en steril gasbindpute og plasser prøven under det disseksjonsmikroskopet.Fjern alveolrbenvevet rundt de første jekslene. Sett tangen inn i alveoleråpningen og erte vevet bort fra tannen mot bukkelen eller den språklige siden av munnen. Samle alle maksillære første jeksler og forsiktig overføre submandibular og maksillære første jeksler til en egen celle kultur rett med 1X PBS på is.Fjern emalje ytre organ rundt utsiden av hver maksillær første molar. Med et sett med tang roterer molaren slik at cusps er nede og den åpne roten eksponeres. Det er en oval åpning på bunnen av tannen og ugjennomsiktig dental pulp vev innkapslet av et tynt lag av dentin og emalje.Bruk spissen av tangen til å løsne forsiktig tannmassen ved å kjøre en arm av tangene rundt den interne omkretsen av det mineraliserte vevet. Fjern tannmassevevet ut av den mineraliserte strukturen og overfør til en tredje tallerken som inneholder 1X PBS. Fjern emalje ytre organ hvis det ikke allerede var skilt.Overfør alt tannmassevev til 0,25% trypsin EDTA i et 50 milliliter konisk rør. Vortex blandingen og legg den i et 37 graders Celsius varmt vannbad i 10 minutter. Under en steril hette, legg oppvarmet co-kultur media til et endelig forhold på minst en-til-en media for å trypsin å inaktivere enzymet.Pipet media opp og ned flere ganger med en 10 milliliter pipet for å ytterligere spre tannmassen i media, unngå store bobler. Overfør en milliliter av den dispergerte tannmassen til hver brønn på 24-brønns vevskulturplate. Legg platen i en inkubator ved 37 grader Celsius.Og la cellene feste og migrere ut fra det uoppgitte vevet i 48 timer før du bytter media. Etter eutanisering og fjerning av huden, sett spissen av et par mikro dissekering saks inn i bunnen av skallen. Skjær langs sagittal sutur av skallen.Lag fire små horisontale kutt til langs de koronale suturene ved ørene til langs lambdoid suturer av bunnen av skallen. Dette skaper to klaffer av bein. Bruk tangen til å skrelle tilbake de to klaffer av bein for å avsløre hjernen.Finn trigeminus ganglia plassert i dura mater mellom hjernen og bein av maksillær prosess. Klipp de tre grenene som reiser til øynene, maksillae og mandible. Og bruk rett kant fine tang for å overføre ganglia til kald 1X PBS i en tallerken på is.Når alle trigeminale bunter er høstet bruke fil tang for å overføre ganglia til 50 milliliter konisk rør som inneholder fem milligram per milliliter sterile filtrert kollagennase type II.Vortex blandingen og plassere røret i 37 grader Celsius vannbad i 25 til 30 minutter. Hvert femte til ti minutter, ta røret ut av vannbadet, virvelen og gå tilbake til badet. Sentrifuge collagenase trigeminus neuron løsning i to minutter ved 643xg.Under en vevskultur hette, forsiktig aspirere collagenase med en mikropipet og legge til fem milliliter av 1% steril filtrert trypsin type II.Deretter plassere røret i en 37 grader Celsius vannbad i 25 til 30 minutter og innen denne tidsrammen vortex røret kort hvert femte minutt. Legg til medier med ett-til-en-forhold mellom trypsin til medier for å deaktivere gjenværende trypsin. Telle antall celler og fortynne blandingen til 200,000 celler per milliliter i media.Plasser belagte transbrønnfiltre i brønner med tannmasse. Pipet 250 mikroliter på transwell filteret og kultur cellene på 37 grader Celsius over natten. Neste dag, erstatte media med en milliliter av co-kultur media supplert med en mikromolar uridin og 15 mikromolar 5-Fluoro-2'deoxyuridine å stoppe over spredning av mesenchymale celler som kan hindre neurite utvekst.Du må legge til mitotiske hemmere på dag to eller neurite vekst vil ikke forekomme. I denne studien ble trigeminus neurittvekst økt i nærvær av primære tannmasseceller i den underliggende brønnen sammenlignet med kontroll av trigeminusnøyrittmonkultur. Primærceller isolert fra TGF-beta reseptor 2 flox/flox musen var tilsvarende i antall etter injeksjoner av enten ade-Cre-GFP eller ade-eGFP.Semi-kvantitativ PCR viser at adenovirus-Cre-GFP slettet flankert genet transformere vekstfaktor betareseptor 2 med adenovirus-eGFP fungerer som en kontroll viral vektor. I kulturer med transformere vekstfaktor betareseptor 2 sletting, neurite utvekst ble redusert. Bright-field imaging av transwell filtre etter krystallfiolett farging av cellepopulasjoner viser at store porer er utbredt.Den store pilen peker ut en celle med mesenchymal morfologi, mens den lille pilen peker på en celle av nevronal morfologi. Krystallfiolett farget begge cellene uten bias. I tillegg viser immunofluorescence farging av beta-III tubulin med en alexa 488 sekundær antistoff ikke-spesifikk farging av flere celler gjør avbildning av afferent strukturer vanskelig.Fordi verken tannmasseceller eller trigeminale nevroner sprer seg lett, må hver forsker optimalisere sine plating prosedyrer. Hvis du dyrker tannmasseceller alene i separate brønner, kan du bruke immunofluorescence, eller du kan kvantifisere RNA eller proteinnivåer for å finne ut hvordan tannmassecellene reagerer på nevronene. Husk å bleke noen beholdere eller tips som kommer i kontakt med adenovirus.Pass på å kaste barberhøvler riktig i en skarp beholder.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

En optogenetic Approach for Assessing Dannelse av nevronkoblinger i en Co-kultur System

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

Generering CRISPR / Cas9 mediert Monoallelic Slett å studere Enhancer funksjon i mus embryonale stamceller

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

Using Touch-evoked Response and Locomotion Assays to Assess Muscle Performance and Function in Zebrafish

Ved hjelp av Touch-fremkalt respons og locomotion Analyser for å vurdere muskel ytelse og funksjon i Sebrafisk

Zebrafish muscle development is highly conserved with mammalian systems making them an excellent model to study muscle function and disease. Many ...

Application of Impermeable Barriers Combined with Candidate Factor Soaked Beads to Study Inductive Signals in the Chick

Bruk av Ugjennomtrengelige Barrierer Kombinert med Kandidat Factor Soaked perler å studere Induksjon Signaler i Chick

The chick embryo provides a superb vertebrate model that can be used to dissect developmental questions in a direct way. Its accessibility and robustness ...

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

Aorta Ring co kultur analysen: Et praktisk verktøy for å vurdere Angiogenic potensialet av Mesenchymal Stromal celler In Vitro

Angiogenesis is a complex, highly regulated process responsible for providing and maintaining adequate tissue perfusion. Insufficient vasculature ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

Organotypic kultur metoden å studere utviklingen av embryonale kylling vev

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

En i Vivo -metode for å studere musen blod-testikkel barriere integritet

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...

Isolation, Propagation, and Prion Protein Expression During Neuronal Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells

Isolasjon, overføring og Prion Protein uttrykk under Neuronal differensiering av menneskelig tannlegekontoret masse stammen celler

Bioethical issues related to the manipulation of embryonic stem cells have hindered advances in the field of medical research. For this reason, it is very ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

Vurdering av oksidativ skade i primær mus okulære overflateceller / stamceller som svar på ultrafiolett-C (UV-C) skade

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

An Enhanced Green Fluorescence Protein-based Assay for Studying Neurite Outgrowth in Primary Neurons

En forbedret Green fluorescens protein-basert analyse for å studere Neurite utvekst i primær neurons

Neurite outgrowth is a fundamental event in the formation of the neural circuits during nervous system development. Severe neurite damage and synaptic ...