Name: a co-culture method to study neurite outgrowth in response to dental pulp paracrine signals
Uploaded: 2020-02-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Co-Culture Method to Study Neurite Outgrowth in Response to Dental Pulp Paracrine Signals at JoVE.com

Эта работа была поддержана а) Национальные институты здравоохранения / NIAMS (грант номера R01 AR062507 и R01 AR053860 в RS), б) Университет Алабамы в Бирмингеме Стоматологическая академическая исследовательская подготовка (DART) грант (номер T90DE022736 (PI MacDougall)) в SBP от Национального института стоматологических и краниоциальных исследований / национального института в) UAB Глобальный центр краниофациальных, устных и стоматологических расстройств (GC-CODED) Пилот и доступность гранта SBP и d) Национальный институт стоматологии и craniofacial Научно-исследовательские/Национальные институты здравоохранения K99 DE024406 грант SBP.

Все эксперименты с мышами были одобрены Институциональным комитетом UAB по уходу за животными и использованию (IACUC).
1. Приготовление плиты
ПРИМЕЧАНИЕ: Обложки могут быть использованы для изображения dP-клеток в конце асссе. Убедитесь, что крышка пластины на вс...

<ol>
	<li>Moe, K., Sijaona, A., Shrestha, A., Kettunen, P., Taniguchi, M., Luukko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semaphorin+3A+controls+timing+and+patterning+of+the+dental+pulp+innervation.">Semaphorin 3A controls timing and patterning of the dental pulp innervation.</a> Differentiation. 84 (5), 371-379 (2012).</li><li>Kollar, E. J., Lumsden, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tooth+morphogenesis:+the+role+of+the+innervation+during+induction+and+pattern+formation.">Tooth morphogenesis: the role of the innervation during induction and pattern formation.</a> Journal de biologie buccale. 7 (1), 49-60 (1979).</li><li>Lillesaar, C., Fried, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurites+from+trigeminal+ganglion+explants+grown+in+vitro+are+repelled+or+attracted+by+tooth-related+tissues+depending+on+developmental+stage.">Neurites from trigeminal ganglion explants grown in vitro are repelled or attracted by tooth-related tissues depending on developmental stage.</a> Neuroscience. 125 (1), 149-161 (2004).</li><li>Fried, K., Lillesaar, C., Sime, W., Kaukua, N., Patarroyo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+finding+of+pain+nerve+fibers:+Neural+growth+mechanisms+in+the+tooth+pulp.">Target finding of pain nerve fibers: Neural growth mechanisms in the tooth pulp.</a> Physiology &amp; Behavior. 92 (1-2), 40-45 (2007).</li><li>Pagella, P., Jim&#233;nez-Rojo, L., Mitsiadis, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+innervation+in+developing+and+regenerating+orofacial+tissues.">Roles of innervation in developing and regenerating orofacial tissues.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (12), 2241-2251 (2014).</li><li>Luukko, K., Kettunen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+tooth+morphogenesis+and+innervation+by+local+tissue+interactions,+signaling+networks,+and+semaphorin+3A.">Integration of tooth morphogenesis and innervation by local tissue interactions, signaling networks, and semaphorin 3A.</a> Cell Adhesion &amp; Migration. , 1-9 (2016).</li><li>Smit, M., Leng, J., Klemke, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+for+neurite+outgrowth+quantification.">Assay for neurite outgrowth quantification.</a> BioTechniques. 35 (2), 254-256 (2003).</li><li>de Almeida, J. F. A., Chen, P., Henry, M. A., Diogenes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+of+the+apical+papilla+regulate+trigeminal+neurite+outgrowth+and+targeting+through+a+BDNF-dependent+mechanism.">Stem cells of the apical papilla regulate trigeminal neurite outgrowth and targeting through a BDNF-dependent mechanism.</a> Tissue engineering. Part A. 20 (23-24), 3089-3100 (2014).</li><li>Pagella, P., Miran, S., Mitsiadis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Developing+Tooth+Germ+Innervation+Using+Microfluidic+Co-culture+Devices.">Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices.</a> Journal of Visualized Experiments. (102), e53114 (2015).</li><li>Coelen, R. J., Jose, D. G., May, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+hexadimethrine+bromide+(polybrene)+on+the+infection+of+the+primate+retroviruses+SSV+1/SSAV+1+and+BaEV.">The effect of hexadimethrine bromide (polybrene) on the infection of the primate retroviruses SSV 1/SSAV 1 and BaEV.</a> Archives of Virology. 75 (4), 307-311 (1983).</li><li>Caroni, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+growth-associated+proteins+in+the+neurons+of+adult+transgenic+mice.">Overexpression of growth-associated proteins in the neurons of adult transgenic mice.</a> Journal of neuroscience methods. 71 (1), 3-9 (1997).</li><li>Ali&#263;, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+from+mouse+strain+Thy1+YFP-16+are+a+valuable+tool+to+monitor+and+evaluate+neuronal+differentiation+and+morphology.">Neural stem cells from mouse strain Thy1 YFP-16 are a valuable tool to monitor and evaluate neuronal differentiation and morphology.</a> Neuroscience Letters. 634, 32-41 (2016).</li><li>Howroyd, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+the+Trigeminal+Ganglion+of+Nonrodent+Species+Used+in+Toxicology+Studies.">Dissection of the Trigeminal Ganglion of Nonrodent Species Used in Toxicology Studies.</a> Toxicologic Pathology. , (2019).</li><li>Schwieger, J., Esser, K. H., Lenarz, T., Scheper, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+long-term+spiral+ganglion+neuron+culture+with+reduced+glial+cell+number:+Effects+of+AraC+on+cell+composition+and+neurons.">Establishment of a long-term spiral ganglion neuron culture with reduced glial cell number: Effects of AraC on cell composition and neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 268, 106-116 (2016).</li><li>Liu, R., Lin, G., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Efficient+Method+for+Dorsal+Root+Ganglia+Neurons+Purification+with+a+One-Time+Anti-Mitotic+Reagent+Treatment.">An Efficient Method for Dorsal Root Ganglia Neurons Purification with a One-Time Anti-Mitotic Reagent Treatment.</a> PLoS ONE. 8 (4), 60558 (2013).</li><li>Burry, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimitotic+drugs+that+enhance+neuronal+survival+in+olfactory+bulb+cell+cultures.">Antimitotic drugs that enhance neuronal survival in olfactory bulb cell cultures.</a> Brain Research. 261 (2), 261-275 (1983).</li><li>Katzenell, S., Cabrera, J. R., North, B. J., Leib, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+Purification,+and+Culture+of+Primary+Murine+Sensory+Neurons.">Isolation, Purification, and Culture of Primary Murine Sensory Neurons.</a> Methods in molecular biology. 1656, 229-251 (2017).</li><li>Dussor, G. O., Price, T. J., Flores, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+transcription+factor+3+mRNA+is+upregulated+in+primary+cultures+of+trigeminal+ganglion+neurons.">Activating transcription factor 3 mRNA is upregulated in primary cultures of trigeminal ganglion neurons.</a> Molecular Brain Research. 118 (1-2), 156-159 (2003).</li><li>Lillesaar, C., Arenas, E., Hildebrand, C., Fried, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+rat+trigeminal+neurones+to+dental+pulp+cells+or+fibroblasts+overexpressing+neurotrophic+factors+in+vitro.">Responses of rat trigeminal neurones to dental pulp cells or fibroblasts overexpressing neurotrophic factors in vitro.</a> Neuroscience. 119 (2), 443-451 (2003).</li><li>Lillesaar, C., Eriksson, C., Fried, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+tooth+pulp+cells+elicit+neurite+growth+from+trigeminal+neurones+and+express+mRNAs+for+neurotrophic+factors+in+vitro.">Rat tooth pulp cells elicit neurite growth from trigeminal neurones and express mRNAs for neurotrophic factors in vitro.</a> Neuroscience Letters. 308 (3), (2001).</li><li>Lillesaar, C., Eriksson, C., Johansson, C. S., Fried, K., Hildebrand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tooth+pulp+tissue+promotes+neurite+outgrowth+from+rat+trigeminal+ganglia+in+vitro.">Tooth pulp tissue promotes neurite outgrowth from rat trigeminal ganglia in vitro.</a> Journal of neurocytology. 28 (8), 663-670 (1999).</li><li>Chmilewsky, F., Ayaz, W., Appiah, J., About, I., Chung, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+Growth+Factor+Secretion+From+Pulp+Fibroblasts+is+Modulated+by+Complement+C5a+Receptor+and+Implied+in+Neurite+Outgrowth.">Nerve Growth Factor Secretion From Pulp Fibroblasts is Modulated by Complement C5a Receptor and Implied in Neurite Outgrowth.</a> Scientific reports. 6, 31799 (2016).</li><li>Pagella, P., Neto, E., Jim&#195;&#169;nez-Rojo, L., Lamghari, M., Mitsiadis, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+co-culture+systems+for+studying+tooth+innervation.">Microfluidics co-culture systems for studying tooth innervation.</a> Frontiers in Physiology. 5, 326 (2014).</li><li>Miura, T., Yokokawa, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+culture+on+a+chip:+Developmental+biology+applications+of+self-organized+capillary+networks+in+microfluidic+devices.">Tissue culture on a chip: Developmental biology applications of self-organized capillary networks in microfluidic devices.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 58 (6), 505-515 (2016).</li></ol>

Ежедневная деятельность полости рта требует, чтобы зубы смысле внешних стимулов и внутреннего воспаления, с тем чтобы обеспечить надлежащее использование и техническое обслуживание. Однако, только ограниченная информация имеющаяся относительно сигналов которые управляют процессам?...

Иннервация зубов позволяет зубам чувствовать давление, температуру и воспаление, все из которых имеют решающее значение для использования и поддержания зубного органа. Неспособность почувствовать боль зубов, связанную с кариесом зубов и травмой, приводит к прогрессированию заболевания. Таким образом, надлежащая иннервация является требованием для нормального роста зубов, функции и ухода.
В то время как большинство органов полностью функциональны и invated к моменту рождения, развитие зубов распространяется на взрослую жизнь, с иннервации зубов и минерализации, происходящих в концерте во время послеродовой стадии1,2. Интересно, что зубная целлюлоза (DP) мезенхим первоначально выделяет репелленты сигналы во время эмбриогенеза, чтобы предотвратить проникновение аксона в развивающийся зубной орган, который позже переходит к секреции привлекательных факторов, как зуб приближается к извержению3,4. Во время послеродовых стадий афферентные аксоны из тройничного (TG) нерва проникают в и по всему зубу во время осаждения дентина начинается (обзор в Pagella, P. et al.5). Несколько исследований in vivo показали, что нейронно-мезенхимальные взаимодействия направляют иннервацию зубов у мышей (рассмотрено в Luukko, K. et al.6),но мало деталей молекулярных механизмов доступны.
Сокультуры клеток обеспечивают контролируемую среду, в которой исследователи могут манипулировать взаимодействиями между нейронными и мезенхимальными популяциями. Эксперименты по совместной культуре позволяют глубже углубиться в сигнальные пути, направляющие иннервацию и развитие зубов. Тем не менее, некоторые из обычных методов, используемых для изучения клеток в совместной культуре представляют технические проблемы. Например, кристально фиолетовое окрашивание невритовых наростов может неспецифически пятно Шванн клетки, включенные в TG рассеивания рассеивания расслоения расслоения, и могут быть пики интенсивности цвета с относительно небольшими ответами7. Микрофлюидные камеры предлагают привлекательный вариант, но значительно дороже, чем трансвелл фильтры8,9 и только позволяют исследования нейрональных реакций на DP выделения. Для решения этих вопросов, мы разработали протокол, который позволяет: а) точное окрашивание и изображение TG неврит рост в ответ на DP выделения, б) генетическая модификация DP клеток и / или TG нейронов для расследования конкретных сигнальных путей, и в) исследование DP клеток ответы на факторы, выделяемые TG нейронов. Этот протокол обеспечивает возможность точно исследовать несколько особенностей иннервации зубов в контролируемой среде анализа совместной культуры in vitro.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-Fluoro-2&#39;-deoxyuridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0503</td>
			<td>Used as a mitotic Inhibitor at 15 &#956;M concentration in co-culture media, Day 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td>Co-culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-546 anti-chicken</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11040</td>
			<td>Secondary to stain neurite outgrowth labeled by anti-GFP antibody, 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP Antibody</td>
			<td>Aves Lab, Inc</td>
			<td>GFP-1010</td>
			<td>Primary antibody to label Thy1-YFP neurons, 1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Neurofilament 200 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NO142</td>
			<td>Monoclonal primary antibody to label neurons, 1:1000 dilution, alternative if YFP mice are not available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6;129- Tgfbr2tm1Karl/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>12603</td>
			<td>Tgfbr2f/f mouse model used for dental pulp cells in optimized protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>3709</td>
			<td>Thy1-YFP mouse model genotype used for trigeminal neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type II</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>234155-100MG</td>
			<td>Used to disperse trigeminal neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437</td>
			<td>Additive to co-culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11413-11</td>
			<td>Fine forceps for TG dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td>Coats the transwell inserts at final concentration of 10 &#956;g/ml, stock solution is assumed at 1.5 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis Buffer (Buffer RLT)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td>Extracts RNA from dental pulp cells post co-culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030081</td>
			<td>Additive to co-culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-dissecting scissors</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3146-1EA</td>
			<td>Dissection scissors to open skull</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-545-81</td>
			<td>Circlular coverslip for optional cell culturing and immunofluorescence processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimal Essential Medium a</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12571063</td>
			<td>Co-culture media base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td>Antibiotic additive to co-culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase Inhibitor</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>04 906 837 001</td>
			<td>Additive to RIPA Buffer for extracting protein from dental pulp cells post co-culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td>Used to aid in dental pulp cell transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7280</td>
			<td>Coverslip coating to aid dental pulp cellular adhesion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitors</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05 892 791 001</td>
			<td>Additive to RIPA Buffer for extracting protein from dental pulp cells post co-culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse/DNAse free eppendorf tubes</td>
			<td>Denville</td>
			<td>C-2172</td>
			<td>Presterilized 1.7 ml tubes for RNA, DNA or protein collection at the end of assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThinCert Cell Culture Insert</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>662631</td>
			<td>Transwell inserts for trigeminal neurons in co-culture assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td>Used fto disperse dental pulp cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Type II</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T-7409</td>
			<td>Used to disperse trigeminal neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11370-40</td>
			<td>Ultra fine forceps for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U3750</td>
			<td>Used as a mitotic Inhibitor at 1 &#956;M concentration in co-culture media, Day 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Filtration System</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCNY00060</td>
			<td>Steriflip disposable filter, 50 &#956;m nylon net filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>110006-15</td>
			<td>Long forceps for tissue transfer to conicals</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a co-culture method to study neurite outgrowth in response to dental pulp paracrine signals

Иннервация зубов позволяет зубам чувствовать давление, температуру и воспаление, все из которых имеют решающее значение для использования и поддержания зубного органа. Без сенсорной иннервации ежедневная пероральная деятельность нанесет непоправимый ущерб. Несмотря на свою важность, роль иннервации в развитии и обслуживании зубов в значительной степени упускается из виду. Несколько исследований показали, что DP-клетки выделяют внеклеточные матричные белки и паракриновые сигналы для привлечения и руководства Аксонами TG в и по всему зубу. Тем не менее, несколько исследований предоставили детальное представление о перекрестном разговоре между мезенхимом DP и нейрональными афферентами. Для устранения этого пробела в знаниях исследователи начали использовать сокультуры и различные методы для изучения этих взаимодействий. Здесь мы демонстрируем несколько шагов, участвующих в сокультивации первичных клеток ДП с TG нейронов рассеялись на надивной трансвелл фильтр с большим диаметром поры, чтобы аксональный рост через поры. Первичные клетки DP с геном интереса в окружении локс сайтов были использованы для облегчения удаления генов с помощью аденовирусной-Cre-GFP рекомбиназной системы. Использование TG нейронов из мыши Thy1-YFP позволило точное афферентное изображение, с выражением значительно выше фоновых уровней конфокальной микроскопии. Ответы DP могут быть исследованы с помощью сбора и анализа белков или РНК, или же, через иммунофлуоресцентное окрашивание клеток ДП, покрытых съемными стеклянными крышками. Средства массовой информации могут быть проанализированы с помощью таких методов, как протеомный анализ, хотя это потребует истощения альбумина из-за присутствия сыворотки крупного рогатого скота в средствах массовой информации. Этот протокол предоставляет простой метод, которым можно манипулировать для изучения морфологических, генетических и цитоскелетных реакций TG нейронов и клеток ДП в ответ на контролируемую среду совместного культурного исследования.

Эти результаты показывают, что TG neurite рост был увеличен в присутствии первичных клеток DP в основной хорошо по сравнению с контролем TG неврит монокультуры (Рисунок 2A,C). Существует некоторая изменчивость асссея в неврите. Таким образом, монокультура нейронов TG до?...

Watch this Scientific Journal Video about A Co-Culture Method to Study Neurite Outgrowth in Response to Dental Pulp Paracrine Signals at JoVE.com

A Co-Culture Method to Study Neurite Outgrowth in Response to Dental Pulp Paracrine Signals

Мы описываем изоляцию, дисперсию и покрытие зубной пульпы (DP) первичных клеток с тройничных (TG) нейронов культивируется на вершине над трансвелл фильтры. Клеточные реакции клеток ДП можно анализировать с помощью иммунофлюоресценции или АНАЛИЗА РНК/белка. Иммунофлуоресценция нейронных маркеров с конфокальной микроскопией позволяет анализировать реакции невритовых наростов.

Метод совместной культуры для изучения Нейрита Отток аурост в ответ на стоматологические целлюлозы Паракриновые сигналы

Tooth innervation allows teeth to sense pressure, temperature and inflammation, all of which are crucial to the use and maintenance of the tooth organ. ...

Этот протокол содержит подробные наброски того, как совместно культуры зубной пульпы стволовых клеток с тригеминальных нейронов. С его помощью мы можем исследовать несколько ответов, движимых их перекрестным разговором. Основным преимуществом этого метода является способность изучать и манипулировать любой или обеих популяций клеток и точно измерить результаты.Этот метод имеет непосредственное отношение к нейронным исследованиям и может дать представление о том, как стволовые клетки зубной пульпы восстанавливают нервную ткань, поврежденную травматическими событиями или нейродегенеративными заболеваниями. Там в нескольких стадиях этой техники, чтобы узнать, и это может быть трудно сохранить тракта из них всех. В этом протоколе подробно каждый этап, чтобы помочь с этим.Зубной пульпы и ганглиев трудно разогнать и требуют различных вихрей и трубопроводов. Даже тогда вы не получите полную дисперсию, поэтому потребуется оптимизация и репликации. После усыпаемости мыши, поместите голову на одноразовый underpad так, что рот к потолку и основание шеи плоская на рабочей поверхности.Используйте лезвие бритвы и распилив движение, чтобы отделить челюсти от челюсти. Удалите язык ножницами или типсами, чтобы облегчить доступ к молярам. Поместите открытую голову в блюдо на стерильную марлевую площадку и поместите образец под рассеченный микроскоп.Удалите альвеолярную костную ткань, окружающую первые моляры. Вставьте миппы в альвеолярное отверстие и дразнить ткани от зуба к buccle или лингвальной стороне рта. Соберите все челюстно-первые моляры и аккуратно перенесите подчелюстные и челюстно-максилярные первые моляры в отдельное блюдо клеточной культуры с 1X PBS на льду.Удалите эмаль внешнего органа, окружающего снаружи каждого челюстного первого молара. С набором типсов поверните моляр так, чтобы пороги вниз и открытый корень подвергается. На дне зуба есть овальное отверстие и непрозрачная ткань зубной пульпы, инкапсулированная тонким слоем дентина и эмали.Используя кончик типсов, аккуратно ослабьте зубную пульпу, запуская одну руку типсов вокруг внутренней окружности минерализованной ткани. Удалите ткани зубной пульпы из минерализованной структуры и перенесите на третье блюдо, содержащее 1X PBS. Удалите эмаль внешнего органа, если он еще не отделен.Перенесите всю ткань зубной пульпы на 0,25%трипсина EDTA в 50 миллилитровую коническую трубку. Vortex смесь и поместите его в 37 градусов по Цельсию теплой водяной бане в течение 10 минут. Под стерильным капюшоном, добавить нагревается со-культуры средств массовой информации в окончательное соотношение по крайней мере один-к-одному средств массовой информации, чтобы trypsin инактивировать фермент.Pipet средств массовой информации вверх и вниз несколько раз с 10 миллилитров пипетки для дальнейшего разгона зубной пульпы в средствах массовой информации, избежать больших пузырьков. Перенесите один миллилитр рассеянной зубной пульпы в каждую колодец из 24-хорошо ткани культуры пластины. Поместите тарелку в инкубатор при 37 градусах по Цельсию.И позволяют клеткам прикрепляться и мигрировать из недисперсной ткани в течение 48 часов, прежде чем менять средства массовой информации. После усыпления и удаления кожи вставьте кончик пары микро рассечения ножниц в основание черепа. Вырезать вдоль sagittal шва черепа.Сделайте четыре небольших горизонтальных разреза вдоль корональных швов ушами до тех пор, пока вдоль лямбдоида швы основания черепа. Это создает два лоскута кости. Используйте типсы, чтобы очистить два лоскута кости, чтобы выявить мозг.Найдите тригеминальные ганглии, расположенные в матере дуры между мозгом и костью челюстно-челюстного процесса. Отрежьте три ветви, которые путешествуют к глазам, челюсти, и челюсти. И использовать прямой край тонкой типсов для передачи ганглиев холодной 1X PBS в блюдо на льду.После того, как все тригеминальные пучки собирают использовать файл тибры для передачи ганглиев до 50 миллилитров конической трубки, содержащей пять миллиграммов на миллилитр стерильной фильтрованной коллагеназы типа II.Vortex смеси и место трубки в 37 градусов по Цельсию водяной бане в течение 25 до 30 минут. Каждые пять-десять минут, возьмите трубку из водяной ванны, вихрь, и вернуться в ванну. Центрифуга коллагеназы тригеминального нейрона раствор в течение двух минут при 643xg.Под капюшоном культуры ткани, нежно аспирировать коллагеназу с micropipet и добавить пять миллилитров 1%стерильный фильтрованный трипсин типа II.Then поместите трубку в 37 градусов по Цельсию водяной бане в течение 25 до 30 минут и в течение этого периода времени вихрь трубки кратко каждые пять минут. Добавьте средства массовой информации при соотношении трипсина один к одному в средствах массовой информации, чтобы отключить оставшийся трипсин. Подсчитайте количество клеток и разбавьте смесь до 200 000 клеток на миллилитр в средствах массовой информации.Поместите фильтры с покрытием трансвелла в скважины с зубной пульпой. Трубы 250 микролитров на трансуэлл фильтр и культуры клеток на 37 градусов по Цельсию в одночасье. На следующий день, заменить средства массовой информации с одним миллилитр со-культуры средств массовой информации дополняется одним микромолярной уридина и 15 микромоляных 5-Fluoro-2'deoxyuridine, чтобы остановить чрезмерное распространение мезенхимальных клеток, которые могут предотвратить нейрит рост.Вы должны добавить митотические ингибиторы на второй день или нейрит роста не произойдет. В этом исследовании, тригеминальный нейрит рост был увеличен в присутствии первичных клеток зубной целлюлозы в основной хорошо по сравнению с контролем тригеминального нейрита монокультуры. Первичные клетки, изолированные от рецептора TGF-бета 2 flox/flox mouse, были эквивалентны по количеству после инъекций либо ade-Cre-GFP, либо ade-eGFP.Полуколичебный ПЦР демонстрирует, что аденовирус-Cre-GFP удалил фланговый ген, трансформифицивющий бета-рецептор фактора роста 2 с аденовирусом-eGFP, выступающей в качестве контрольного вирусного вектора. В культурах с преобразованием фактора роста бета-рецептора 2 удаление нейрита было уменьшено. Яркие полевые изображения трансвелловых фильтров после кристально фиолетового окрашивания популяций клеток показывают, что преобладают большие поры.Большая стрелка указывает на клетку с мезенхимальной морфологией, в то время как маленькая стрелка указывает на клетку нейрональной морфологии. Кристаллический фиолетовый окрашенных обеих клеток без предвзятости. Кроме того, иммунофторесценция окрашивания бета-III тубулина с alexa 488 вторичных антител показывает неспецифическое окрашивание нескольких клеток делает визуализацию афферентных структур трудно.Поскольку ни клетки зубной пульпы, ни тригеминальные нейроны легко рассеиваются, каждому исследователю необходимо будет оптимизировать свои процедуры покрытия. Если вы культуры стоматологической целлюлозы клетки только в отдельных скважинах вы можете использовать иммунофлюоресценции или вы можете количественно РНК или белковых уровней, чтобы определить, как зубные клетки целлюлозы реагируют на нейроны. Не забудьте отбелить любые контейнеры или советы, которые вступают в контакт с аденовирусом.Будьте уверены, чтобы отказаться от бритв правильно в острый бен.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

Optogenetic подход к оценке Формирование нейронные связи в совместной культуре системы

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

Создание CRISPR / cas9 опосредованного моноаллельной Пропуски для изучения Enhancer Функция в эмбриональных стволовых клетках мышей

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

Using Touch-evoked Response and Locomotion Assays to Assess Muscle Performance and Function in Zebrafish

Использование сенсорного вызванной реакции и локомоции Анализы для оценки производительности мышц и функции в данио рерио

Zebrafish muscle development is highly conserved with mammalian systems making them an excellent model to study muscle function and disease. Many ...

Application of Impermeable Barriers Combined with Candidate Factor Soaked Beads to Study Inductive Signals in the Chick

Применение непроницаемых барьеров в сочетании с Factor кандидат замачивают шариков для изучения индуктивные сигналы в Chick

The chick embryo provides a superb vertebrate model that can be used to dissect developmental questions in a direct way. Its accessibility and robustness ...

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

Assay Сопредседатель культуры аортального кольца: Удобным инструментом для оценки потенциала ангиогенных мезенхимальных стромальных клеток In Vitro

Angiogenesis is a complex, highly regulated process responsible for providing and maintaining adequate tissue perfusion. Insufficient vasculature ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

Культура organotypic метод для изучения развития тканей эмбриона курицы

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

В естественных условиях метод для изучения целостности барьер крови яички мыши

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...

Isolation, Propagation, and Prion Protein Expression During Neuronal Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells

Изоляция, распространения и прионных белков во время нейрональных дифференцировки стволовых клеток человека пульпы зуба

Bioethical issues related to the manipulation of embryonic stem cells have hindered advances in the field of medical research. For this reason, it is very ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

Оценка окислительного повреждения в первичной мыши глазной поверхностных клеток / стволовых клеток в ответ на ультрафиолет-C (UV-C) Ущерб

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

An Enhanced Green Fluorescence Protein-based Assay for Studying Neurite Outgrowth in Primary Neurons

Улучшенный зеленый флуоресценции белка основе Анализ для изучения Neurite Outgrowth в первичных нейронов

Neurite outgrowth is a fundamental event in the formation of the neural circuits during nervous system development. Severe neurite damage and synaptic ...