Name: a co-culture method to study neurite outgrowth in response to dental pulp paracrine signals
Uploaded: 2020-02-14T14:00:00
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Este trabajo fue apoyado por a) la beca National Institutes of Health/NIAMS (números de subvención R01 AR062507 y R01 AR053860 a RS), b) la beca de formación académica dental de la Universidad de Alabama en Birmingham (DART) (número T90DE022736 (PI MacDougall)) al PAS del Instituto Nacional de Investigación Dental y Craneofacial (DART) c) una subvención piloto y de viabilidad del Centro Global de Trastornos Craneofaciales, Orales y Dentales (GC-CODED) de la UAB a la PAS y d) al Instituto Nacional de Trastornos Dentales y Craneofaciales Investigación/Institutos Nacionales de Salud K99 DE024406 a Pas pasión.

Todos los experimentos con ratones fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC, por sus) por sus úDS.
1. Preparación de placas
NOTA: Coverslips se puede utilizar para crear imágenes de celdas DP al final del ensayo. Asegúrese de que la tapa de la placa esté encendida durante todos los pasos de incubación y ensanación fuera de la campana de cultivo de tejido estéril para evitar la contaminación durante el procesamiento de ...

<ol>
	<li>Moe, K., Sijaona, A., Shrestha, A., Kettunen, P., Taniguchi, M., Luukko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semaphorin+3A+controls+timing+and+patterning+of+the+dental+pulp+innervation.">Semaphorin 3A controls timing and patterning of the dental pulp innervation.</a> Differentiation. 84 (5), 371-379 (2012).</li><li>Kollar, E. J., Lumsden, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tooth+morphogenesis:+the+role+of+the+innervation+during+induction+and+pattern+formation.">Tooth morphogenesis: the role of the innervation during induction and pattern formation.</a> Journal de biologie buccale. 7 (1), 49-60 (1979).</li><li>Lillesaar, C., Fried, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurites+from+trigeminal+ganglion+explants+grown+in+vitro+are+repelled+or+attracted+by+tooth-related+tissues+depending+on+developmental+stage.">Neurites from trigeminal ganglion explants grown in vitro are repelled or attracted by tooth-related tissues depending on developmental stage.</a> Neuroscience. 125 (1), 149-161 (2004).</li><li>Fried, K., Lillesaar, C., Sime, W., Kaukua, N., Patarroyo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+finding+of+pain+nerve+fibers:+Neural+growth+mechanisms+in+the+tooth+pulp.">Target finding of pain nerve fibers: Neural growth mechanisms in the tooth pulp.</a> Physiology &amp; Behavior. 92 (1-2), 40-45 (2007).</li><li>Pagella, P., Jim&#233;nez-Rojo, L., Mitsiadis, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+innervation+in+developing+and+regenerating+orofacial+tissues.">Roles of innervation in developing and regenerating orofacial tissues.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (12), 2241-2251 (2014).</li><li>Luukko, K., Kettunen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+tooth+morphogenesis+and+innervation+by+local+tissue+interactions,+signaling+networks,+and+semaphorin+3A.">Integration of tooth morphogenesis and innervation by local tissue interactions, signaling networks, and semaphorin 3A.</a> Cell Adhesion &amp; Migration. , 1-9 (2016).</li><li>Smit, M., Leng, J., Klemke, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+for+neurite+outgrowth+quantification.">Assay for neurite outgrowth quantification.</a> BioTechniques. 35 (2), 254-256 (2003).</li><li>de Almeida, J. F. A., Chen, P., Henry, M. A., Diogenes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+of+the+apical+papilla+regulate+trigeminal+neurite+outgrowth+and+targeting+through+a+BDNF-dependent+mechanism.">Stem cells of the apical papilla regulate trigeminal neurite outgrowth and targeting through a BDNF-dependent mechanism.</a> Tissue engineering. Part A. 20 (23-24), 3089-3100 (2014).</li><li>Pagella, P., Miran, S., Mitsiadis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Developing+Tooth+Germ+Innervation+Using+Microfluidic+Co-culture+Devices.">Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices.</a> Journal of Visualized Experiments. (102), e53114 (2015).</li><li>Coelen, R. J., Jose, D. G., May, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+hexadimethrine+bromide+(polybrene)+on+the+infection+of+the+primate+retroviruses+SSV+1/SSAV+1+and+BaEV.">The effect of hexadimethrine bromide (polybrene) on the infection of the primate retroviruses SSV 1/SSAV 1 and BaEV.</a> Archives of Virology. 75 (4), 307-311 (1983).</li><li>Caroni, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+growth-associated+proteins+in+the+neurons+of+adult+transgenic+mice.">Overexpression of growth-associated proteins in the neurons of adult transgenic mice.</a> Journal of neuroscience methods. 71 (1), 3-9 (1997).</li><li>Ali&#263;, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+from+mouse+strain+Thy1+YFP-16+are+a+valuable+tool+to+monitor+and+evaluate+neuronal+differentiation+and+morphology.">Neural stem cells from mouse strain Thy1 YFP-16 are a valuable tool to monitor and evaluate neuronal differentiation and morphology.</a> Neuroscience Letters. 634, 32-41 (2016).</li><li>Howroyd, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+the+Trigeminal+Ganglion+of+Nonrodent+Species+Used+in+Toxicology+Studies.">Dissection of the Trigeminal Ganglion of Nonrodent Species Used in Toxicology Studies.</a> Toxicologic Pathology. , (2019).</li><li>Schwieger, J., Esser, K. H., Lenarz, T., Scheper, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+long-term+spiral+ganglion+neuron+culture+with+reduced+glial+cell+number:+Effects+of+AraC+on+cell+composition+and+neurons.">Establishment of a long-term spiral ganglion neuron culture with reduced glial cell number: Effects of AraC on cell composition and neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 268, 106-116 (2016).</li><li>Liu, R., Lin, G., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Efficient+Method+for+Dorsal+Root+Ganglia+Neurons+Purification+with+a+One-Time+Anti-Mitotic+Reagent+Treatment.">An Efficient Method for Dorsal Root Ganglia Neurons Purification with a One-Time Anti-Mitotic Reagent Treatment.</a> PLoS ONE. 8 (4), 60558 (2013).</li><li>Burry, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimitotic+drugs+that+enhance+neuronal+survival+in+olfactory+bulb+cell+cultures.">Antimitotic drugs that enhance neuronal survival in olfactory bulb cell cultures.</a> Brain Research. 261 (2), 261-275 (1983).</li><li>Katzenell, S., Cabrera, J. R., North, B. J., Leib, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+Purification,+and+Culture+of+Primary+Murine+Sensory+Neurons.">Isolation, Purification, and Culture of Primary Murine Sensory Neurons.</a> Methods in molecular biology. 1656, 229-251 (2017).</li><li>Dussor, G. O., Price, T. J., Flores, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+transcription+factor+3+mRNA+is+upregulated+in+primary+cultures+of+trigeminal+ganglion+neurons.">Activating transcription factor 3 mRNA is upregulated in primary cultures of trigeminal ganglion neurons.</a> Molecular Brain Research. 118 (1-2), 156-159 (2003).</li><li>Lillesaar, C., Arenas, E., Hildebrand, C., Fried, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+rat+trigeminal+neurones+to+dental+pulp+cells+or+fibroblasts+overexpressing+neurotrophic+factors+in+vitro.">Responses of rat trigeminal neurones to dental pulp cells or fibroblasts overexpressing neurotrophic factors in vitro.</a> Neuroscience. 119 (2), 443-451 (2003).</li><li>Lillesaar, C., Eriksson, C., Fried, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+tooth+pulp+cells+elicit+neurite+growth+from+trigeminal+neurones+and+express+mRNAs+for+neurotrophic+factors+in+vitro.">Rat tooth pulp cells elicit neurite growth from trigeminal neurones and express mRNAs for neurotrophic factors in vitro.</a> Neuroscience Letters. 308 (3), (2001).</li><li>Lillesaar, C., Eriksson, C., Johansson, C. S., Fried, K., Hildebrand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tooth+pulp+tissue+promotes+neurite+outgrowth+from+rat+trigeminal+ganglia+in+vitro.">Tooth pulp tissue promotes neurite outgrowth from rat trigeminal ganglia in vitro.</a> Journal of neurocytology. 28 (8), 663-670 (1999).</li><li>Chmilewsky, F., Ayaz, W., Appiah, J., About, I., Chung, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+Growth+Factor+Secretion+From+Pulp+Fibroblasts+is+Modulated+by+Complement+C5a+Receptor+and+Implied+in+Neurite+Outgrowth.">Nerve Growth Factor Secretion From Pulp Fibroblasts is Modulated by Complement C5a Receptor and Implied in Neurite Outgrowth.</a> Scientific reports. 6, 31799 (2016).</li><li>Pagella, P., Neto, E., Jim&#195;&#169;nez-Rojo, L., Lamghari, M., Mitsiadis, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+co-culture+systems+for+studying+tooth+innervation.">Microfluidics co-culture systems for studying tooth innervation.</a> Frontiers in Physiology. 5, 326 (2014).</li><li>Miura, T., Yokokawa, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+culture+on+a+chip:+Developmental+biology+applications+of+self-organized+capillary+networks+in+microfluidic+devices.">Tissue culture on a chip: Developmental biology applications of self-organized capillary networks in microfluidic devices.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 58 (6), 505-515 (2016).</li></ol>

Las actividades diarias de la cavidad oral requieren que los dientes sienten los estímulos externos y la inflamación interna con el fin de permitir el uso adecuado y el mantenimiento. Sin embargo, sólo se dispone de información limitada con respecto a las señales que impulsan los procesos de desarrollo de la inervación dental. Este protocolo proporciona un método para aislar y co-cultivar células DP primarias y neuronas TG con el fin de estudiar la comunicación cruzada entre las dos poblaciones. Se optimizaron v...

La inervación dental permite que los dientes perciban la presión, la temperatura y la inflamación, todos los cuales son cruciales para el uso y mantenimiento del órgano dental. La falta de detección del dolor dental asociado con la caries dental y el trauma tensias conduce a la progresión de la enfermedad. Por lo tanto, la inervación adecuada es un requisito para el crecimiento normal de los dientes, la función y el cuidado.
Mientras que la mayoría de los órganos son completamente funcionales e inervados en el momento del nacimiento, el desarrollo dental se extiende a la vida adulta, con la inervación dental y la mineralización que se produce en concierto durante las etapas postnatales1,2. Curiosamente, el mesenquimo de pulpa dental (DP) inicialmente secreta señales repelentes durante la embriogénesis para evitar la entrada de axón en el órgano dental en desarrollo, que más tarde se desplaza a la secreción de factores de atracción a medida que el diente se acerca a la erupción3,4. Durante las etapas posnatales, los axones aferentes del nervio trigémino (TG) penetran en y a lo largo del diente alrededor del momento en que comienza la deposición de la dentina (revisado en Pagella, P. et al.5). Varios estudios in vivo han demostrado que las interacciones neuronales-mesenquimales guían la inervación dental en ratones (revisado en Luukko, K. et al.6), pero pocos detalles de los mecanismos moleculares están disponibles.
Los cocultivos celulares proporcionan entornos controlados en los que los investigadores pueden manipular las interacciones entre las poblaciones neuronal y mesenquimales. Los experimentos de cocultivo permiten profundizar en las vías de señalización que guían la inervación y el desarrollo de los dientes. Sin embargo, varios de los métodos convencionales utilizados para estudiar células en cocultivo presentan desafíos técnicos. Por ejemplo, la tinción violeta cristalina del crecimiento de neurita puede manchar no específicamente las células Schwann incluidas en las dispersiones del haz tG, y puede haber picos de intensidad de color con respuestas relativamente pequeñas7. Las cámaras microfluídicas ofrecen una opción atractiva, pero son considerablemente más caras que los filtros transwell8,9 y solo permiten la investigación de las respuestas neuronales a las secreciones del PD. Para abordar estos problemas, hemos desarrollado un protocolo que permite: a) la tinción precisa y la toma de imágenes del crecimiento de neurita TG en respuesta a las secreciones de DP, b) la modificación genética de las células DP y / o neuronas TG para investigar vías de señalización específicas, y c) la investigación de las respuestas celulares DP a los factores secretados por las neuronas TG. Este protocolo proporciona la capacidad de investigar con precisión varias características de la inervación dental en el entorno controlado de un ensayo de cocultivo in vitro.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-Fluoro-2&#39;-deoxyuridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0503</td>
			<td>Used as a mitotic Inhibitor at 15 &#956;M concentration in co-culture media, Day 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td>Co-culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-546 anti-chicken</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11040</td>
			<td>Secondary to stain neurite outgrowth labeled by anti-GFP antibody, 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP Antibody</td>
			<td>Aves Lab, Inc</td>
			<td>GFP-1010</td>
			<td>Primary antibody to label Thy1-YFP neurons, 1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Neurofilament 200 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NO142</td>
			<td>Monoclonal primary antibody to label neurons, 1:1000 dilution, alternative if YFP mice are not available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6;129- Tgfbr2tm1Karl/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>12603</td>
			<td>Tgfbr2f/f mouse model used for dental pulp cells in optimized protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>3709</td>
			<td>Thy1-YFP mouse model genotype used for trigeminal neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type II</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>234155-100MG</td>
			<td>Used to disperse trigeminal neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437</td>
			<td>Additive to co-culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11413-11</td>
			<td>Fine forceps for TG dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td>Coats the transwell inserts at final concentration of 10 &#956;g/ml, stock solution is assumed at 1.5 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis Buffer (Buffer RLT)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td>Extracts RNA from dental pulp cells post co-culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030081</td>
			<td>Additive to co-culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-dissecting scissors</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3146-1EA</td>
			<td>Dissection scissors to open skull</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-545-81</td>
			<td>Circlular coverslip for optional cell culturing and immunofluorescence processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimal Essential Medium a</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12571063</td>
			<td>Co-culture media base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td>Antibiotic additive to co-culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase Inhibitor</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>04 906 837 001</td>
			<td>Additive to RIPA Buffer for extracting protein from dental pulp cells post co-culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td>Used to aid in dental pulp cell transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7280</td>
			<td>Coverslip coating to aid dental pulp cellular adhesion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitors</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05 892 791 001</td>
			<td>Additive to RIPA Buffer for extracting protein from dental pulp cells post co-culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse/DNAse free eppendorf tubes</td>
			<td>Denville</td>
			<td>C-2172</td>
			<td>Presterilized 1.7 ml tubes for RNA, DNA or protein collection at the end of assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThinCert Cell Culture Insert</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>662631</td>
			<td>Transwell inserts for trigeminal neurons in co-culture assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td>Used fto disperse dental pulp cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Type II</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T-7409</td>
			<td>Used to disperse trigeminal neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11370-40</td>
			<td>Ultra fine forceps for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U3750</td>
			<td>Used as a mitotic Inhibitor at 1 &#956;M concentration in co-culture media, Day 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Filtration System</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCNY00060</td>
			<td>Steriflip disposable filter, 50 &#956;m nylon net filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>110006-15</td>
			<td>Long forceps for tissue transfer to conicals</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a co-culture method to study neurite outgrowth in response to dental pulp paracrine signals

La inervación dental permite que los dientes perciban la presión, la temperatura y la inflamación, todos los cuales son cruciales para el uso y mantenimiento del órgano dental. Sin la inervación sensorial, las actividades orales diarias causarían daños irreparables. A pesar de su importancia, los papeles de la inervación en el desarrollo y mantenimiento de los dientes se han pasado por alto en gran medida. Varios estudios han demostrado que las células DP secretan proteínas de matriz extracelular y señales paracrinas para atraer y guiar los axones TG dentro y a lo largo del diente. Sin embargo, pocos estudios han proporcionado información detallada sobre la conversación cruzada entre el mesenquime DP y los afferents neuronales. Para abordar esta brecha en el conocimiento, los investigadores han comenzado a utilizar cocultivos y una variedad de técnicas para investigar estas interacciones. Aquí, demostramos los múltiples pasos involucrados en el co-cultivo de células DP primarias con neuronas TG dispersas en un filtro transwell overlying con poros de gran diámetro para permitir el crecimiento axonal a través de los poros. Las células primarias de DP con el gen de interés flanqueado por sitios loxP se utilizaron para facilitar la eliminación de genes utilizando un sistema de recombinación Adenovirus-Cre-GFP. El uso de neuronas TG del ratón Thy1-YFP permitió imágenes precisas aferentes, con una expresión muy por encima de los niveles de fondo mediante microscopía confocal. Las respuestas DP se pueden investigar a través de la recolección y análisis de proteínas o ARN, o alternativamente, a través de la tinción inmunofluorescente de células DP chapadas en tapas de vidrio extraíbles. Los medios se pueden analizar utilizando técnicas como los análisis proteómicos, aunque esto requerirá agotamiento de la albúmina debido a la presencia de suero bovino fetal en los medios. Este protocolo proporciona un método simple que se puede manipular para estudiar las respuestas morfológicas, genéticas y citoesqueléticas de las neuronas TG y células DP en respuesta al entorno controlado de un ensayo de cocultivo.

Estos resultados muestran que el crecimiento de la neurita TG se incrementó en presencia de células DP primarias en el pozo subyacente en comparación con el control del monocultivo de neurita TG(Figura 2A,C). Hay cierta variabilidad de ensayo a ensayo en el crecimiento de neurita. Por lo tanto, un monocultivo de neurona TG debe incluirse en todos los ensayos como un control para detectar los niveles basales de crecimiento de neurita. Las células primarias del ratón Tgfb...

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A Co-Culture Method to Study Neurite Outgrowth in Response to Dental Pulp Paracrine Signals

Describimos el aislamiento, dispersión y chapado de células primarias de pulpa dental (DP) con neuronas trigéminos (TG) cultivadas sobre filtros transwell. Las respuestas celulares de las células DP se pueden analizar con inmunofluorescencia o análisis de ARN/proteína. La inmunofluorescencia de marcadores neuronales con microscopía confocal permite el análisis de las respuestas de crecimiento de neurita.

Un método de cocultura para estudiar el crecimiento de Neurita en respuesta a las señales de paracrina de pulpa dental

Tooth innervation allows teeth to sense pressure, temperature and inflammation, all of which are crucial to the use and maintenance of the tooth organ. ...

Este protocolo proporciona un esquema detallado de cómo co-cultivar células madre de pulpa dental con neuronas trigéminas. Con él, podemos investigar múltiples respuestas impulsadas por su interferencia. La principal ventaja de esta técnica es la capacidad de estudiar y manipular cualquiera o ambas poblaciones celulares y medir con precisión los resultados.Este método tiene relevancia directa para la investigación neuronal y podría proporcionar información sobre la investigación sobre cómo las células madre de pulpa dental reparan el tejido neural dañado por eventos traumáticos o enfermedades neurodegenerativas. Hay varias etapas de esta técnica para aprender y puede ser difícil mantener el tracto de todos ellos. Este protocolo detalla cada etapa para ayudar con eso.La pulpa dental y los ganglios son difíciles de dispersar y requieren varios vórtices y pipeteos. Incluso entonces no obtendrá una dispersión completa, por lo que se requerirá optimización y réplicas. Después de la eutanasia del ratón, coloque la cabeza en el panel inferior desechable para que la boca esté hacia el techo y la base del cuello sea plana en la superficie de trabajo.Utilice una cuchilla de afeitar y un movimiento de aserrado para separar la mandíbula del maxilar. Retire la lengua con tijeras o fórceps para facilitar el acceso a los molares. Coloque la cabeza abierta en el plato sobre una gasa estéril y coloque la muestra debajo del microscopio de disección.Retire el tejido óseo alveolar que rodea los primeros molares. Inserte los fórceps en la abertura alveolar y burlizar el tejido lejos del diente hacia el buceo o el lado lingual de la boca. Recoger todos los primeros molares maxilares y transferir suavemente los primeros molares submandibulares y maxilares a un plato de cultivo celular separado con 1X PBS en hielo.Retire el órgano exterior del esmalte que rodea el exterior de cada primer molar maxilar. Con un conjunto de fórceps girar el molar para que las cúspides estén abajo y la raíz abierta se exponga. Hay una abertura ovalada en la parte inferior del diente y tejido de pulpa dental opaco encapsulado por una fina capa de dentina y esmalte.Usando la punta de los fórceps, afloje suavemente la pulpa dental ejecutando un brazo de los fórceps alrededor de la circunferencia interna del tejido mineralizado. Retire el tejido de pulpa dental de la estructura mineralizada y transfiera a un tercer plato que contenga 1X PBS. Retire el órgano exterior del esmalte si aún no estaba separado.Transfiera todo el tejido de pulpa dental al 0,25% de la trippsina EDTA en un tubo cónico de 50 mililitros. Vórtice la mezcla y colóquela en un baño de agua tibia de 37 grados Celsius durante 10 minutos. Bajo una capucha estéril, agregue medios de co-cultivo calentados a una proporción final de al menos medios uno a uno para tripina para inactivar la enzima.Pipetee el medio hacia arriba y hacia abajo varias veces con una pipeta de 10 mililitros para dispersar aún más la pulpa dental en los medios, evitar grandes burbujas. Transfiera un mililitro de la pulpa dental dispersa a cada pozo de la placa de cultivo de tejido de 24 pozos. Coloque la placa en una incubadora a 37 grados Celsius.Y permita que las células se adhieran y migren desde el tejido no disperso durante 48 horas antes de cambiar de medio. Después de la eutanasia y la eliminación de la piel, inserte la punta de un par de tijeras micro disección en la base del cráneo. Corte a lo largo de la sutura sagital del cráneo.Haga cuatro pequeños cortes horizontales a lo largo de las suturas coronales por las orejas hasta que a lo largo de las suturas lambdoide de la base del cráneo. Esto crea dos colgajos de hueso. Usa los fórceps para despegar los dos colgajos del hueso para revelar el cerebro.Localice los ganglios trigéminos alojados en la duramadre entre el cerebro y el hueso del proceso maxilar. Corta las tres ramas que viajan a los ojos, maxilares y mandíbulas. Y usa fórceps finos de borde recto para transferir los ganglios a 1X PBS frío en un plato sobre hielo.Una vez que todos los paquetes trigéminales se cosechan utilizan fórceps de archivo para transferir ganglios a tubo cónico de 50 mililitros que contiene cinco miligramos por mililitro de colágeno filtrado estéril tipo II.Vortex la mezcla y colocar el tubo en el baño de agua de 37 grados Celsius durante 25 a 30 minutos. Cada cinco a diez minutos, saque el tubo del baño de agua, el vórtice y vuelva al baño. Centrifugar la solución de neurona trigémino de colagenasa durante dos minutos a 643xg.Bajo una capucha de cultivo de tejido, aspira suavemente la colagenasa con un micropipet y añadir cinco mililitros de 1%estéril de trippsina filtrada tipo II.A continuación, coloque el tubo en un baño de agua de 37 grados Celsius durante 25 a 30 minutos y dentro de este marco de tiempo vórtice el tubo brevemente cada cinco minutos. Agregue medios en una relación uno a uno de tripsina a medios para desactivar la tripina restante. Contar el número de células y diluir la mezcla a 200.000 células por mililitro en medios.Coloque los filtros transposos recubiertos en pozos con pulpa dental. Pipet 250 microlitros en el filtro de transpolío y cultivo de las células en 37 grados Celsius durante la noche. Al día siguiente, reemplace los medios con un mililitro de medios de co-cultivo complementados con una uridina micromolar y 15 micromolares 5-Fluoro-2'desoxiuridina para detener la proliferación excesiva de células mesenquimales que pueden prevenir el crecimiento de neurita.Debe agregar inhibidores mitóticos en el día dos o no se producirá crecimiento de neurita. En este estudio, el crecimiento de la neurita trigéminal se incrementó en presencia de células primarias de pulpa dental en el pozo subyacente en comparación con el control del monocultivo de neurito trigémino. Las células primarias aisladas del ratón de flox/flox del receptor TGF-beta 2 eran equivalentes en número después de las inyecciones de ade-Cre-GFP o ade-eGFP.La PCR semicuantitativa demuestra que el adenovirus-Cre-GFP eliminó el gen flanqueado que transforma el factor de crecimiento beta receptor 2 con adenovirus-eGFP sirviendo como vector viral de control. En las culturas con la transformación del factor de crecimiento beta receptor 2 deleción, el crecimiento de la neurita disminuyó. Las imágenes de campo brillante de los filtros transpojo después de la tinción violeta cristalina de las poblaciones celulares muestran que los poros grandes son frecuentes.La flecha grande señala una célula con morfología mesenquimal mientras que la pequeña flecha apunta a una célula de morfología neuronal. Cristal violeta manchado ambas células sin sesgo. Además, la tinción por inmunofluorescencia de la tubulina beta-III con un anticuerpo secundario alexa 488 muestra la tinción no específica de múltiples células dificultando la toma de imágenes de estructuras aferentes.Debido a que ni las células de pulpa dental ni las neuronas trigéminas se dispersan fácilmente, cada investigador tendrá que optimizar sus procedimientos de chapado. Si cultivas células de pulpa dental solas en pozos separados puedes usar inmunofluorescencia o puedes cuantificar los niveles de ARN o proteína para determinar cómo responden las células de pulpa dental a las neuronas. Recuerde blanquear cualquier recipiente o consejo que entre en contacto con el adenovirus.Asegúrese de desechar las maquinillas de afeitar correctamente en un contenedor afilado.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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Un enfoque optogenética para Evaluar formación de conexiones neuronales en un sistema de co-cultura

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

Investigación

Biología del Desarrollo

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