Name: a co-culture method to study neurite outgrowth in response to dental pulp paracrine signals
Uploaded: 2020-02-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Co-Culture Method to Study Neurite Outgrowth in Response to Dental Pulp Paracrine Signals at JoVE.com

Detta arbete stöddes av a) National Institutes of Health / NIAMS (bidragsnummer R01 AR062507 och R01 AR053860 till RS), b) University of Alabama vid Birmingham Dental Academic Research Training (DART) bidrag (nummer T90DE222736 (PI MacDougall)) till SBP från National Institute of Dental and Craniofacial Research / National Institutes of Health, c) En UAB Global Center for Craniofacial, orala och tandsjukdomar (GC-CODED) Pilot och genomförbarhetsbidrag till SBP och d) National Institute of Dental och Craniofacial Forsknings-/nationella hälsoinstitut K99 DE024406 bevilja sbp.

Alla experiment med möss godkändes av UAB Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Plattberedning
Obs: Omslagsskydd kan användas för att bild DP-celler i slutet av analysen. Se till att plåtlocket är på under all inkubation och sköljsteg utanför den sterila vävnadsodlingshuven för att förhindra kontaminering under provbearbetning.
<ol><li>
Coverslip beredning
	<ol>
<li>Autoklav cirkulära omslagsskydd.</li>
		<li>Filtrer...

<ol>
	<li>Moe, K., Sijaona, A., Shrestha, A., Kettunen, P., Taniguchi, M., Luukko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semaphorin+3A+controls+timing+and+patterning+of+the+dental+pulp+innervation.">Semaphorin 3A controls timing and patterning of the dental pulp innervation.</a> Differentiation. 84 (5), 371-379 (2012).</li><li>Kollar, E. J., Lumsden, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tooth+morphogenesis:+the+role+of+the+innervation+during+induction+and+pattern+formation.">Tooth morphogenesis: the role of the innervation during induction and pattern formation.</a> Journal de biologie buccale. 7 (1), 49-60 (1979).</li><li>Lillesaar, C., Fried, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurites+from+trigeminal+ganglion+explants+grown+in+vitro+are+repelled+or+attracted+by+tooth-related+tissues+depending+on+developmental+stage.">Neurites from trigeminal ganglion explants grown in vitro are repelled or attracted by tooth-related tissues depending on developmental stage.</a> Neuroscience. 125 (1), 149-161 (2004).</li><li>Fried, K., Lillesaar, C., Sime, W., Kaukua, N., Patarroyo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+finding+of+pain+nerve+fibers:+Neural+growth+mechanisms+in+the+tooth+pulp.">Target finding of pain nerve fibers: Neural growth mechanisms in the tooth pulp.</a> Physiology &amp; Behavior. 92 (1-2), 40-45 (2007).</li><li>Pagella, P., Jim&#233;nez-Rojo, L., Mitsiadis, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+innervation+in+developing+and+regenerating+orofacial+tissues.">Roles of innervation in developing and regenerating orofacial tissues.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (12), 2241-2251 (2014).</li><li>Luukko, K., Kettunen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+tooth+morphogenesis+and+innervation+by+local+tissue+interactions,+signaling+networks,+and+semaphorin+3A.">Integration of tooth morphogenesis and innervation by local tissue interactions, signaling networks, and semaphorin 3A.</a> Cell Adhesion &amp; Migration. , 1-9 (2016).</li><li>Smit, M., Leng, J., Klemke, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+for+neurite+outgrowth+quantification.">Assay for neurite outgrowth quantification.</a> BioTechniques. 35 (2), 254-256 (2003).</li><li>de Almeida, J. F. A., Chen, P., Henry, M. A., Diogenes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+of+the+apical+papilla+regulate+trigeminal+neurite+outgrowth+and+targeting+through+a+BDNF-dependent+mechanism.">Stem cells of the apical papilla regulate trigeminal neurite outgrowth and targeting through a BDNF-dependent mechanism.</a> Tissue engineering. Part A. 20 (23-24), 3089-3100 (2014).</li><li>Pagella, P., Miran, S., Mitsiadis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Developing+Tooth+Germ+Innervation+Using+Microfluidic+Co-culture+Devices.">Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices.</a> Journal of Visualized Experiments. (102), e53114 (2015).</li><li>Coelen, R. J., Jose, D. G., May, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+hexadimethrine+bromide+(polybrene)+on+the+infection+of+the+primate+retroviruses+SSV+1/SSAV+1+and+BaEV.">The effect of hexadimethrine bromide (polybrene) on the infection of the primate retroviruses SSV 1/SSAV 1 and BaEV.</a> Archives of Virology. 75 (4), 307-311 (1983).</li><li>Caroni, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+growth-associated+proteins+in+the+neurons+of+adult+transgenic+mice.">Overexpression of growth-associated proteins in the neurons of adult transgenic mice.</a> Journal of neuroscience methods. 71 (1), 3-9 (1997).</li><li>Ali&#263;, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+from+mouse+strain+Thy1+YFP-16+are+a+valuable+tool+to+monitor+and+evaluate+neuronal+differentiation+and+morphology.">Neural stem cells from mouse strain Thy1 YFP-16 are a valuable tool to monitor and evaluate neuronal differentiation and morphology.</a> Neuroscience Letters. 634, 32-41 (2016).</li><li>Howroyd, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+the+Trigeminal+Ganglion+of+Nonrodent+Species+Used+in+Toxicology+Studies.">Dissection of the Trigeminal Ganglion of Nonrodent Species Used in Toxicology Studies.</a> Toxicologic Pathology. , (2019).</li><li>Schwieger, J., Esser, K. H., Lenarz, T., Scheper, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+long-term+spiral+ganglion+neuron+culture+with+reduced+glial+cell+number:+Effects+of+AraC+on+cell+composition+and+neurons.">Establishment of a long-term spiral ganglion neuron culture with reduced glial cell number: Effects of AraC on cell composition and neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 268, 106-116 (2016).</li><li>Liu, R., Lin, G., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Efficient+Method+for+Dorsal+Root+Ganglia+Neurons+Purification+with+a+One-Time+Anti-Mitotic+Reagent+Treatment.">An Efficient Method for Dorsal Root Ganglia Neurons Purification with a One-Time Anti-Mitotic Reagent Treatment.</a> PLoS ONE. 8 (4), 60558 (2013).</li><li>Burry, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimitotic+drugs+that+enhance+neuronal+survival+in+olfactory+bulb+cell+cultures.">Antimitotic drugs that enhance neuronal survival in olfactory bulb cell cultures.</a> Brain Research. 261 (2), 261-275 (1983).</li><li>Katzenell, S., Cabrera, J. R., North, B. J., Leib, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+Purification,+and+Culture+of+Primary+Murine+Sensory+Neurons.">Isolation, Purification, and Culture of Primary Murine Sensory Neurons.</a> Methods in molecular biology. 1656, 229-251 (2017).</li><li>Dussor, G. O., Price, T. J., Flores, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+transcription+factor+3+mRNA+is+upregulated+in+primary+cultures+of+trigeminal+ganglion+neurons.">Activating transcription factor 3 mRNA is upregulated in primary cultures of trigeminal ganglion neurons.</a> Molecular Brain Research. 118 (1-2), 156-159 (2003).</li><li>Lillesaar, C., Arenas, E., Hildebrand, C., Fried, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+rat+trigeminal+neurones+to+dental+pulp+cells+or+fibroblasts+overexpressing+neurotrophic+factors+in+vitro.">Responses of rat trigeminal neurones to dental pulp cells or fibroblasts overexpressing neurotrophic factors in vitro.</a> Neuroscience. 119 (2), 443-451 (2003).</li><li>Lillesaar, C., Eriksson, C., Fried, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+tooth+pulp+cells+elicit+neurite+growth+from+trigeminal+neurones+and+express+mRNAs+for+neurotrophic+factors+in+vitro.">Rat tooth pulp cells elicit neurite growth from trigeminal neurones and express mRNAs for neurotrophic factors in vitro.</a> Neuroscience Letters. 308 (3), (2001).</li><li>Lillesaar, C., Eriksson, C., Johansson, C. S., Fried, K., Hildebrand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tooth+pulp+tissue+promotes+neurite+outgrowth+from+rat+trigeminal+ganglia+in+vitro.">Tooth pulp tissue promotes neurite outgrowth from rat trigeminal ganglia in vitro.</a> Journal of neurocytology. 28 (8), 663-670 (1999).</li><li>Chmilewsky, F., Ayaz, W., Appiah, J., About, I., Chung, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+Growth+Factor+Secretion+From+Pulp+Fibroblasts+is+Modulated+by+Complement+C5a+Receptor+and+Implied+in+Neurite+Outgrowth.">Nerve Growth Factor Secretion From Pulp Fibroblasts is Modulated by Complement C5a Receptor and Implied in Neurite Outgrowth.</a> Scientific reports. 6, 31799 (2016).</li><li>Pagella, P., Neto, E., Jim&#195;&#169;nez-Rojo, L., Lamghari, M., Mitsiadis, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+co-culture+systems+for+studying+tooth+innervation.">Microfluidics co-culture systems for studying tooth innervation.</a> Frontiers in Physiology. 5, 326 (2014).</li><li>Miura, T., Yokokawa, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+culture+on+a+chip:+Developmental+biology+applications+of+self-organized+capillary+networks+in+microfluidic+devices.">Tissue culture on a chip: Developmental biology applications of self-organized capillary networks in microfluidic devices.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 58 (6), 505-515 (2016).</li></ol>

Den dagliga verksamheten i munhålan kräver att tänderna känner yttre stimuli och inre inflammation för att möjliggöra korrekt användning och underhåll. Endast begränsad information finns dock om de signaler som driver de utvecklingsprocesser av tand innervation. Detta protokoll ger en metod för att isolera och samkultur primära DP celler och TG nervceller för att studera tvärkommunikation mellan de två populationerna. Flera variabler optimerades och lämnar öppna ytterligare forskningsvägar, som beskrivs...

Tand innervation tillåter tänder att känna av tryck, temperatur och inflammation, som alla är avgörande för användning och underhåll av tandorganet. Underlåtenhet att känna tandsmärta i samband med karies och trauma leder till sjukdomsprogression. Således är korrekt innervation ett krav för normal tandtillväxt, funktion och vård.
Medan de flesta organ är fullt fungerande och innervated vid tidpunkten för födseln, tandutveckling sträcker sig in i vuxenlivet, med tand innervation och mineralisering förekommer i samförstånd under postnatal stadier1,2. Intressant nog utsöndrar tandmassa (DP) mesenchyme inledningsvis stöter bort vinklingsignaler under embryogenesis för att förhindra axoninträde i det utvecklande tandorganet, som senare skiftar till utsöndringen av attractantfaktorer som tanden närmar sig utbrott3,4. Under postnatal stadier, afferent axons från trigeminal (TG) nerv tränger in i och hela tanden runt tiden dentin nedfall börjar (ses över i Pagella, P. et al.5). Flera in vivo studier har visat att neuronal-mesenchymal interaktioner vägleda tand innervation hos möss (ses över i Luukko, K. et al.6), men få detaljer om de molekylära mekanismerna finns tillgängliga.
Cell co-kulturer ger kontrollerade miljöer där utredarna kan manipulera interaktioner mellan neuronala och mesenchymal populationer. Samkulturexperiment gör det möjligt att gräva djupare in i signalvägarna som styr tandinnervation och utveckling. Flera av de konventionella metoder som används för att studera celler i samkulturen innebär dock tekniska utmaningar. Till exempel, kristall violett färgning av neurite utväxt kan icke-specifikt fläck Schwann celler som ingår i TG bunt spridningar, och det kan finnas toppar i färgintensitet med relativt små svar7. Mikrofluidiska kammare erbjuder ett attraktivt alternativ, men är betydligt dyrare än transwell filter8,9 och bara tillåta undersökning av neuronala svar på DP sekret. För att ta itu med dessa frågor har vi utvecklat ett protokoll som möjliggör: a) exakt färgning och bildbehandling av TG neurite utväxt som svar på DP sekret, b) genetisk modifiering av DP-celler och / eller TG nervceller för att undersöka specifika signalering vägar, och c) undersökning av DP cell svar på faktorer som utsöndras av TG nervceller. Detta protokoll ger möjlighet att exakt undersöka flera funktioner i tand innervation i den kontrollerade miljön i en in vitro samkultur analys.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-Fluoro-2&#39;-deoxyuridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0503</td>
			<td>Used as a mitotic Inhibitor at 15 &#956;M concentration in co-culture media, Day 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td>Co-culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-546 anti-chicken</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11040</td>
			<td>Secondary to stain neurite outgrowth labeled by anti-GFP antibody, 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP Antibody</td>
			<td>Aves Lab, Inc</td>
			<td>GFP-1010</td>
			<td>Primary antibody to label Thy1-YFP neurons, 1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Neurofilament 200 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NO142</td>
			<td>Monoclonal primary antibody to label neurons, 1:1000 dilution, alternative if YFP mice are not available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6;129- Tgfbr2tm1Karl/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>12603</td>
			<td>Tgfbr2f/f mouse model used for dental pulp cells in optimized protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>3709</td>
			<td>Thy1-YFP mouse model genotype used for trigeminal neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type II</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>234155-100MG</td>
			<td>Used to disperse trigeminal neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437</td>
			<td>Additive to co-culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11413-11</td>
			<td>Fine forceps for TG dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td>Coats the transwell inserts at final concentration of 10 &#956;g/ml, stock solution is assumed at 1.5 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis Buffer (Buffer RLT)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td>Extracts RNA from dental pulp cells post co-culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030081</td>
			<td>Additive to co-culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-dissecting scissors</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3146-1EA</td>
			<td>Dissection scissors to open skull</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-545-81</td>
			<td>Circlular coverslip for optional cell culturing and immunofluorescence processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimal Essential Medium a</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12571063</td>
			<td>Co-culture media base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td>Antibiotic additive to co-culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase Inhibitor</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>04 906 837 001</td>
			<td>Additive to RIPA Buffer for extracting protein from dental pulp cells post co-culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td>Used to aid in dental pulp cell transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7280</td>
			<td>Coverslip coating to aid dental pulp cellular adhesion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitors</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05 892 791 001</td>
			<td>Additive to RIPA Buffer for extracting protein from dental pulp cells post co-culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse/DNAse free eppendorf tubes</td>
			<td>Denville</td>
			<td>C-2172</td>
			<td>Presterilized 1.7 ml tubes for RNA, DNA or protein collection at the end of assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThinCert Cell Culture Insert</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>662631</td>
			<td>Transwell inserts for trigeminal neurons in co-culture assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td>Used fto disperse dental pulp cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Type II</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T-7409</td>
			<td>Used to disperse trigeminal neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11370-40</td>
			<td>Ultra fine forceps for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U3750</td>
			<td>Used as a mitotic Inhibitor at 1 &#956;M concentration in co-culture media, Day 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Filtration System</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCNY00060</td>
			<td>Steriflip disposable filter, 50 &#956;m nylon net filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>110006-15</td>
			<td>Long forceps for tissue transfer to conicals</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a co-culture method to study neurite outgrowth in response to dental pulp paracrine signals

Tand innervation tillåter tänder att känna av tryck, temperatur och inflammation, som alla är avgörande för användning och underhåll av tandorganet. Utan sensorisk innervation, dagliga muntliga aktiviteter skulle orsaka irreparabel skada. Trots dess betydelse har rollerna för inre vation i tandutveckling och underhåll till stor del förbisetts. Flera studier har visat att DP-celler utsöndrar extracellulära matrisproteiner och paracrine signaler för att locka och vägleda TG axoner till och i hela tanden. Men få studier har gett detaljerad insikt i tvärsnittet mellan DP mesenchyme och neuronal afferents. För att ta itu med denna klyfta i kunskap, forskare har börjat utnyttja samkulturer och en mängd olika tekniker för att undersöka dessa interaktioner. Här visar vi flera steg som är inblandade i co-odling primära DP celler med TG nervceller spridda på en överliggande transwell filter med stor diameter porer för att möjliggöra axonal tillväxt genom porerna. Primära DP-celler med genav intresse flankerad av loxP platser användes för att underlätta genborttagning med hjälp av en Adenovirus-Cre-GFP rekombinas system. Använda TG nervceller från Thy1-YFP musen tillåtet för exakt afferent imaging, med uttryck långt över bakgrundsnivåer genom konfokal mikroskopi. DP-svaren kan undersökas via protein- eller RNA-insamling och analys, eller alternativt genom immunfluorescerande färgning av DP-celler som pärperats på avtagbara glastäcke. Media kan analyseras med hjälp av tekniker som proteomiska analyser, även om detta kommer att kräva albumin utarmning på grund av förekomsten av fetala nötkreatur serum i media. Detta protokoll ger en enkel metod som kan manipuleras för att studera morfologiska, genetiska och cytoskeletala svar av TG nervceller och DP-celler som svar på den kontrollerade miljön i en samkultur analys.

Dessa resultat visar att TG neurite utväxt ökade i närvaro av primära DP-celler i den underliggande brunnen jämfört med kontrollen av TG neurite monokultur(figur 2A,C). Det finns vissa analys-till-analys variabilitet i neurite utväxt. Således bör en TG neuron monokultur ingå i alla analyser som en kontroll för att upptäcka de basala nivåerna av neurite utväxt. Primära celler från Tgfbr2f/f-musen användes i detta protokoll efter infektion av Ad-Cre...

Watch this Scientific Journal Video about A Co-Culture Method to Study Neurite Outgrowth in Response to Dental Pulp Paracrine Signals at JoVE.com

A Co-Culture Method to Study Neurite Outgrowth in Response to Dental Pulp Paracrine Signals

Vi beskriver isolering, spridning och plätering av tandmassa (DP) primära celler med trigeminal (TG) nervceller odlade ovanpå överliggande transwell filter. Cellulära svar av DP-celler kan analyseras med immunofluorescens eller RNA/proteinanalys. Immunofluorescens av neuronala markörer med konfokal mikroskopi tillåter analys av neurite utväxt svar.

En samkulturmetod för att studera neurite utväxt som svar på dentalmassa paracrine signaler

Tooth innervation allows teeth to sense pressure, temperature and inflammation, all of which are crucial to the use and maintenance of the tooth organ. ...

Detta protokoll ger detaljerade konturerna av hur man samkultur tandläkare massa stamceller med trigeminal nervceller. Med den kan vi undersöka flera svar som drivs av deras överhörning. Den största fördelen med denna teknik är förmågan att studera och manipulera antingen eller båda cellpopulationerna och exakt mäta resultaten.Denna metod har direkt relevans för neural forskning och skulle kunna ge insikt i forskning om hur tandmassa stamceller reparerar neural vävnad skadas av traumatiska händelser eller neurodegenerativa sjukdomar. Det finns flera stadier av denna teknik att lära sig och det kan vara svårt att hålla tarmkanalen av dem alla. Detta protokoll detaljer varje steg för att hjälpa till med det.Tandmassan och ganglierna är svåra att skingra och kräver olika virvel- och pipettering. Även då får du inte full spridning så optimering och replikerar kommer att krävas. Efter avlivning av musen, placera huvudet på engångs underplattan så att munnen är mot taket och basen av halsen är platt på arbetsytan.Använd ett rakblad och en sågrörelse för att skilja underkäken från överkäken. Ta bort tungan med sax eller tröt för att lättare komma åt kindtänderna. Placera det öppna huvudet i skålen ovanpå en steril gasväv pad och placera exemplaret under dissekera mikroskop.Ta bort alveolar benvävnaden som omger de första molarerna. Sätt in tlyktor i alveolära öppningen och reta vävnaden bort från tanden mot buccle eller lingual sidan av munnen. Samla alla maxillär första molarer och försiktigt överföra submandibular och maxillary första molars till en separat cell kultur skålen med 1X PBS på is.Ta bort emalj yttre organ som omger utsidan av varje maxillary första molar. Med en uppsättning av tärna roterar molar så att cusps är nere och den öppna roten exponeras. Det finns en oval öppning på botten av tanden och ogenomskinlig dental massa vävnad inkapslad av ett tunt lager av dentin och emalj.Med hjälp av spets på trikåtor, försiktigt lossa dentala massan genom att köra en arm av tåtan runt den inre omkretsen av den mineraliserade vävnaden. Ta ut den tandmassavävnaden ur den mineraliserade strukturen och överför till en tredje maträtt som innehåller 1X PBS. Ta bort emalj yttre organ om det inte redan separerade.Överför all tandmassavävnad till 0,25%trypsin EDTA i ett koniskt rör på 50 milliliter. Vortex blandningen och placera den i en 37 grader Celsius varmt vattenbad i 10 minuter. Under en steril huva, tillsätt uppvärmda samkultur media till ett slutligt förhållande på minst en-till-en media för att trypsin att inaktivera enzymet.Pipet media upp och ner flera gånger med en 10 milliliter pipet att ytterligare skingra dentala massa i media, undvika stora bubblor. Överför en milliliter av den dispergerade tandmassa till varje brunn av 24-väl vävnad kultur tallrik. Placera plattan i en inkubator på 37 grader Celsius.Och låt cellerna att fästa och migrera ut från den oavdragna vävnaden i 48 timmar innan du byter media. Efter eutanisering och borttagning av hud, sätt in spetsen på ett par mikro dissekera sax i basen av skallen. Skär längs sagittal sutur av skallen.Gör fyra små horisontella nedskärningar till längs korona suturer av öronen tills längs lambdoid suturer av basen av skallen. Detta skapar två klaffar av ben. Använd tärnorna för att skala tillbaka de två flikarna av ben för att avslöja hjärnan.Lokalisera trigeminal ganglierna inrymt i dura mater mellan hjärnan och ben av maxillary process. Skär de tre grenarna som reser till ögonen, överkäken och underkäken. Och använd rak kant fina tång för att överföra ganglier till kalla 1X PBS i en maträtt på is.När alla trigeminal buntar skördas använda fil tlyckor för att överföra ganglier till 50 milliliter koniska röret som innehåller fem milligram per milliliter av sterila filtrerade kollagenas typ II.Vortex blandningen och placera röret i 37 grader Celsius vattenbad i 25 till 30 minuter. Var femte till tionde minut, ta röret ur vattenbadet, virvel, och återgå till badet. Centrifugera kollagenas trigeminal neuron lösning i två minuter vid 643xg.Under en vävnadskultur huva, försiktigt aspirera kollagenas med ett mikropipet och tillsätt fem milliliter av 1%sterila filtrerade trypsin typ II.Sedan placera röret i en 37 grader Celsius vattenbad i 25 till 30 minuter och inom denna tidsram virvel röret kort var femte minut. Lägg till media med ett förhållande mellan trypsin och media för att inaktivera återstående trypsin. Räkna antalet celler och späd blandningen till 200, 000 celler per milliliter i media.Placera belagda transwellfilter i brunnar med tandmassa. Pipet 250 mikroliter på transwellfiltret och odla cellerna i 37 grader Celsius över natten. Nästa dag, ersätta media med en milliliter av samkultur media kompletteras med en mikromolaruridin och 15 mikromolar 5-Fluoro-2'deoxyuridine att stoppa över spridningen av mesenchymala celler som kan förhindra neurit utväxt.Du måste lägga till mitotiska hämmare på dag två eller neurittillväxt kommer inte att inträffa. I denna studie, trigeminal neurit utväxt ökades i närvaro av primära tandläkare massa celler i den underliggande väl jämfört med kontroll av trigeminal neurite monokultur. Primära celler isolerade från TGF-beta-receptorn 2 flox/flox mus var likvärdiga i antal efter injektioner av antingen ade-Cre-GFP eller ade-eGFP.Semi-kvantitativa PCR visar att adenovirus-Cre-GFP bort flankerad gen omvandla tillväxtfaktor beta receptor 2 med adenovirus-eGFP fungerar som en kontroll viral vektor. I de kulturer med omvandla tillväxtfaktor beta receptor 2 borttagning, neurite utväxt minskades. Bright-field imaging av transwell filter efter kristall violett färgning av cellpopulationer visar att stora porer är förhärskande.Den stora pilen pekar ut en cell med mesenchymal morfologi eftersom den små pilen pekar till en cell av neuronal morfologi. Crystal violett färgade båda cellerna utan fördomar. Dessutom visar immunofluorescens färgning av beta-III tubulin med en alexa 488 sekundära antikroppar icke-specifika färgning av flera celler gör bildframställning av afferent strukturer svårt.Eftersom varken tandmassa celler eller trigeminal nervceller skingra lätt, varje forskare kommer att behöva optimera sina plätering förfaranden. Om du kultur dental massa celler ensam i separata brunnar du kan använda immunofluorescens eller du kan kvantifiera RNA eller proteinnivåer för att avgöra hur dentala massa celler svarar på nervceller. Kom ihåg att bleka eventuella behållare eller tips som kommer i kontakt med adenovirus.Var noga med att kasta av rakhyvlar ordentligt i en skarp bin.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

En optogenetic tillvägagångssätt för att bedöma Bildande av neurala anslutningar i en samodlingssystemet

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

Generera crispr / Cas9 medierad monoallel Strykningar att studera Enhancer Funktion i mus embryonala stamceller

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

Using Touch-evoked Response and Locomotion Assays to Assess Muscle Performance and Function in Zebrafish

Användning av anslags-framkallat svar och Locomotion Analyser för att bedöma muskel prestanda och funktion i Zebrafish

Zebrafish muscle development is highly conserved with mammalian systems making them an excellent model to study muscle function and disease. Many ...

Application of Impermeable Barriers Combined with Candidate Factor Soaked Beads to Study Inductive Signals in the Chick

Tillämpning av Ogenomträngliga hinder Kombinerat med kandidat faktor Fuktiga pärlor att studera Induktiva signaler i Chick

The chick embryo provides a superb vertebrate model that can be used to dissect developmental questions in a direct way. Its accessibility and robustness ...

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

Aorta Ring samtidig kultur analysen: Ett bekvämt verktyg för att bedöma angiogena Potential mesenkymala stromaceller In Vitro

Angiogenesis is a complex, highly regulated process responsible for providing and maintaining adequate tissue perfusion. Insufficient vasculature ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

Organotypic kultur metod att studera utvecklingen av embryonala kyckling vävnader

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

En In Vivo -Metod för att studera mus blod-Testis barriär integritet

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...

Isolation, Propagation, and Prion Protein Expression During Neuronal Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells

Isolering, förökning och Prion proteinuttryck under Neuronal differentiering av mänskliga Tandpulpan stamceller

Bioethical issues related to the manipulation of embryonic stem cells have hindered advances in the field of medical research. For this reason, it is very ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

Bedömning av oxidativ skada i de primära musokulära ytcellerna/stamcellerna som svar på ultraviolett-C (UV-C) Skada

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

An Enhanced Green Fluorescence Protein-based Assay for Studying Neurite Outgrowth in Primary Neurons

En förbättrad grön fluorescens proteinbaserad test för att studera Neurite utväxt i primära nervceller

Neurite outgrowth is a fundamental event in the formation of the neural circuits during nervous system development. Severe neurite damage and synaptic ...