Name: a co-culture method to study neurite outgrowth in response to dental pulp paracrine signals
Uploaded: 2020-02-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Co-Culture Method to Study Neurite Outgrowth in Response to Dental Pulp Paracrine Signals at JoVE.com

Bu çalışma a) Ulusal Sağlık Enstitüleri/NIAMS (rs'ye R01 AR062507 ve R01 AR053860, b) Alabama Üniversitesi Birmingham Diş Akademik Araştırma Eğitimi (DART) hibe (sayı T90DE022736 (PI MacDougall)) tarafından Desteklenmiştir. c) Bir UAB Küresel Merkezi Kraniyofasiyal, Ağız ve Diş Bozuklukları (GC-KODLU) Pilot ve Fizibilite hibe SBP ve d) Ulusal Diş ve Kraniyofasiyal Enstitüsü Araştırma / Ulusal Sağlık Enstitüleri K99 DE024406 SBP hibe.

Farelerle yapılan tüm deneyler UAB Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
1. Plaka Hazırlama
NOT: Coverslips, tayın sonundaDP hücrelerini görüntülemek için kullanılabilir. Numune işleme sırasında kontaminasyonu önlemek için steril doku kültürü başlığının dışındaki tüm kuluçka ve durulama basamaklarında plaka kapağının açık olduğundan emin olun.
<ol><li>
Coverslip hazırlama</str...

<ol>
	<li>Moe, K., Sijaona, A., Shrestha, A., Kettunen, P., Taniguchi, M., Luukko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semaphorin+3A+controls+timing+and+patterning+of+the+dental+pulp+innervation.">Semaphorin 3A controls timing and patterning of the dental pulp innervation.</a> Differentiation. 84 (5), 371-379 (2012).</li><li>Kollar, E. J., Lumsden, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tooth+morphogenesis:+the+role+of+the+innervation+during+induction+and+pattern+formation.">Tooth morphogenesis: the role of the innervation during induction and pattern formation.</a> Journal de biologie buccale. 7 (1), 49-60 (1979).</li><li>Lillesaar, C., Fried, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurites+from+trigeminal+ganglion+explants+grown+in+vitro+are+repelled+or+attracted+by+tooth-related+tissues+depending+on+developmental+stage.">Neurites from trigeminal ganglion explants grown in vitro are repelled or attracted by tooth-related tissues depending on developmental stage.</a> Neuroscience. 125 (1), 149-161 (2004).</li><li>Fried, K., Lillesaar, C., Sime, W., Kaukua, N., Patarroyo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+finding+of+pain+nerve+fibers:+Neural+growth+mechanisms+in+the+tooth+pulp.">Target finding of pain nerve fibers: Neural growth mechanisms in the tooth pulp.</a> Physiology &amp; Behavior. 92 (1-2), 40-45 (2007).</li><li>Pagella, P., Jim&#233;nez-Rojo, L., Mitsiadis, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+innervation+in+developing+and+regenerating+orofacial+tissues.">Roles of innervation in developing and regenerating orofacial tissues.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (12), 2241-2251 (2014).</li><li>Luukko, K., Kettunen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+tooth+morphogenesis+and+innervation+by+local+tissue+interactions,+signaling+networks,+and+semaphorin+3A.">Integration of tooth morphogenesis and innervation by local tissue interactions, signaling networks, and semaphorin 3A.</a> Cell Adhesion &amp; Migration. , 1-9 (2016).</li><li>Smit, M., Leng, J., Klemke, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+for+neurite+outgrowth+quantification.">Assay for neurite outgrowth quantification.</a> BioTechniques. 35 (2), 254-256 (2003).</li><li>de Almeida, J. F. A., Chen, P., Henry, M. A., Diogenes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+of+the+apical+papilla+regulate+trigeminal+neurite+outgrowth+and+targeting+through+a+BDNF-dependent+mechanism.">Stem cells of the apical papilla regulate trigeminal neurite outgrowth and targeting through a BDNF-dependent mechanism.</a> Tissue engineering. Part A. 20 (23-24), 3089-3100 (2014).</li><li>Pagella, P., Miran, S., Mitsiadis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Developing+Tooth+Germ+Innervation+Using+Microfluidic+Co-culture+Devices.">Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices.</a> Journal of Visualized Experiments. (102), e53114 (2015).</li><li>Coelen, R. J., Jose, D. G., May, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+hexadimethrine+bromide+(polybrene)+on+the+infection+of+the+primate+retroviruses+SSV+1/SSAV+1+and+BaEV.">The effect of hexadimethrine bromide (polybrene) on the infection of the primate retroviruses SSV 1/SSAV 1 and BaEV.</a> Archives of Virology. 75 (4), 307-311 (1983).</li><li>Caroni, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+growth-associated+proteins+in+the+neurons+of+adult+transgenic+mice.">Overexpression of growth-associated proteins in the neurons of adult transgenic mice.</a> Journal of neuroscience methods. 71 (1), 3-9 (1997).</li><li>Ali&#263;, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+from+mouse+strain+Thy1+YFP-16+are+a+valuable+tool+to+monitor+and+evaluate+neuronal+differentiation+and+morphology.">Neural stem cells from mouse strain Thy1 YFP-16 are a valuable tool to monitor and evaluate neuronal differentiation and morphology.</a> Neuroscience Letters. 634, 32-41 (2016).</li><li>Howroyd, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+the+Trigeminal+Ganglion+of+Nonrodent+Species+Used+in+Toxicology+Studies.">Dissection of the Trigeminal Ganglion of Nonrodent Species Used in Toxicology Studies.</a> Toxicologic Pathology. , (2019).</li><li>Schwieger, J., Esser, K. H., Lenarz, T., Scheper, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+long-term+spiral+ganglion+neuron+culture+with+reduced+glial+cell+number:+Effects+of+AraC+on+cell+composition+and+neurons.">Establishment of a long-term spiral ganglion neuron culture with reduced glial cell number: Effects of AraC on cell composition and neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 268, 106-116 (2016).</li><li>Liu, R., Lin, G., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Efficient+Method+for+Dorsal+Root+Ganglia+Neurons+Purification+with+a+One-Time+Anti-Mitotic+Reagent+Treatment.">An Efficient Method for Dorsal Root Ganglia Neurons Purification with a One-Time Anti-Mitotic Reagent Treatment.</a> PLoS ONE. 8 (4), 60558 (2013).</li><li>Burry, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimitotic+drugs+that+enhance+neuronal+survival+in+olfactory+bulb+cell+cultures.">Antimitotic drugs that enhance neuronal survival in olfactory bulb cell cultures.</a> Brain Research. 261 (2), 261-275 (1983).</li><li>Katzenell, S., Cabrera, J. R., North, B. J., Leib, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+Purification,+and+Culture+of+Primary+Murine+Sensory+Neurons.">Isolation, Purification, and Culture of Primary Murine Sensory Neurons.</a> Methods in molecular biology. 1656, 229-251 (2017).</li><li>Dussor, G. O., Price, T. J., Flores, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+transcription+factor+3+mRNA+is+upregulated+in+primary+cultures+of+trigeminal+ganglion+neurons.">Activating transcription factor 3 mRNA is upregulated in primary cultures of trigeminal ganglion neurons.</a> Molecular Brain Research. 118 (1-2), 156-159 (2003).</li><li>Lillesaar, C., Arenas, E., Hildebrand, C., Fried, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+rat+trigeminal+neurones+to+dental+pulp+cells+or+fibroblasts+overexpressing+neurotrophic+factors+in+vitro.">Responses of rat trigeminal neurones to dental pulp cells or fibroblasts overexpressing neurotrophic factors in vitro.</a> Neuroscience. 119 (2), 443-451 (2003).</li><li>Lillesaar, C., Eriksson, C., Fried, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+tooth+pulp+cells+elicit+neurite+growth+from+trigeminal+neurones+and+express+mRNAs+for+neurotrophic+factors+in+vitro.">Rat tooth pulp cells elicit neurite growth from trigeminal neurones and express mRNAs for neurotrophic factors in vitro.</a> Neuroscience Letters. 308 (3), (2001).</li><li>Lillesaar, C., Eriksson, C., Johansson, C. S., Fried, K., Hildebrand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tooth+pulp+tissue+promotes+neurite+outgrowth+from+rat+trigeminal+ganglia+in+vitro.">Tooth pulp tissue promotes neurite outgrowth from rat trigeminal ganglia in vitro.</a> Journal of neurocytology. 28 (8), 663-670 (1999).</li><li>Chmilewsky, F., Ayaz, W., Appiah, J., About, I., Chung, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+Growth+Factor+Secretion+From+Pulp+Fibroblasts+is+Modulated+by+Complement+C5a+Receptor+and+Implied+in+Neurite+Outgrowth.">Nerve Growth Factor Secretion From Pulp Fibroblasts is Modulated by Complement C5a Receptor and Implied in Neurite Outgrowth.</a> Scientific reports. 6, 31799 (2016).</li><li>Pagella, P., Neto, E., Jim&#195;&#169;nez-Rojo, L., Lamghari, M., Mitsiadis, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+co-culture+systems+for+studying+tooth+innervation.">Microfluidics co-culture systems for studying tooth innervation.</a> Frontiers in Physiology. 5, 326 (2014).</li><li>Miura, T., Yokokawa, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+culture+on+a+chip:+Developmental+biology+applications+of+self-organized+capillary+networks+in+microfluidic+devices.">Tissue culture on a chip: Developmental biology applications of self-organized capillary networks in microfluidic devices.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 58 (6), 505-515 (2016).</li></ol>

Ağız boşluğugünlük faaliyetleri dişlerin uygun kullanım ve bakım izin vermek için dış uyaranları ve iç iltihabı algılamak gerektirir. Ancak, diş innervasyonunun gelişim süreçlerini yönlendiren sinyallerle ilgili sadece sınırlı bilgi mevcuttur. Bu protokol, iki popülasyon arasındaki çapraz iletişimi incelemek için birincil DP hücrelerini ve TG nöronlarını izole etmek ve birlikte kültüre getirmek için bir yöntem sağlar. Çeşitli değişkenler optimize edildi ve aşağıda açıklandı...

Diş innervasyonu dişlerin basınç, sıcaklık ve iltihabı algılamasını sağlar, bunların hepsi diş organının kullanımı ve bakımı için çok önemlidir. Diş çürükleri ve travma ile ilişkili diş ağrısı hissedilmemesi hastalığın ilerlemesine yol açar. Böylece, uygun innervasyon normal diş büyümesi, fonksiyon ve bakım için bir gerekliliktir.
Çoğu organ tamamen işlevsel ve doğum zamanı ile innerve iken, diş gelişimi yetişkin yaşam içine uzanır, diş innervasyonu ve mineralizasyon sonrası aşamalarında meydana gelen ile1,2. İlginçtir, diş hamuru (DP) mezenchyme başlangıçta gelişmekte olan diş organıiçine akson girişini önlemek için embriyogenez sırasında itici sinyalleri salgılar, hangi daha sonra diş patlaması yakın olarak çekici faktörlerin salgısına geçer3,4. Doğum sonrası evrelerde, trigeminal (TG) sinirinden gelen afferent aksonlar, dentin birikiminin başladığı zaman dişin içine ve her zamanına nüfuz eder (Pagella, P. ve ark.5'tegözden geçirilir). Vivo çalışmalarda çeşitli nöronal-mezenkimal etkileşimler farelerde diş innervasyonu kılavuzu göstermiştir (Luukko gözden, K. veark. 6),ama moleküler mekanizmaların birkaç ayrıntı mevcuttur.
Hücre ortak kültürleri, araştırmacıların nöronal ve mezenkimal popülasyonlar arasındaki etkileşimleri manipüle edebildiği kontrollü ortamlar sağlar. Ortak kültür deneyleri, diş innervasyonu ve gelişimine rehberlik eden sinyal yollarının daha derinlerine dalmamayı mümkün kılar. Ancak, ortak kültürdeki hücreleri incelemek için kullanılan geleneksel yöntemlerin bir çoğu teknik zorluklar sunmaktadır. Örneğin, neurite büyüme kristal mor boyama non-özel TG demet dağılımları dahil Schwann hücreleri leke olabilir, ve nispeten küçük tepkiler ile renk yoğunluğu zirveleri olabilir7. Mikroakışkan odaları cazip bir seçenek sunuyoruz, ancak transwellfiltreler 8,9 ve sadece DP salgıları nöronal tepkilerin araştırılmasına izin çok daha pahalıdır. Bu sorunları ele almak için, bir protokol geliştirdik: a) DP salgılarına yanıt olarak TG neurite outgrowth kesin boyama ve görüntüleme, b) DP hücreleri ve / veya TG nöronlar genetik modifikasyonbelirli sinyal yollarını araştırmak için, ve c) TG nöronlar tarafından salgılanan faktörlere DP hücre yanıtlarının araştırılması. Bu protokol, bir in vitro co-kültür testin kontrollü ortamında diş innervasyonunun çeşitli özelliklerini tam olarak araştırma olanağı sağlar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-Fluoro-2&#39;-deoxyuridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0503</td>
			<td>Used as a mitotic Inhibitor at 15 &#956;M concentration in co-culture media, Day 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td>Co-culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-546 anti-chicken</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11040</td>
			<td>Secondary to stain neurite outgrowth labeled by anti-GFP antibody, 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP Antibody</td>
			<td>Aves Lab, Inc</td>
			<td>GFP-1010</td>
			<td>Primary antibody to label Thy1-YFP neurons, 1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Neurofilament 200 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NO142</td>
			<td>Monoclonal primary antibody to label neurons, 1:1000 dilution, alternative if YFP mice are not available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6;129- Tgfbr2tm1Karl/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>12603</td>
			<td>Tgfbr2f/f mouse model used for dental pulp cells in optimized protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>3709</td>
			<td>Thy1-YFP mouse model genotype used for trigeminal neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type II</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>234155-100MG</td>
			<td>Used to disperse trigeminal neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437</td>
			<td>Additive to co-culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11413-11</td>
			<td>Fine forceps for TG dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td>Coats the transwell inserts at final concentration of 10 &#956;g/ml, stock solution is assumed at 1.5 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis Buffer (Buffer RLT)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td>Extracts RNA from dental pulp cells post co-culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030081</td>
			<td>Additive to co-culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-dissecting scissors</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3146-1EA</td>
			<td>Dissection scissors to open skull</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-545-81</td>
			<td>Circlular coverslip for optional cell culturing and immunofluorescence processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimal Essential Medium a</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12571063</td>
			<td>Co-culture media base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td>Antibiotic additive to co-culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase Inhibitor</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>04 906 837 001</td>
			<td>Additive to RIPA Buffer for extracting protein from dental pulp cells post co-culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td>Used to aid in dental pulp cell transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7280</td>
			<td>Coverslip coating to aid dental pulp cellular adhesion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitors</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05 892 791 001</td>
			<td>Additive to RIPA Buffer for extracting protein from dental pulp cells post co-culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse/DNAse free eppendorf tubes</td>
			<td>Denville</td>
			<td>C-2172</td>
			<td>Presterilized 1.7 ml tubes for RNA, DNA or protein collection at the end of assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThinCert Cell Culture Insert</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>662631</td>
			<td>Transwell inserts for trigeminal neurons in co-culture assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td>Used fto disperse dental pulp cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Type II</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T-7409</td>
			<td>Used to disperse trigeminal neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11370-40</td>
			<td>Ultra fine forceps for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U3750</td>
			<td>Used as a mitotic Inhibitor at 1 &#956;M concentration in co-culture media, Day 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Filtration System</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCNY00060</td>
			<td>Steriflip disposable filter, 50 &#956;m nylon net filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>110006-15</td>
			<td>Long forceps for tissue transfer to conicals</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a co-culture method to study neurite outgrowth in response to dental pulp paracrine signals

Diş innervasyonu dişlerin basınç, sıcaklık ve iltihabı algılamasını sağlar, bunların hepsi diş organının kullanımı ve bakımı için çok önemlidir. Duyusal innervasyon olmadan, günlük oral aktiviteler onarılamaz hasara neden olur. Önemine rağmen, diş geliştirme ve bakım innervasyon rolleri büyük ölçüde göz ardı edilmiştir. Çeşitli çalışmalar DP hücrelerinin dişe ve diş boyunca TG aksonları çekmek ve yönlendirmek için hücre dışı matriks proteinleri ve parakrin sinyalleri salgıladığını göstermiştir. Ancak, birkaç çalışma DP mezenchyme ve nöronal afferents arasındaki çapraz konuşma içine ayrıntılı bir fikir sağlamıştır. Bilgideki bu boşluğu gidermek için araştırmacılar bu etkileşimleri araştırmak için ortak kültürleri ve çeşitli tekniklerden yararlanmaya başladılar. Burada, gözenekleri aracılığıyla aksonal büyüme sağlamak için büyük çaplı gözenekleri ile bir üstteki transwell filtre üzerinde dağınık TG nöronlar ile co-culturing birincil DP hücreleri dahil birden fazla adım göstermektedir. Adenovirüs-Cre-GFP rekombinaz sistemi kullanılarak gen delesini kolaylaştırmak için loxP bölgelerinin oluşturduğu ilgi genine sahip primer DP hücreleri kullanılmıştır. Thy1-YFP fareden TG nöronlar kullanarak hassas afferent görüntüleme için izin, konfokal mikroskopi ile arka plan seviyelerinin çok üzerinde ifade ile. DP yanıtları protein veya RNA toplama ve analizi yoluyla veya alternatif olarak çıkarılabilir cam kapaklar üzerine kaplanmış DP hücrelerinin immünofloresan boyama yoluyla araştırılabilir. Medya proteomik analizler gibi teknikler kullanılarak analiz edilebilir, ancak bu medyada fetal sığır serumunun varlığından dolayı albümin tükenmesini gerektirir. Bu protokol, tg nöronlarının ve DP hücrelerinin morfolojik, genetik ve sitosiskeleter yanıtlarını incelemek için manipüle edilebilen basit bir yöntem sağlar.

Bu sonuçlar, TG neurite monokültür kontrolüne göre altta yatan primer DP hücrelerinin varlığında TG neurite outgrowth'un arttığını göstermektedir(Şekil 2A,C). Neurite büyüme bazı tas-to-asa değişkenliği vardır. Böylece, bir TG nöron monokültür nörat büyüme bazal düzeylerini tespit etmek için bir kontrol olarak tüm tahliller dahil edilmelidir. Ad-Cre-GFP enfeksiyonu ve Ad-eGFP enfeksiyonu eşdeğer sayıda hücre olarak doğrulandıktan sonra b...

Watch this Scientific Journal Video about A Co-Culture Method to Study Neurite Outgrowth in Response to Dental Pulp Paracrine Signals at JoVE.com

A Co-Culture Method to Study Neurite Outgrowth in Response to Dental Pulp Paracrine Signals

Biz izolasyon, dağılım ve diş hamuru kaplama (DP) trigeminal ile birincil hücrelerin kaplama (TG) nöronlar üstteki transwell filtreleri üzerinde kültürlü. DP hücrelerinin hücresel yanıtları immünofloresan veya RNA/protein analizi ile analiz edilebilir. Konfokal mikroskopi ile nöronal belirteçlerin immünfloresansi neurite outgrowth yanıtlarının analizine izin verir.

Diş Hamuru Parakrin Sinyalleri yanıt olarak Neurite Outgrowth Çalışma Co-Kültür Yöntemi

Tooth innervation allows teeth to sense pressure, temperature and inflammation, all of which are crucial to the use and maintenance of the tooth organ. ...

Bu protokol trigeminal nöronlar ile birlikte diş hamuru kök hücreleri nasıl co-kültür ayrıntılı anahat sağlar. Bununla, onların çapraz konuşmaları tarafından yönlendirilen birden fazla yanıtı araştırabiliriz. Bu tekniğin en büyük avantajı, hücre popülasyonlarını veya her ikisini de inceleyip manipüle edebilme ve sonuçları tam olarak ölçebilme yeteneğidir.Bu yöntem nöral araştırmalara doğrudan ilgi vardır ve diş posası kök hücrelerinin travmatik olaylar veya nörodejeneratif hastalıklardan zarar gören nöral dokuları nasıl onardığı üzerine araştırmalara ışık verebilir. Bu tekniğin öğrenmesi gereken birkaç aşama vardır ve hepsini uzak tutmak zor olabilir. Bu protokol bu işe yardımcı olmak için her aşamayı ayrıntılarıyla anlatır.Diş hamuru ve ganglia dağıtmak zordur ve çeşitli girdap ve pipetleme gerektirir. O zaman bile optimizasyon ve çoğaltma gerekli olacak bu yüzden tam dağılım almasanız. Farenin ötenazisinden sonra, ağzı tavana doğru ve boyun tabanı çalışma yüzeyinde düz olacak şekilde tek kullanımlık alt lık üzerine baş yerleştirin.Mandibulayı maksilladan ayırmak için jilet ve testere hareketi kullanın. Azı dlarına daha kolay erişim sağlamak için dili makasla veya çömleğiyle çıkarın. Açık başı steril bir gazlı bez yastığının üzerine tabağa yerleştirin ve numuneyi diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin.İlk azı döşeylerini çevreleyen alveoler kemik dokusunu çıkarın. Alveolar açılım içine forceps yerleştirin ve ağız buccle veya lingual tarafına doğru diş uzak doku kızdırmak. Tüm maksiller ilk azı makinelerini toplayın ve submandibular ve maksiller ilk azı makinelerini buz üzerinde 1X PBS ile ayrı bir hücre kültür yemeğine nazikçe aktarın.Her maksiller ilk azı dışında çevreleyen mine dış organ çıkarın. Bir set ile molar döndürün, böylece ponp'lar aşağı ve açık kök açığa çıkar. Dişin alt kısmında oval bir açıklık ve ince bir dentin ve mine tabakası ile kapsüllenmiş opak diş hamuru dokusu var.Forceps ucu kullanarak, yavaşça mineralize doku iç çevresi etrafında forceps bir kol çalıştırarak diş posası gevşetin. Diş posası dokusunu mineralize yapıdan çıkarın ve 1X PBS içeren üçüncü bir tabağa aktarın. Emaye dış organını zaten ayrılmamışsa çıkarın.50 mililitrelik konik tüpte tüm diş posa dokusunu %0.25 tripsin EDTA'ya aktarın. Karışımı girdap ve 10 dakika boyunca 37 derece santigrat derece ılık su banyosu yerleştirin. Steril bir başlık altında, enzim inaktive etmek için trypsin için en az bire bir medya son oranına ısıtılmış co-kültür medya ekleyin.Daha fazla medya diş hamuru dağıtmak için 10 mililitrelik pipet ile medya yukarı ve aşağı birden fazla kez pipet, büyük kabarcıklar kaçının. 24-iyi doku kültür plaka her kuyuya dağınık diş hamuru bir mililitre aktarın. Plakayı 37 derece santigrat derecede bir kuvöze yerleştirin.Ve hücrelerin ortam değiştirmeden önce 48 saat boyunca dağılmayan dokuya takılmasına ve dışarı çıkmasına izin verin. Ötenazi ve deri çıkarıldıktan sonra, kafatası tabanına mikro diseksiyon makas bir çift ucu ekleyin. Kafatasının sagittal sütür boyunca kesilmiş.Kafatası tabanının lambdoid dikişleri boyunca kulakları tarafından koronal dikişboyunca dört küçük yatay kesim olun. Bu iki kemik flebi oluşturur. Beyni ortaya çıkarmak için iki kemik kapağını soymak için püzüler kullanın.Beyin ve maksiller sürecin kemik arasındaki dura mater içinde ev trigeminal ganglia bulun. Gözlere, maksillaya ve çene ye doğru giden üç dalı kesin. Ve buz üzerinde bir tabakta soğuk 1X PBS ganglia aktarmak için düz kenar ince forceps kullanın.Tüm trigeminal demetleri hasat edildikten sonra steril filtreli kollajenaz tip II.Vortex karışımı mililitre başına beş miligram içeren 50 mililitre konik tüp ganglia aktarmak için dosya forseps kullanın ve 25 ila 30 dakika boyunca 37 derece Santigrat su banyosu tüp yerleştirin. Her 5-10 dakikada bir tüpü su banyosundan, girdaptan çıkar ve banyoya geri dön. 643xg iki dakika kollajenaz trigeminal nöron çözeltisi santrifüj.Bir doku kültürü başlık altında, yavaşça bir mikropipet ile kollajenaz aspire ve% 1 steril filtreli tripsin tip II beş mililitre ekleyin.Sonra 25 ila 30 dakika için 37 derece santigrat su banyosu içine tüp yerleştirin ve bu zaman dilimi içinde kısa bir süre her beş dakikada tüp girdap. Kalan trypsin'i devre dışı bırakmak için ortama bire bir tripsin oranında ortam ekleyin. Hücre sayısını sayın ve karışımı medyada mililitre başına 200,000 hücreye seyreltin.Diş hamuru ile kuyular içine kaplı transwell filtreler yerleştirin. Pipet 250 mikrolitre transwell filtre üzerine ve kültür hücreleri 37 derece santigrat bir gecede. Ertesi gün, bir mikromolar uridin ve 15 mikromolar 5-Fluoro-2'deoksiuridine ile takviye co-kültür medya bir mililitre ile medya değiştirin neurit büyümesini önleyebilir mezenkimal hücrelerin aşırı çoğalmasını durdurmak için.İkinci günde mitotik inhibitörler eklemeniz gerekir veya neurite büyüme meydana gelmez. Bu çalışmada, trigeminal nörit monokültür kontrolü ile karşılaştırıldığında altta yatan altta primer diş posa hücrelerinin varlığında trigeminal neurite büyüme artmıştır. TGF-beta reseptör 2 flox/flox fareden izole edilen primer hücreler ade-Cre-GFP veya ade-eGFP enjeksiyonlarından sonra sayıca eşdeğerdi.Yarı kantitatif PCR adenovirüs-Cre-GFP bir kontrol viral vektör olarak hizmet adenovirüs-eGFP ile büyüme faktörü beta reseptör 2 dönüştüren kanatlı gen sildi göstermektedir. Dönüşüm faktörü beta reseptör 2 deletion ile kültürlerde, neurite outgrowth azalmıştır. Hücre popülasyonlarının kristal mor boyamadan sonra transwell filtrelerinin parlak alan görüntülemesi büyük gözeneklerin yaygın olduğunu göstermektedir.Büyük ok mezenkimal morfolojisi olan bir hücreyi işaret ederken, küçük ok nöronal morfolojinin bir hücresini işaret ederken. Kristal menekşe önyargısız her iki hücrelekeli. Buna ek olarak, beta-III tubulin in bir alexa 488 ikincil antikor ile immünofloresan boyama afferent yapıların görüntüleme zor hale birden fazla hücrenonspesifik olmayan boyama gösterir.Ne diş hamuru hücreleri ne de trigeminal nöronlar kolayca dağıtmak için, her araştırmacı kendi kaplama prosedürleri optimize etmek gerekir. Eğer kültür diş hamuru hücreleri tek başına ayrı kuyularda immünoresans kullanabilirsiniz veya diş hamuru hücreleri nöronlara nasıl yanıt olduğunu belirlemek için RNA veya protein düzeylerini ölçebilirsiniz. Adenovirüs ile temas eden kapları veya ipuçlarını beyazlatmaya unutmayın.Keskin bir çöp kutusuna düzgün jilet atmak için emin olun.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

Bir Co-kültür Sistemde nöronal bağlantıları Oluşumunda değerlendirilmesi için bir optogenetic Yaklaşım

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

Yaratma CRISPR / Cas9 aracılığı monoallelik Delesyonlar Fare Embriyonik Kök Hücreleri Artırıcı Fonksiyonu Eğitim için

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

Using Touch-evoked Response and Locomotion Assays to Assess Muscle Performance and Function in Zebrafish

Dokunmatik uyarılmış Yanıt ve Hareket Deneyleri kullanarak Zebra balığı kas Performans ve fonksiyonunu değerlendirmek için

Zebrafish muscle development is highly conserved with mammalian systems making them an excellent model to study muscle function and disease. Many ...

Application of Impermeable Barriers Combined with Candidate Factor Soaked Beads to Study Inductive Signals in the Chick

Aday Faktörü Soaked Boncuk ile birlikte Geçirimsiz Engelleri Uygulama Chick Endüktif Sinyalleri Eğitim için

The chick embryo provides a superb vertebrate model that can be used to dissect developmental questions in a direct way. Its accessibility and robustness ...

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

Aort yüzük ortak kültür tahlil: Mezenkimal Stromal hücre Vitro anjiogenik potansiyelini değerlendirmek için uygun bir araç

Angiogenesis is a complex, highly regulated process responsible for providing and maintaining adequate tissue perfusion. Insufficient vasculature ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

Embriyonik tavuk doku gelişimi çalışmaya Organotypic kültür yöntemi

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Fare kan-Testis bariyeri bütünlük çalışma için In Vivo yöntemi

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...

Isolation, Propagation, and Prion Protein Expression During Neuronal Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells

Yalıtım, yayma ve insan diş Pulp kök hücrelerin Nöronal Farklılaşma sırasında Prion Protein ifade

Bioethical issues related to the manipulation of embryonic stem cells have hindered advances in the field of medical research. For this reason, it is very ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

Ultraviyole-C (UV-C) Hasarına Yanıt Olarak Birincil Fare Oküler Yüzey Hücrelerinde/Kök Hücrelerinde Oksidatif Hasarın Değerlendirilmesi

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

An Enhanced Green Fluorescence Protein-based Assay for Studying Neurite Outgrowth in Primary Neurons

Primer Nöronlarda Neurite Outgrowth Çalışma için Geliştirilmiş Yeşil Floresan Protein Tabanlı Test

Neurite outgrowth is a fundamental event in the formation of the neural circuits during nervous system development. Severe neurite damage and synaptic ...