Name: measuring erythrocyte complement receptor 1 using flow cytometry
Uploaded: 2020-05-19T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Erythrocyte Complement Receptor 1 Using Flow Cytometry at JoVE.com

我们感谢URCACyt、流细胞学技术平台的所有成员、免疫学系的工作人员以及内科和老年病学部的工作人员，他们为优化和验证协议做出了贡献。这项工作由兰斯大学医院资助（赠款号AOL11UF9156）。

《人类血液收集和处理议定书》经区域道德委员会（CPP Est II）审查和批准，协议编号为2011-A00594-37。由于以下议定书描述了人类血液的处理，因此应遵循生物有害物质处理的制度准则。实验室安全设备，如实验室外套和手套，应穿。
1. 红细胞洗涤
注：处理前一天，准备一个含有0.15%牛血清白蛋白（BSA）的磷酸盐缓冲盐水（PBS）的PBS-BSA缓冲液，并将其放入?...

有多种技术可用于确定红细胞CR1（CR1/E）的密度。使用的第一种技术是抗CR1抗体31凝固红血球，以及红细胞在红细胞中涂有C3b32时形成红血球。这些基本技术很快被使用放射性标记的抗CR1抗体11，3333的免疫染色方法所取代。也可以通过酶相关免疫吸附剂测定（ELISA）34来测量膜提取物中CR1的浓度。虽然?...

CR1（补充受体类型1，CD35）是一种200 kDa跨膜糖蛋白存在于许多细胞类型的表面，如红细胞1、B淋巴细胞2、单细胞细胞、一些T细胞、卵泡变性细胞3、胎儿星斑细胞4和球状球状细胞5。CR1干扰其配体C3b、C4b、C3bi6,6、7、8、9，第一补分组C1q7,8,910和MBL（曼南结合语）11的子单元抑制补品的激活，并参与体液和细胞免疫反应。
在灵长类动物，包括人类，红细胞CR1参与将免疫复合物输送到肝脏和脾脏，以净化血液，防止它们在脆弱的组织中积累，如皮肤或肾脏12、13、14。12,13,14免疫复合物和红细胞之间的免疫粘附现象取决于CR1分子的数量15。在人类中，CR1/E的平均密度只有500（即，每红细胞500个CR1分子）。此密度因人而异（100~1，200 CR1/E），同一个体从一个红细胞到另一个红细胞。一些"空"表型的个体表达少于20 CR1/E16。
CR1/E的密度由两个共同主导体体等位基因调节，这些等位基因编码为CR1_117，18,18的intron 27中。这种突变为HindIII酶产生额外的限制位点。在这种情况下，使用 HindIII 消化后获得的限制片段为 7.4 kb，用于与 CR1（H： 高等位基因）的强表达相连的等位基因，与低 CR1 表达式（L：低等位基因）相连的等位机为 6.9 kb。这种联系在白种人和亚洲人中被发现，但在19岁的非洲人后裔中却找不到。
红细胞CR1的表达水平也与exon 13编码SCR 10（I643T）和exon 19编码SCR16（Q981H）中存在点核苷酸突变有关。其高在同型643I/981Q和低同源643T/981H个体20。因此，"低"个人表达约150 CR1/E，"中等"个人表达约500CR1/E，"高"个人表达约1，000CR1/E。
除了这种红细胞密度多态性外，CR1 还具有与四种不同尺寸的异位对应的长度多态性：CR1+1 （190 kDa）、CR1+2 （220 kDa）、CR1+3 （160 kDa） 和 CR1+4 （250 kDa）21和对应于血型 KN22的抗原多态性。
我们提出基于流细胞测定的方法，以确定CR1/E的密度。 使用已知CR1/E密度的三个受试者，表达低密度水平（180 CR1/E）、中等密度水平（646 CR1/E）和高密度水平（966 CR1/E），使用流式细胞仪进行抗CR1免疫后，很容易测量其红细胞或红血球（RBC）的平均荧光强度（MFI）。然后，可以将表示 MFI 的标准线绘制为 CR1/E 密度的函数。测量其CR1/E密度不为人知的受试者的MFI，并将其与该标准线进行比较，可以确定个体的CR1/E密度。这项技术已在实验室使用多年，并使我们能够发现红细胞CR1在许多疾病的表达减少，如系统性红斑狼疮（SLE）23，后天免疫机能丧失综合症（艾滋病）24，疟疾25，最近阿尔茨海默病（AD）26，27。26,27开发针对CR1的药物与红细胞耦合，如抗血栓药物28需要评估CR1/E密度，以及提供量化CR1的可靠技术。
呈现的协议以唱歌的方式运行。它适用于确定CR1/E的密度，许多个人使用特定的商业上可用的96孔板（见材料表）。为此，我们很容易将方法适应任何96井板。对于每个样本，红细胞细胞的细胞悬浮液（0.5 x 106×106红细胞）分布在每口井。对于每一口井，首先添加主要的抗CR1抗体，然后是链球菌PE，二级抗链球菌类抗体，再次使用与方法相同的稀释剂，但通过调整体积和尊重相称性。
应同时抽取来自受试者的血液样本和用于CR1的受试者的血液样本，在4°C下储存在冰箱中，并在4°C（冰上和/或冰箱）处理。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:752px;" width="753">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">1000E Barrier Tip</td>
			<td style="width:239px;">Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France</td>
			<td style="width:119px;">2079E</td>
			<td style="width:179px;">sample pipetting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">1-100 &#181;L Bevelled, filter tip</td>
			<td style="width:239px;">Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany</td>
			<td style="width:119px;">S1120-1840</td>
			<td>sample pipetting</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Biotinylated anti-CR1 monoclonal antibody (J3D3)</td>
			<td style="width:239px;">Home production of non-commercial monoclonal antibody, courtesy of Dr J. Cook</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Blouse</td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>protection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bovin serum albumin (7,5%)</td>
			<td style="width:239px;">Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France</td>
			<td style="width:119px;">15260037</td>
			<td>cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:239px;">Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France</td>
			<td style="width:119px;">11176917</td>
			<td>centrifugation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Clean Solution</td>
			<td style="width:239px;">BD, F-38801 Le Pont de Claix, France</td>
			<td style="width:119px;">340345</td>
			<td>cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Comorack-96</td>
			<td style="width:239px;">Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath</td>
			<td style="width:119px;">944060P</td>
			<td>rack</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Cytometer Setup &#38; Tracking Beads Kit</td>
			<td style="width:239px;">BD, F-38801 Le Pont de Claix, France</td>
			<td style="width:119px;">655051</td>
			<td>cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Formaldehyde solution 36.5 %</td>
			<td style="width:239px;">Sigma Aldrich, F-38070 Saint Quentin Fallavier, France</td>
			<td style="width:119px;">F8775-25ML</td>
			<td>Fixation</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">10 &#181;L Graduated, filter tip</td>
			<td style="width:239px;">Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany</td>
			<td style="width:119px;">S1121-3810</td>
			<td>sample pipetting</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">LSRFORTESSA Flow Cytometer</td>
			<td style="width:239px;">BD, F-38801 Le Pont de Claix, France</td>
			<td style="width:119px;">647788</td>
			<td>cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Microman Capillary Pistons</td>
			<td style="width:239px;">Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath</td>
			<td style="width:119px;">067494</td>
			<td>sample pipetting</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Micronic 1.40 mL round bottom tubes</td>
			<td style="width:239px;">Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath</td>
			<td style="width:119px;">MP32051</td>
			<td>mix</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Micropipette Microman - type M25 -</td>
			<td style="width:239px;">Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath</td>
			<td style="width:119px;">066379</td>
			<td>sample pipetting</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Phosphate buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:239px;">Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France</td>
			<td style="width:119px;">10010031</td>
			<td>cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Pipette PS 325 mm, 10 mL</td>
			<td style="width:239px;">Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath</td>
			<td style="width:119px;">391952</td>
			<td>sample pipetting</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">powder-free Nitrile Exam gloves</td>
			<td style="width:239px;">Medline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, USA</td>
			<td style="width:119px;">486802</td>
			<td>sample protection</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Reference 2 pipette, 0,5-10 &#181;L</td>
			<td style="width:239px;">Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France</td>
			<td style="width:119px;">4920000024</td>
			<td>sample pipetting</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Reference 2 pipette, 20-100 &#181;L</td>
			<td style="width:239px;">Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France</td>
			<td style="width:119px;">4920000059</td>
			<td>sample pipetting</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">Reference 2 pipette, 100-1000 &#181;L</td>
			<td style="width:239px;">Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France</td>
			<td style="width:119px;">4920000083</td>
			<td>sample pipetting</td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;">Rinse Solution</td>
			<td style="width:239px;">BD, F-38801 Le Pont de Claix, France</td>
			<td style="width:119px;">340346</td>
			<td>cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;">Round bottom tube</td>
			<td style="width:239px;">Sarstedt, F-70150 Marnay, France</td>
			<td style="width:119px;">55.1579</td>
			<td>cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Safe-Lock Tubes, 1.5 mL</td>
			<td style="width:239px;">Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France</td>
			<td style="width:119px;">0030120086</td>
			<td>mix</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">streptavidin R-PE</td>
			<td style="width:239px;">Tebu Bio, F-78612 Le Perray-en-Yvelines, France</td>
			<td style="width:119px;">AS-60669</td>
			<td>immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:216px;">Tapered Centrifuge Tubes 50 mL</td>
			<td style="width:239px;">Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France</td>
			<td>10203001</td>
			<td>mix</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Vector anti streptavidin biotin</td>
			<td style="width:239px;">Eurobio Ingen, F-91953 Les Ulis, France</td>
			<td style="width:119px;">BA-0500</td>
			<td>immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Vortex-Genie 2</td>
			<td style="width:239px;">Scientific Industries, Inc, Bohemia, NY 111716, USA</td>
			<td style="width:119px;">SI-0236</td>
			<td>mix</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring erythrocyte complement receptor 1 using flow cytometry

CR1（CD35，C3b/C4b的补色受体1型）是一种高分子量膜糖蛋白，约200 kDa，控制补充活化，运输免疫复合物，并参与体液和细胞免疫反应。CR1 存在于许多细胞类型的表面上，包括红细胞，在长度、结构（Knops 或 KN、血群）和密度方面表现出多态性。每红细胞（CR1/E）CR1的平均密度为每红细胞500个分子。此密度因人而异（100~1，200 CR1/E），同一个体从一个红细胞到另一个红细胞。我们在这里提出了一种可靠的流细胞测量方法，用于测量CR1/E的密度，包括在表达低密度的受试者中，借助放大免疫染色系统。这种方法使我们能够显示CR1红细胞表达在疾病，如阿尔茨海默氏病（AD），全身红斑狼疮（SLE），艾滋病，或疟疾的降低。

已知CR1密度的三个受试者的红细胞（"低"受试者[180 CR1/E]，"中等"受试者[646 CR1/E]和"高"受试者[966 CR1/E]）和需要确定CR1密度的两个受试者的红细胞被抗CR1抗体与使用植物氟色素的扩增系统耦染免疫。一开始，低高范围受试者的CR1密度由Scatchard方法29使用放射性标记抗体确定。确定的标准（低、中、高）用于校准曲线，并使得通过我们的细胞测定方法30来量化新标准...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Erythrocyte Complement Receptor 1 Using Flow Cytometry at JoVE.com

Measuring Erythrocyte Complement Receptor 1 Using Flow Cytometry

该方法的目的是通过与已知红细胞CR1密度的三个受试者进行比较，确定任何受试者红细胞CR1密度的CR1密度。该方法使用抗CR1单克隆抗体在受试者红细胞免疫染色后使用流细胞学，并结合使用植物素（PE）的放大系统。

使用流细胞测定测量红细胞补充受体1

CR1 (CD35, Complement Receptor type 1 for C3b/C4b) is a high molecular weight membrane glycoprotein of about 200 kDa that controls complement activation, ...

该协议可用于测量感兴趣的细胞受体上的抗原位点的数量。这种技术的主要优点是，它产生强大的结果，甚至对于低密度表达的受体。这种方法能够评估CR1红细胞表达的减少，这是如阿尔茨海默氏症，系统性红斑狼疮，艾滋病和疟疾。该协议可用于细胞受体密度的任何分析，也可用于荧光显微镜对细胞受体表达的研究。我们建议在细胞和抗体分布期间间隔管子，并在可能的情况下在第一次分析期间由细胞测量专家陪同。通过流式细胞学对免疫污染和密度定量进行可视化演示，对于了解如何正确设置分析参数至关重要。在开始分析之前，将 250 微升 EDTA 钠从血液储存管中解凝全血放入含有 20 毫升 4 摄氏度 PBS-BSA 的 50 毫升锥形管中。通过温和的反转混合管内，通过离心旋转细胞。使用 10 毫升移液器丢弃上一液，并小心地将颗粒重新在溶液的剩余体积中。加入20毫升的冷PBS-BSA，并再次离心细胞。在离心结束时，将管子放在机架中，放在冰上，将8微升洗涤的红细胞转移到含有三毫升PBS-BSA的50毫升管中。然后通过旋转轻轻混合红细胞，获得均匀细胞悬浮液。对于红细胞免疫，小心地将100微升稀释红细胞转移到单独的1.5毫升管中，通过离心收集红细胞。丢弃超生剂后，在PBS-BSA中，将生物基化抗CR1 J3D3抗体的每微升浓度20微升，直接加入到每个颗粒中。单独在负对照细胞中加入20微升PBS-BSA缓冲液，轻轻混合，在4摄氏度下孵育样品45分钟。在孵育结束时，每管洗涤用750微升新鲜PBS-BSA洗两次样品。第二次洗涤后，将PBS-BSA中1至10丁苯二丁的施泰普他丁植物铁蛋白的20微升加入到每根管子中，轻轻混合，在4摄氏度下孵育样品45分钟。孵化结束时，洗两次样品，如证明。第二次洗涤后，在涡旋过程中用450微升固定缓冲液固定每个细胞样本颗粒，然后将每个样品转移到单独的五毫升圆形底部管中，在4摄氏度下储存长达48小时。要分析流式细胞仪的免疫污染红细胞，请单击流式细胞仪中的新实验按钮，然后重命名新实验。在圆度计设置窗口中选择向前散点、侧散射和 PE。在打开的实验中，选择圆度计设置应用程序设置，并使用灰色框和十字线创建全局工作表来指导优化。设置所有参数后，将未污染的控制管加载到圆度计上并运行采集，优化正向和侧散射电压，以消除碎屑并确保感兴趣的总体是规模。接下来，在前进和侧散射图的红血球周围绘制一个门，并在PE荧光点图中显示红细胞群体。如果正群是规模，将染色控制管加载到圆度计上并运行采集。要记录和分析样品，请卸载染色样品，并在新的全局工作表上创建前向与侧散点图和 PE 荧光直方图。将第一个样本加载到圆度计上，运行采集，并在前向和侧散射图的红细胞周围绘制红细胞门。在PE荧光直方图中显示红细胞群，在统计选项卡下，选择红细胞群PE荧光参数的均值。在采集仪表板中，选择要记录停止门中的所有事件和 10，000 个要记录的事件，然后单击记录数据。事件记录完成后，从测速仪上取出管子。全局工作表图应如图所示。来自三个已知CR1密度受试者的免疫色红细胞的流细胞测量分析允许测量每个受试者标签的均荧光强度。使用已知红细胞 CR1 密度的受量值绘制曲线，允许将这些数据报告为平均荧光强度的函数。将这条曲线得出的回归线与其他受试者平均荧光强度的值进行比较，可以确定其CR1红细胞密度。注意红细胞和抗体的分布正确，因此对阴性对照实验样品的校准曲线在细胞仪设置范围内。只需改变原抗体和/或调整扩增层，即可调整此程序以测量其他密度细胞受体。每当你处理血液，有病原体污染的风险。因此，一定要使用良好的实验室做法，并穿戴适当的个人防护设备。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring the 50% Haemolytic Complement (CH50) Activity of Serum

Measuring the 50% Haemolytic Complement CH50 Activity of Serum

测量50％的溶血性补充（CH 50）活性的血清

The complement system is a group of proteins that when activated lead to target cell lysis and facilitates phagocytosis through opsonisation. Individual ...

科研

免疫与感染

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

在固定和活细胞，流式细胞仪测量钙蛋白酶活性

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

人类<em在体外承认免疫失衡的早期国家禁止作为筛检工具

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

单细胞分析枯草芽孢杆菌生物膜，用荧光显微镜和流式细胞仪

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

通过流式细胞仪测量附件和流感的内在病毒在A549细胞

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

荧光激活细胞分选从小鼠骨髓浆树突状细胞的分离纯化

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

评估视网膜小胶质细胞吞噬功能<em&gt;在体内</em&gt;使用基于流式细胞术流量测定

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

使用成像流式细胞仪T细胞同种异体反应性测定

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

小鼠与人肺泡巨噬细胞的分离和体外培养

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

全骨髓的制备,用于中性粒系细胞的大规模细胞测定分析

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...