Name: measuring erythrocyte complement receptor 1 using flow cytometry
Uploaded: 2020-05-19T12:30:00
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Nous remercions tous les membres de l’URCACyt, la plate-forme technique de cytométrie des flux, le personnel du Département d’immunologie, et le personnel du Département de médecine interne et de gériatrie, qui ont contribué à l’optimisation et à la validation du protocole. Ces travaux ont été financés par les Hôpitaux Universitaires de Reims (numéro de subvention AOL11UF9156).

Le protocole de collecte et de manipulation du sang humain a été examiné et approuvé par le comité régional d’éthique (RPC Est II), et le numéro de protocole est 2011-A00594-37. Étant donné que le protocole suivant décrit la manipulation du sang humain, les lignes directrices institutionnelles pour l’élimination du matériel biorisque devraient être suivies. L’équipement de sécurité de laboratoire, tel que les blouses de laboratoire et les gants, doit être porté.
1. Lavag...

Plusieurs techniques sont disponibles pour déterminer la densité de l’érythrocyte CR1 (CR1/E). Les premières techniques utilisées étaient l’agglutination des globules rouges par les anticorps anti-CR131 et la formation de rosettes en présence d’érythrocytes enduits de C3b32. Ces techniques rudimentaires ont été rapidement remplacées par des méthodes d’immunostaining à l’aide d’anticorps anti-CR1 radiolactés1,<sup ...

CR1 (récepteur de complément de type 1, CD35) est un 200 kDa transmembrane glycoprotéine présente à la surface de nombreux types de cellules, tels que les érythrocytes1, B lymphocytes2, cellules monocytiques, certaines cellules T, cellules dendritiques folliculaires3, astrocytes foetaux4, et podocy glomerular5tes. CR1 interférant avec ses ligands C3b, C4b, C3bi6,7,8,9, un sous-unité de la première composante de complément, C1q10 et MBL (lectine mannan-contraignant)11 inhibe l’activation du complément et est impliqué dans la réponse immunitaire humoristique et cellulaire.
Chez les primates, y compris les humains, l’érythrocyte CR1 est impliqué dans le transport de complexes immunitaires vers le foie et la rate, pour purifier le sang et prévenir leur accumulation dans les tissus vulnérables tels que la peau ou les reins12,13,14. Ce phénomène d’adhérence immunitaire entre les complexes immunitaires et les érythrocytes dépend du nombre de molécules CR115. Chez l’homme, la densité moyenne de CR1/E n’est que de 500 (c.-à-d. 500 molécules de CR1 par érythrocyte). Cette densité varie d’un individu à l’autre (100 à 1 200 CR1/E) et d’un érythrocyte à un autre chez le même individu. Certaines personnes de phénotype "null" expriment moins de 20 CR1/E16.
La densité de CR1/E est réglementée par deux allèles autosomiques co-dominants liés à une mutation ponctuelle dans l’intron 27 du codage génétique pour CR1-117,18. Cette mutation produit un site de restriction supplémentaire pour l’enzyme HindIII. Les fragments de restriction obtenus après digestion avec HindIII dans ce cas sont 7,4 kb pour l’allèle lié à une expression forte de CR1 (H: allèle élevé) et 6,9 kb pour l’allèle lié à une faible expression CR1 (L: faible allèle). Ce lien se trouve chez les Caucasiens et les Asiatiques, mais pas chez les personnes d’ascendance africaine19.
Le niveau d’expression de l’érythrocyte CR1 est également corrélé avec la présence de mutations nucléotides ponctuelles dans l’exon 13 codant SCR 10 (I643T) et dans l’encodage exon 19 SCR16 (Q981H). Il est élevé en homozygous 643I/981Q et faible en homozygous 643T/981H individus20. Ainsi, les personnes « faibles » expriment environ 150 CR1/E, les individus « moyens » expriment environ 500 CR1/E, et les individus « élevés » expriment environ 1 000 CR1/E.
En plus de ce polymorphisme de densité érythrocyte, CR1 se caractérise par un polymorphisme de longueur correspondant à quatre allotypes de tailles différentes : CR1-1 (190 kDa), CR1-2 (220 kDa), CR1-3 (160 kDa), et CR1-4 (250 kDa)21 et un polymorphisme antigénique correspondant au groupe sanguin KN22.
Nous présentons notre méthode basée sur la cytométrie d’écoulement pour déterminer la densité de CR1/E. À l’aide de trois sujets dont la densité CR1/E est connue, exprimant un faible niveau de densité (180 CR1/E), un niveau de densité moyenne (646 CR1/E) et un niveau de densité élevée (966 CR1/E), il est facile de mesurer l’intensité moyenne de fluorescence (IMF) de leurs érythrocytes ou globules rouges (RBC), ou RBC MFI, après l’immunodétoïx anti-CR1 à l’aide d’un cytomètre. On peut ensuite tracer une ligne standard représentant l’IMF en fonction de la densité CR1/E. En mesurant l’IMF des sujets dont la densité CR1/E n’est pas connue et en la comparant à cette ligne standard, il est possible de déterminer la densité CR1/E des individus. Cette technique a été utilisée pendant de nombreuses années en laboratoire, et nous a permis de détecter une réduction de l’expression de l’érythrocyte CR1 dans de nombreuses pathologies telles que le lupus erythématosus systémique (LLE)23, syndrome d’immunodéficience acquise (SIDA)24, paludisme25, et récemment la maladie d’Alzheimer (AD)26,27. Le développement de médicaments ciblant CR1 pour coupler avec des érythrocytes, comme dans le cas des médicaments anti-thrombotiques28 nécessite l’évaluation de la densité CR1/E, et la disponibilité d’une technique robuste pour quantifier CR1.
Le protocole présenté fonctionne en singlicate. Il est adaptable de déterminer la densité de CR1/E sur de nombreuses personnes utilisant des plaques de puits 96 disponibles dans le commerce (voir tableau des matériaux). À cette fin, il est facile d’adapter notre méthode à n’importe quelle plaque de puits 96. Pour chaque échantillon, une suspension cellulaire des érythrocytes (0,5 x 106x 1 x 106 érythrocytes) est distribuée par puits. Pour chaque puits, d’abord l’anticorps anti-CR1 primaire est ajouté, puis streptavidin PE, l’anticorps anti-streptavidine secondaire, et encore une fois streptavidin PE, en utilisant les mêmes dilutions que celles de notre méthode, mais en adaptant les volumes et en respectant la proportionnalité.
Les échantillons de sang provenant de sujets de la gamme et des sujets à quantifier pour LE CR1 doivent être prélevés en même temps, stockés au réfrigérateur à 4 oC et manipulés à 4 oC (sur glace et/ou au réfrigérateur).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:752px;" width="753">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">1000E Barrier Tip</td>
			<td style="width:239px;">Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France</td>
			<td style="width:119px;">2079E</td>
			<td style="width:179px;">sample pipetting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">1-100 &#181;L Bevelled, filter tip</td>
			<td style="width:239px;">Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany</td>
			<td style="width:119px;">S1120-1840</td>
			<td>sample pipetting</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Biotinylated anti-CR1 monoclonal antibody (J3D3)</td>
			<td style="width:239px;">Home production of non-commercial monoclonal antibody, courtesy of Dr J. Cook</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Blouse</td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>protection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bovin serum albumin (7,5%)</td>
			<td style="width:239px;">Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France</td>
			<td style="width:119px;">15260037</td>
			<td>cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:239px;">Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France</td>
			<td style="width:119px;">11176917</td>
			<td>centrifugation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Clean Solution</td>
			<td style="width:239px;">BD, F-38801 Le Pont de Claix, France</td>
			<td style="width:119px;">340345</td>
			<td>cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Comorack-96</td>
			<td style="width:239px;">Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath</td>
			<td style="width:119px;">944060P</td>
			<td>rack</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Cytometer Setup &#38; Tracking Beads Kit</td>
			<td style="width:239px;">BD, F-38801 Le Pont de Claix, France</td>
			<td style="width:119px;">655051</td>
			<td>cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Formaldehyde solution 36.5 %</td>
			<td style="width:239px;">Sigma Aldrich, F-38070 Saint Quentin Fallavier, France</td>
			<td style="width:119px;">F8775-25ML</td>
			<td>Fixation</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">10 &#181;L Graduated, filter tip</td>
			<td style="width:239px;">Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany</td>
			<td style="width:119px;">S1121-3810</td>
			<td>sample pipetting</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">LSRFORTESSA Flow Cytometer</td>
			<td style="width:239px;">BD, F-38801 Le Pont de Claix, France</td>
			<td style="width:119px;">647788</td>
			<td>cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Microman Capillary Pistons</td>
			<td style="width:239px;">Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath</td>
			<td style="width:119px;">067494</td>
			<td>sample pipetting</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Micronic 1.40 mL round bottom tubes</td>
			<td style="width:239px;">Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath</td>
			<td style="width:119px;">MP32051</td>
			<td>mix</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Micropipette Microman - type M25 -</td>
			<td style="width:239px;">Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath</td>
			<td style="width:119px;">066379</td>
			<td>sample pipetting</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Phosphate buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:239px;">Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France</td>
			<td style="width:119px;">10010031</td>
			<td>cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Pipette PS 325 mm, 10 mL</td>
			<td style="width:239px;">Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath</td>
			<td style="width:119px;">391952</td>
			<td>sample pipetting</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">powder-free Nitrile Exam gloves</td>
			<td style="width:239px;">Medline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, USA</td>
			<td style="width:119px;">486802</td>
			<td>sample protection</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Reference 2 pipette, 0,5-10 &#181;L</td>
			<td style="width:239px;">Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France</td>
			<td style="width:119px;">4920000024</td>
			<td>sample pipetting</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Reference 2 pipette, 20-100 &#181;L</td>
			<td style="width:239px;">Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France</td>
			<td style="width:119px;">4920000059</td>
			<td>sample pipetting</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">Reference 2 pipette, 100-1000 &#181;L</td>
			<td style="width:239px;">Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France</td>
			<td style="width:119px;">4920000083</td>
			<td>sample pipetting</td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;">Rinse Solution</td>
			<td style="width:239px;">BD, F-38801 Le Pont de Claix, France</td>
			<td style="width:119px;">340346</td>
			<td>cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;">Round bottom tube</td>
			<td style="width:239px;">Sarstedt, F-70150 Marnay, France</td>
			<td style="width:119px;">55.1579</td>
			<td>cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Safe-Lock Tubes, 1.5 mL</td>
			<td style="width:239px;">Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France</td>
			<td style="width:119px;">0030120086</td>
			<td>mix</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">streptavidin R-PE</td>
			<td style="width:239px;">Tebu Bio, F-78612 Le Perray-en-Yvelines, France</td>
			<td style="width:119px;">AS-60669</td>
			<td>immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:216px;">Tapered Centrifuge Tubes 50 mL</td>
			<td style="width:239px;">Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France</td>
			<td>10203001</td>
			<td>mix</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Vector anti streptavidin biotin</td>
			<td style="width:239px;">Eurobio Ingen, F-91953 Les Ulis, France</td>
			<td style="width:119px;">BA-0500</td>
			<td>immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Vortex-Genie 2</td>
			<td style="width:239px;">Scientific Industries, Inc, Bohemia, NY 111716, USA</td>
			<td style="width:119px;">SI-0236</td>
			<td>mix</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring erythrocyte complement receptor 1 using flow cytometry

CR1 (CD35, Récepteur de complément de type 1 pour C3b/C4b) est une glycoprotéine à forte membrane de poids moléculaire d’environ 200 kDa qui contrôle l’activation de complément, transporte des complexes immunitaires, et participe à des réponses immunitaires humoristiques et cellulaires. CR1 est présent à la surface de nombreux types de cellules, y compris les érythrocytes, et présente des polymorphismes de longueur, de structure (Knops, ou KN, groupe sanguin) et de densité. La densité moyenne de CR1 par érythrocyte (CR1/E) est de 500 molécules par érythrocyte. Cette densité varie d’un individu à l’autre (100 à 1 200 CR1/E) et d’un érythrocyte à un autre chez le même individu. Nous présentons ici une méthode robuste de cytométrie de flux pour mesurer la densité de CR1/E, y compris dans les sujets exprimant une basse densité, avec l’aide d’un système d’immunostaining amplificateur. Cette méthode nous a permis de montrer l’abaissement de l’expression érythrocyte CR1 dans des maladies telles que la maladie d’Alzheimer (SA), le lupus erythematosus systémique (LE), le sida ou le paludisme.

Les érythrocytes de trois sujets dont la densité de CR1 est connue (sujet « faible » [180 CR1/E], sujet « moyen » [646 CR1/E], et sujet « élevé » [966 CR1/E]), et de deux sujets dont la densité CR1 devait être déterminée étaient immunostained par un anticorps anti-CR1 couplé à un système d’amplification utilisant le fluorochrome de phycoerythrine. Au début, la densité CR1 des sujets de la gamme basse-élevée a été déterminée par la méthode de Scatchard29 utilisant des a...

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Measuring Erythrocyte Complement Receptor 1 Using Flow Cytometry

Le but de cette méthode est de déterminer la densité CR1 dans les érythrocytes de n’importe quel sujet en comparant avec trois sujets dont la densité érythrocyte CR1 est connue. La méthode utilise la cytométrie de flux après immunostaining des érythrocytes des sujets par un anticorps monoclonal anti-CR1 couplé à un système amplifié utilisant la phycoerythrine (PE).

Mesurer le récepteur de complément d’érythrocyte 1 à l’aide de la cytométrie des débits

CR1 (CD35, Complement Receptor type 1 for C3b/C4b) is a high molecular weight membrane glycoprotein of about 200 kDa that controls complement activation, ...

Ce protocole peut être utilisé pour mesurer le nombre de sites antigéniques sur les récepteurs cellulaires d’intérêt. Le principal avantage de cette technique est qu’elle produit des résultats robustes, même pour les récepteurs exprimés à faible densité. Cette méthode permet l’évaluation de la réduction de l’expression des érythrocytes CR1 et c’est comme la maladie d’Alzheimer, lupus systémique érythémateux, le sida et le paludisme.Ce protocole est utile pour toute analyse de la densité des récepteurs cellulaires et peut également être appliqué à l’étude de l’expression des récepteurs cellulaires au microscope à fluorescence. Nous recommandons d’espacer les tubes pendant la distribution des cellules et des anticorps, et d’être accompagnés d’un spécialiste cytométrique lors de la première analyse si possible. La démonstration visuelle de la quantification de l’immunostaining et de la densité par cytométrie de flux est essentielle pour comprendre comment bien définir les paramètres d’analyse.Avant de commencer l’analyse, ajoutez 250 microlitres de sang entier anticoagulé EDTA de sodium provenant de tubes de stockage sanguin dans un tube conique de 50 millilitres contenant 20 millilitres de PBS-BSA de quatre degrés Celsius. Mélanger le contenu du tube par inversion douce et faire tourner les cellules par centrifugation. Utilisez une pipette de 10 millilitres pour jeter le supernatant et resuspendez soigneusement la pastille dans le volume résiduel de solution.Ajouter 20 millilitres de PBS-BSA froid et centrifuger à nouveau les cellules. À la fin de la centrifugation, placer le tube dans une grille, placé sur la glace et transférer huit microlitres des érythrocytes lavés dans un tube de 50 millilitres contenant trois millilitres de PBS-BSA. Mélangez ensuite doucement les érythrocytes en filature pour obtenir une suspension cellulaire homogène.Pour l’immunostaining d’érythrocyte, transférez soigneusement 100 microlitres des érythrocytes dilués dans les tubes individuels de 1,5 millilitre et recueillez les globules rouges par centrifugation. Après avoir jeté les supernatants, ajouter soigneusement 20 microlitres d’une concentration de 0,5 microgramme par microlitre d’anticorps anti-CR1 J3D3 biotinylated dans PBS-BSA, directement à chaque granule. Ajouter 20 microlitres de tampon PBS-BSA seul aux cellules de contrôle négatives avec mélange doux et incuber les échantillons pendant 45 minutes à quatre degrés Celsius.À la fin de l’incubation, laver les échantillons deux fois avec 750 microlitres de PBS-BSA frais par tube, par lavage. Après le deuxième lavage, ajouter 20 microlitres d’une à 10 dilution de la phycoerythrine streptavidine dans PBS-BSA à chaque tube avec un mélange doux, et incuber les échantillons pendant 45 minutes à quatre degrés Celsius. À la fin de l’incubation, lavez les échantillons deux fois, comme démontré.Après le deuxième lavage, fixer chaque granulé d’échantillon cellulaire avec 450 microlitres de tampon de fixation pendant le vortex, avant de transférer chaque échantillon dans des tubes de fond ronds de cinq millilitres individuels pour un total de 48 heures de stockage à quatre degrés Celsius. Pour analyser les érythrocytes immunotachés pour la cytométrie du débit, cliquez sur le nouveau bouton d’expérience dans le cytomètre d’écoulement et renommez la nouvelle expérience. Sélectionnez scatter avant, side scatter et PE dans la fenêtre paramètres du cytomètre.Dans l’expérience ouverte, sélectionnez les paramètres d’application des paramètres du cytomètre et créez une feuille de travail globale, en utilisant les boîtes grises et les poils croisés pour guider l’optimisation. Lorsque tous les paramètres ont été définis, chargez le tube de commande non taché sur le cytomètre et exécutez l’acquisition, optimisant les tensions de dispersion avant et latérale pour éliminer les débris et s’assurer que la population d’intérêt est à l’échelle. Ensuite, dessinez une porte autour des globules rouges sur la parcelle de dispersion avant contre côté et affichez la population de globules rouges dans la parcelle de points de la fluorescence pe.Si les populations positives sont sur l’échelle, chargez le tube de commande taché sur le cytomètre et exécutez l’acquisition. Pour enregistrer et analyser des échantillons, déchargez l’échantillon taché et créez une parcelle de dispersion avant contre côté et un histogramme de fluorescence PE sur une nouvelle feuille de travail globale. Chargez le premier échantillon sur le cytomètre, exécutez l’acquisition et dessinez une porte de globule rouge autour des érythrocytes dans la parcelle de dispersion avant contre côté.Affichez la population de globules rouges dans l’histogramme de fluorescence pe et sous l’onglet statistiques, sélectionnez la moyenne pour les paramètres de fluorescence PE sur les populations de globules rouges. Dans le tableau de bord d’acquisition, sélectionnez tous les événements de la porte d’arrêt et 10 000 événements à enregistrer et cliquez sur les données d’enregistrement. Lorsque l’enregistrement de l’événement est terminé, retirez le tube du cytomètre.Les parcelles de feuilles de travail globales devraient être illustrées. L’analyse cytométrique de flux des érythrocytes immunotachés de trois sujets de densités connues de CR1 permet de mesurer l’intensité moyenne de fluorescence de l’étiquetage pour chaque sujet. Tracer une courbe en utilisant les valeurs du sujet avec la densité connue de l’érythrocyte CR1 permet de rapporter ces données en fonction de l’intensité moyenne de fluorescence.La comparaison de la ligne de régression résultant de cette courbe aux valeurs de l’intensité moyenne de fluorescence des autres sujets permet de déterminer leur densité d’érythrocytes CR1. Faites en sorte que les érythrocytes et les anticorps soient correctement distribués, de sorte que les courbes d’étalonnage des échantillons expérimentés sur le contrôle négatif se trouvent dans la gamme des paramètres du cytomètre. Il est possible d’adapter cette procédure pour mesurer d’autres récepteurs cellulaires de densité, simplement en changeant l’anticorps primaire et/ou en adaptant les couches d’amplification.Chaque fois que vous manipulez du sang, il y a un risque de contamination par des agents pathogènes. Par conséquent, assurez-vous d’utiliser de bonnes pratiques de laboratoire et de porter l’équipement de protection individuelle approprié.

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