Name: measuring erythrocyte complement receptor 1 using flow cytometry
Uploaded: 2020-05-19T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Erythrocyte Complement Receptor 1 Using Flow Cytometry at JoVE.com

Wir danken allen Mitgliedern der technischen Plattform URCACyt, Flow Cytometry, den Mitarbeitern der Abteilung für Immunologie und den Mitarbeitern der Abteilung für Innere Medizin und Geriatrie, die zur Optimierung und Validierung des Protokolls beigetragen haben. Diese Arbeit wurde von den Reims University Hospitals (Grant-Nummer AOL11UF9156) finanziert.

Das Protokoll zur Entnahme und Handhabung von menschlichem Blut wurde von der regionalen Ethikkommission (CPP Est II) überprüft und genehmigt, und die Protokollnummer lautet 2011-A00594-37. Da das folgende Protokoll den Umgang mit menschlichem Blut beschreibt, sollten institutionelle Richtlinien für die Entsorgung von biogefährlichem Material befolgt werden. Laborsicherheitsgeräte wie Labormäntel und Handschuhe sollten getragen werden.
1. Erythrozytenwaschen
HIN...

Zur Bestimmung der Dichte von Erythrozyten CR1 (CR1/E) stehen verschiedene Techniken zur Verfügung. Die ersten verwendeten Techniken waren die Agglutination roter Blutkörperchen durch Anti-CR1-Antikörper31 und die Bildung von Rosetten in Gegenwart von Erythrozyten, die mit C3b32beschichtet sind. Diese rudimentären Techniken wurden schnell durch Immunstaining-Methoden mit radioaktiv markierten Anti-CR1-Antikörpern1,33...

CR1 (Komplementrezeptor Typ 1, CD35) ist ein 200 kDa Transmembran-Glykoprotein auf der Oberfläche vieler Zelltypen, wie Erythrozyten1, B-Lymphozyten2, monozytäre Zellen, einige T-Zellen, follikuläre dendritische Zellen3, fetale Astrozyten4und glomeruläre Podozyten5. CR1 stört seine Liganden C3b, C4b, C3bi6,7,8,9, eine Untereinheit der ersten Komplementkomponente, C1q10 und MBL (mannan-binding lectin)11 hemmt die Aktivierung der Komplementierung und ist an der humoralen und zellulären Immunantwort beteiligt.
Bei Primaten, einschließlich Menschen, ist Erythrozyten CR1 am Transport von Immunkomplexen zur Leber und Milz beteiligt, um das Blut zu reinigen und ihre Ansammlung in empfindlichen Geweben wie der Haut oder den Nieren zu verhindern12,13,14. Dieses Phänomen der Immunhaftung zwischen Immunkomplexen und Erythrozyten hängt von der Anzahl der CR1-Moleküle15ab. Beim Menschen beträgt die mittlere Dichte von CR1/E nur 500 (d.h. 500 Moleküle von CR1 pro Erythrozyten). Diese Dichte variiert von Individuum zu Individuum (100–1.200 CR1/E) und von einem Erythrozyten zum anderen in demselben Individuum. Einige Personen des "Null"-Phänotyps drücken weniger als 20 CR1/E16aus.
Die Dichte von CR1/E wird durch zwei ko-dominante autosomale Allele reguliert, die mit einer Punktmutation in Intron 27 des Genkodierungsmittels für CR1*117,18verbunden sind. Diese Mutation erzeugt eine zusätzliche Restriktionsstelle für das HindIII-Enzym. Die Restriktionsfragmente, die nach der Verdauung mit HindIII erhalten wurden, sind 7,4 kb für das Allel, das mit einem starken Ausdruck von CR1 (H: hohes Allel) verbunden ist, und 6,9 kb für das Allel, das mit einem niedrigen CR1-Ausdruck verbunden ist (L: niedriges Allel). Diese Verbindung findet sich bei Kaukasiern und Asiaten, aber nicht bei Menschen afrikanischer Abstammung19.
Der Ausdrucksgrad von Erythrozyten CR1 korreliert auch mit dem Vorhandensein von Punktnukleotidmutationen in exon 13 Codierung SCR 10 (I643T) und in exon 19 Codierung SCR16 (Q981H). Es ist hoch in homozygoten 643I/981Q und niedrig in homozygoten 643T/981H Personen20. So drücken "niedrige" Individuen etwa 150 CR1/E aus, "mittlere" Individuen etwa 500 CR1/E und "hohe" Individuen etwa 1.000 CR1/E.
Zusätzlich zu diesem Erythrozytendichtepolymorphismus zeichnet sich CR1 durch einen Längenpolymorphismus aus, der vier Allotypen unterschiedlicher Größen entspricht: CR1*1 (190 kDa), CR1*2 (220 kDa), CR1*3 (160 kDa) und CR1*4 (250 kDa)21 und ein antigener Polymorphismus, der der Blutgruppe KN22entspricht.
Wir stellen unsere Methode auf der Grundlage der Durchflusszytometrie vor, um die Dichte von CR1/E zu bestimmen. Mit einem niedrigen Dichtegrad (180 CR1/E), einer mittleren Dichte (646 CR1/E) und einer hohen Dichte (966 CR1/E) ist es einfach, die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) ihrer Erythrozyten oder roten Blutkörperchen (RBC) oder RBC MFI nach Anti-CR1-Immunfärbung mit einem Durchflusszytometer zu messen. Man kann dann eine Standardlinie darstellen, die das MFI als Funktion der CR1/E-Dichte darstellt. Durch messung des MFI von Probanden, deren CR1/E-Dichte nicht bekannt ist, und vergleicht man es mit dieser Standardlinie, ist es möglich, die CR1/E-Dichte der Individuen zu bestimmen. Diese Technik wird seit vielen Jahren im Labor verwendet, und hat es uns ermöglicht, eine Verringerung der Expression von Erythrozyten CR1 in vielen Pathologien wie systemische Lupus erythematodes (SLE)23, Erworbene Immundefizienz-Syndrom (AIDS)24, Malaria25, und vor kurzem Alzheimer-Krankheit (AD)26,27. Die Entwicklung von Medikamenten, die auf CR1 abzielen, um sich mit Erythrozyten zu paaren, wie im Fall von Antithrombotika28 erfordert die Bewertung der CR1/E-Dichte und die Verfügbarkeit einer robusten Technik zur Quantifizierung von CR1.
Das vorgestellte Protokoll läuft in singlicate. Es ist anpassungsfähig, um die Dichte von CR1/E bei vielen Individuen mit spezifischen handelsüblichen 96 Brunnenplatten zu bestimmen (siehe Tabelle der Materialien). Zu diesem Zweck ist es einfach, unsere Methode an jede 96-Well-Platte anzupassen. Für jede Probe wird eine Zellsuspension von Erythrozyten (0,5 x 106–1 x 106 Erythrozyten) pro Brunnen verteilt. Für jeden Brunnen wird zunächst der primäre Anti-CR1-Antikörper hinzugefügt, dann Streptavidin PE, der sekundäre Anti-Streptavidin-Antikörper, und wieder Streptavidin PE, wobei die gleichen Verdünnungen wie die unserer Methode verwendet werden, aber durch Anpassung der Volumina und die Wahrung der Verhältnismäßigkeit.
Die Blutproben von Probanden des Bereichs und von Probanden, die für CR1 quantifiziert werden sollen, sollten gleichzeitig gezogen, bei 4 °C im Kühlschrank gelagert und bei 4 °C behandelt werden (auf Eis und/oder im Kühlschrank).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:752px;" width="753">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">1000E Barrier Tip</td>
			<td style="width:239px;">Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France</td>
			<td style="width:119px;">2079E</td>
			<td style="width:179px;">sample pipetting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">1-100 &#181;L Bevelled, filter tip</td>
			<td style="width:239px;">Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany</td>
			<td style="width:119px;">S1120-1840</td>
			<td>sample pipetting</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Biotinylated anti-CR1 monoclonal antibody (J3D3)</td>
			<td style="width:239px;">Home production of non-commercial monoclonal antibody, courtesy of Dr J. Cook</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Blouse</td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>protection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bovin serum albumin (7,5%)</td>
			<td style="width:239px;">Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France</td>
			<td style="width:119px;">15260037</td>
			<td>cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:239px;">Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France</td>
			<td style="width:119px;">11176917</td>
			<td>centrifugation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Clean Solution</td>
			<td style="width:239px;">BD, F-38801 Le Pont de Claix, France</td>
			<td style="width:119px;">340345</td>
			<td>cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Comorack-96</td>
			<td style="width:239px;">Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath</td>
			<td style="width:119px;">944060P</td>
			<td>rack</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Cytometer Setup &#38; Tracking Beads Kit</td>
			<td style="width:239px;">BD, F-38801 Le Pont de Claix, France</td>
			<td style="width:119px;">655051</td>
			<td>cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Formaldehyde solution 36.5 %</td>
			<td style="width:239px;">Sigma Aldrich, F-38070 Saint Quentin Fallavier, France</td>
			<td style="width:119px;">F8775-25ML</td>
			<td>Fixation</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">10 &#181;L Graduated, filter tip</td>
			<td style="width:239px;">Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany</td>
			<td style="width:119px;">S1121-3810</td>
			<td>sample pipetting</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">LSRFORTESSA Flow Cytometer</td>
			<td style="width:239px;">BD, F-38801 Le Pont de Claix, France</td>
			<td style="width:119px;">647788</td>
			<td>cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Microman Capillary Pistons</td>
			<td style="width:239px;">Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath</td>
			<td style="width:119px;">067494</td>
			<td>sample pipetting</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Micronic 1.40 mL round bottom tubes</td>
			<td style="width:239px;">Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath</td>
			<td style="width:119px;">MP32051</td>
			<td>mix</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Micropipette Microman - type M25 -</td>
			<td style="width:239px;">Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath</td>
			<td style="width:119px;">066379</td>
			<td>sample pipetting</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Phosphate buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:239px;">Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France</td>
			<td style="width:119px;">10010031</td>
			<td>cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Pipette PS 325 mm, 10 mL</td>
			<td style="width:239px;">Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath</td>
			<td style="width:119px;">391952</td>
			<td>sample pipetting</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">powder-free Nitrile Exam gloves</td>
			<td style="width:239px;">Medline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, USA</td>
			<td style="width:119px;">486802</td>
			<td>sample protection</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Reference 2 pipette, 0,5-10 &#181;L</td>
			<td style="width:239px;">Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France</td>
			<td style="width:119px;">4920000024</td>
			<td>sample pipetting</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Reference 2 pipette, 20-100 &#181;L</td>
			<td style="width:239px;">Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France</td>
			<td style="width:119px;">4920000059</td>
			<td>sample pipetting</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">Reference 2 pipette, 100-1000 &#181;L</td>
			<td style="width:239px;">Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France</td>
			<td style="width:119px;">4920000083</td>
			<td>sample pipetting</td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;">Rinse Solution</td>
			<td style="width:239px;">BD, F-38801 Le Pont de Claix, France</td>
			<td style="width:119px;">340346</td>
			<td>cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;">Round bottom tube</td>
			<td style="width:239px;">Sarstedt, F-70150 Marnay, France</td>
			<td style="width:119px;">55.1579</td>
			<td>cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Safe-Lock Tubes, 1.5 mL</td>
			<td style="width:239px;">Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France</td>
			<td style="width:119px;">0030120086</td>
			<td>mix</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">streptavidin R-PE</td>
			<td style="width:239px;">Tebu Bio, F-78612 Le Perray-en-Yvelines, France</td>
			<td style="width:119px;">AS-60669</td>
			<td>immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:216px;">Tapered Centrifuge Tubes 50 mL</td>
			<td style="width:239px;">Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France</td>
			<td>10203001</td>
			<td>mix</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Vector anti streptavidin biotin</td>
			<td style="width:239px;">Eurobio Ingen, F-91953 Les Ulis, France</td>
			<td style="width:119px;">BA-0500</td>
			<td>immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Vortex-Genie 2</td>
			<td style="width:239px;">Scientific Industries, Inc, Bohemia, NY 111716, USA</td>
			<td style="width:119px;">SI-0236</td>
			<td>mix</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring erythrocyte complement receptor 1 using flow cytometry

CR1 (CD35, Komplementrezeptor Typ 1 für C3b/C4b) ist ein hochmolekulares Membranglykoprotein von etwa 200 kDa, das die Komplementaktivierung steuert, Immunkomplexe transportiert und an humoralen und zellulären Immunreaktionen teilnimmt. CR1 ist auf der Oberfläche vieler Zelltypen vorhanden, einschließlich Erythrozyten, und weist Polymorphismen in Länge, Struktur (Knops oder KN, Blutgruppe) und Dichte auf. Die durchschnittliche Dichte von CR1 pro Erythrozyten (CR1/E) beträgt 500 Moleküle pro Erythrozyten. Diese Dichte variiert von Individuum zu Individuum (100–1.200 CR1/E) und von einem Erythrozyten zum anderen in demselben Individuum. Wir präsentieren hier eine robuste Durchflusszytometrie-Methode zur Messung der Dichte von CR1/E, auch bei Probanden, die eine geringe Dichte ausdrücken, mit Hilfe eines amplifizierenden Immunstainierungssystems. Diese Methode hat es uns ermöglicht, die Senkung der CR1-Erythrozytenexpression bei Krankheiten wie Alzheimer (AD), systemischem Lupus erythematodes (SLE), AIDS oder Malaria zu zeigen.

Die Erythrozyten von drei Probanden, deren CR1-Dichte bekannt ist ("niedriges" Subjekt [180 CR1/E], "mittleres" Subjekt [646 CR1/E] und "hohes" Subjekt [966 CR1/E]) und von zwei Probanden, deren CR1-Dichte bestimmt werden musste, wurden durch einen Anti-CR1-Antikörper immunisiert, der mit einem Amplifikationssystem gekoppelt war, das den Phycoerythrin Fluor chrom verwendete. Zu Beginn wurde die CR1-Dichte der Probanden aus dem niedrigen Bereich durch die Scatchard-Methode29 mit radioaktiv markier...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Erythrocyte Complement Receptor 1 Using Flow Cytometry at JoVE.com

Measuring Erythrocyte Complement Receptor 1 Using Flow Cytometry

Das Ziel dieser Methode ist es, die CR1-Dichte in den Erythrozyten eines jeden Probanden zu bestimmen, indem man mit drei Probanden vergleicht, deren Erythrozyten-CR1-Dichte bekannt ist. Die Methode verwendet Durchflusszytometrie nach Immunfärbung der Erythrozyten der Probanden durch einen monoklonalen Anti-CR1-Antikörper, der mit einem verstärkten System mit Phycoerythrin (PE) gekoppelt ist.

Messung des Erythrozytenkomplementrezeptors 1 mit Durchflusszytometrie

CR1 (CD35, Complement Receptor type 1 for C3b/C4b) is a high molecular weight membrane glycoprotein of about 200 kDa that controls complement activation, ...

Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die Anzahl der antigenen Stellen auf zellulären Rezeptor von Interesse zu messen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie robuste Ergebnisse produziert, auch für Rezeptoren, die bei geringer Dichte ausgedrückt werden. Diese Methode ermöglicht die Bewertung der Reduktion der CR1-Erythrozytenexpression und dies ist wie Alzheimer, systemischer Lupus erythematodes, AIDS und Malaria.Dieses Protokoll ist nützlich für jede Analyse der Zellrezeptordichte und kann auch auf die Untersuchung der Zellrezeptorexpression mittels Fluoreszenzmikroskop angewendet werden. Wir empfehlen, die Rohre während der Zell- und Antikörperverteilung abzugrenzen und bei der ersten Analyse möglichst von einem zytometrischen Spezialisten begleitet zu werden. Die visuelle Demonstration der Immunostainierung und Dichtequantifizierung durch Durchflusszytometrie ist entscheidend für das Verständnis, wie die Analyseparameter richtig eingestellt werden.Vor Beginn der Analyse 250 Mikroliter Natrium EDTA antikoaguliertes Vollblut aus Blutspeicherröhrchen in eine 50 Milliliter konische Röhre mit 20 Milliliter n.V. PBS-BSA. Mischen Sie den Rohrinhalt durch sanfte Inversion und drehen Sie die Zellen durch Zentrifugation. Verwenden Sie eine 10 Milliliter Pipette, um den Überstand zu entsorgen und das Pellet im Restvolumen der Lösung vorsichtig wieder aufzuhängen.Fügen Sie 20 Milliliter kalte PBS-BSA hinzu und zentrifugieren Sie die Zellen wieder. Am Ende der Zentrifugation das Rohr in ein Rack legen, auf Eis legen und acht Mikroliter der gewaschenen Erythrozyten in ein 50-Milliliter-Rohr mit drei MilliliterPBS-BSA übertragen. Dann mischen Sie die Erythrozyten sanft durch Spinnen, um eine homogene Zellsuspension zu erhalten.Für Erythrozyten-Immunostainierung 100 Mikroliter der verdünnten Erythrozyten sorgfältig in einzelne 1,5-Milliliter-Röhrchen übertragen und die roten Blutkörperchen durch Zentrifugation sammeln. Nach dem Wegwerfen der Überstandmittel 20 Mikroliter einer Konzentration von 0,5 Mikrogramm pro Mikroliter biotinylierter Anti-CR1 J3D3-Antikörper in PBS-BSA direkt in jedes Pellet geben. Fügen Sie 20 Mikroliter PBS-BSA-Puffer allein zu den negativen Kontrollzellen mit sanfter Mischung hinzu und inkubieren Sie die Proben 45 Minuten lang bei vier Grad Celsius.Am Ende der Inkubation die Proben zweimal mit 750 Mikrolitern frischer PBS-BSA pro Tube pro Waschmittel waschen. Nach der zweiten Wäsche 20 Mikroliter einer bis 10 Verdünnung von Streptavidin-Phycoerythrin in PBS-BSA zu jedem Rohr mit sanfter Mischung hinzufügen und die Proben 45 Minuten bei vier Grad Celsius inkubieren. Waschen Sie die Proben am Ende der Inkubation zweimal, wie gezeigt.Nach der zweiten Wäsche, fixieren Sie jedes Zellprobenpellet mit 450 Mikroliter Fixationspuffer während des Wirbelns, bevor Sie jede Probe in einzelne fünf Milliliter runde Bodenröhren für bis zu 48 Stunden Lagerung bei vier Grad Celsius übertragen. Um die immunbefleckten Erythrozyten für die Durchflusszytometrie zu analysieren, klicken Sie auf die neue Experimentschaltfläche im Durchflusszytometer, und benennen Sie das neue Experiment um. Wählen Sie vorwärts gestreut, Seitenstreuung und PE im Fenster Zytometer-Einstellungen.Wählen Sie im offenen Experiment die Anwendungseinstellungen für die Zytometereinstellungen aus, und erstellen Sie ein globales Arbeitsblatt, indem Sie die grauen Felder und Querhaare verwenden, um die Optimierung zu steuern. Wenn alle Parameter eingestellt sind, laden Sie das ungefärbte Steuerrohr auf das Zytometer und führen Sie die Erfassung aus, wodurch die Vorwärts- und Seitenstreuspannungen optimiert werden, um Schmutz zu beseitigen und sicherzustellen, dass die Bevölkerung von Interesse auf der Skala liegt. Als nächstes zeichnen Sie ein Tor um die roten Blutkörperchen auf dem vorderen gegen seiteStreudiagramm und zeigen die Population der roten Blutkörperchen im Punktdiagramm der PE-Fluoreszenz an.Wenn die positiven Populationen auf der Skala sind, laden Sie das gebeizte Steuerrohr auf das Zytometer und führen Sie die Erfassung aus. Um Proben aufzuzeichnen und zu analysieren, entladen Sie die gebeizte Probe und erstellen Sie ein vorwärts- versus seitenseitiges Streudiagramm und ein PE-Fluoreszenzhistogramm auf einem neuen globalen Arbeitsblatt. Laden Sie die erste Probe auf das Zytometer, führen Sie die Erfassung durch und zeichnen Sie ein rotes Blutkörperchentor um die Erythrozyten im vorwärts- oder seitlichen Streudiagramm.Zeigen Sie die Population der roten Blutkörperchen im PE-Fluoreszenz-Histogramm an, und wählen Sie unter der Registerkarte Statistik den Mittelwert für die PE-Fluoreszenzparameter für rote Blutkörperchen aus. Wählen Sie im Erfassungsdashboard alle Ereignisse im Stoppgate und 10.000 Ereignisse aus, die aufzeichnet werden sollen, und klicken Sie auf Datensatzdaten. Wenn die Ereignisaufzeichnung abgeschlossen ist, entfernen Sie das Rohr aus dem Zytometer.Die globalen Arbeitsblattdiagramme sollten wie dargestellt aussehen. Die zytometrische Durchflussanalyse von immunbefleckten Erythrozyten von drei Probanden bekannter CR1-Dichte ermöglicht die Messung der mittleren Fluoreszenzintensität der Etikettierung für jedes Probanden. Das Plotten einer Kurve unter Verwendung der Werte des Subjekts mit der bekannten Dichte von Erythrozyten CR1 ermöglicht die Erfassung dieser Daten in Abhängigkeit von der mittleren Fluoreszenzintensität.Der Vergleich der Regressionslinie, die sich aus dieser Kurve ergibt, mit den Werten der mittleren Fluoreszenzintensität der anderen Probanden ermöglicht die Bestimmung ihrer CR1-Erythrozytendichte. Achten Sie darauf, dass die Erythrozyten und Antikörper richtig verteilt sind, so dass die Kalibrierkurven der experimentierten Proben auf der Negativkontrolle im Bereich der Zytometereinstellungen liegen. Es ist möglich, dieses Verfahren anzupassen, um andere Dichte zelluläre Rezeptoren zu messen, einfach durch Ändern des primären Antikörpers und/oder Anpassung der Amplifikationsschichten.Wenn Sie mit Blut umgehen, besteht die Gefahr einer Kontamination durch Krankheitserreger. Achten Sie daher darauf, gute Laborpraktiken zu verwenden und die entsprechende persönliche Schutzausrüstung zu tragen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring the 50% Haemolytic Complement (CH50) Activity of Serum

Measuring the 50% Haemolytic Complement CH50 Activity of Serum

Die Messung der 50% Hämolytische Complement (CH 50) Aktivität von Serum

The complement system is a group of proteins that when activated lead to target cell lysis and facilitates phagocytosis through opsonisation. Individual ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Mess-Calpain Aktivität in fixierten und lebenden Zellen mittels Durchflusszytometrie

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Mensch In Vitro Suppression als Screening-Tool für die Anerkennung von Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Einzel-Zell-Analyse Bacillus subtilis Biofilme mittels Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

Mess Bindung und Internalisierung von Influenza A-Virus in A549-Zellen mittels Durchflusszytometrie

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung zur Reinigung von Plasmazytoide dendritischer Zellen aus dem Knochenmark der Maus

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Die Beurteilung Retinal Microglial Phagozytische Funktion<em&gt; In Vivo</em&gt; Mit einem Durchfluss-Zytometrie basierten Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

Die Messung der T-Zell-Alloreaktivität Mit Imaging Durchflusszytometrie

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation und In-vitro- Kultur von murinen und menschlichen alveoläre Makrophagen

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

Vorbereitung des ganzen Knochenmarks für die Mass Cytometry Analyse von Neutrophilen-Linienzellen

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...