Name: measuring erythrocyte complement receptor 1 using flow cytometry
Uploaded: 2020-05-19T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Erythrocyte Complement Receptor 1 Using Flow Cytometry at JoVE.com

אנו מודים לכל חברי URCACyt, הזרימה cy, בפלטפורמת הטכנית, צוות המחלקה לאימונולוגיה, וצוות המחלקה לרפואה פנימית וגריאטריה, שתרמו למיטוב ולאימות הפרוטוקול. עבודה זו ממומנת על ידי בתי חולים של אוניברסיטת ריימס (גרנט מספר AOL11UF9156).

הפרוטוקול של איסוף הדם האנושי והטיפול נבדק ואושר על ידי ועדת האתיקה האזורית (CPP Est II), ומספר הפרוטוקול הוא 2011-A00594-37. מכיוון שהפרוטוקול הבא מתאר את הטיפול בדם אנושי, יש לעקוב אחר הנחיות מוסדיים לסילוק חומרים ביולוגיים. יש לענוד ציוד בטיחות מעבדה, כגון מעילי מעבדה וכפפות.
1. שטיפת ?...

טכניקות מסוימות זמינות כדי לקבוע את הצפיפות של אריתרופויציט CR1 (CR1/E). הטכניקות הראשונות ששימשו היו התנוצנות של כדוריות הדם האדומות על ידי anti-CR1 נוגדנים31 ואת היווצרות רוזטות בנוכחות של אריתרופוציטים מצופה עם C3b32. טכניקות אלה בסיסי הוחלפו במהירות על ידי שיטות חיסוני...

CR1 (סוג קולטן משלים 1, CD35) הוא 200 kda הטרנסקרום גליקופרוטאין להציג על פני השטח של סוגים רבים של תאים, כגון אריתרופוציטים1, B לימפוציטים2, תאים monocytic, כמה תאים T, תאים דנדריטים הזקיקים3, העובר אסטרוציטים4, ו-podocytes מדומה5. CR1 מתערב עם ליגידיים C3b, C4b, C3bi6,7,8,9, יחידת משנה של רכיב המשלים הראשון, C1q10 ו mbl (mannan-כריכה לקטין)11 מעכב את ההפעלה של המשלים והוא מעורב התגובה החיסונית הוואתית והסלולר.
בפרימטים, כולל בני אדם, אריתרופויציט CR1 מעורב בהובלת מתחמי החיסון לכבד ולטחול, כדי לטהר את הדם ולמנוע את ההצטברות שלהם ברקמות פגיעות כגון העור או הכליות12,13,14. תופעה זו של הדבקה חיסונית בין מכלולי החיסון ו אריתרופוציטים תלוי במספר של CR1 מולקולות15. בבני אדם, הצפיפות הממוצעת של CR1/E היא רק 500 (כלומר, 500 מולקולות של CR1 לכל אריתרופואריציט). צפיפות זו משתנה מאדם אחד למשנהו (100 – 1200 CR1/E) ומתוך אריתרופואריציט אחד למשנהו באותו אדם. אנשים מסוימים של "null" פנוטיפ פחות מ 20 CR1/E16.
את הצפיפות של CR1/E מוסדר על ידי שני שיתוף השכל אללים מקושר מוטציה נקודה ב אינטרון 27 של קידוד הגן עבור CR1 * 117,18. מוטציה זו מייצרת אתר הגבלה נוסף עבור האנזים HindIII. שברי ההגבלה שהתקבלו לאחר העיכול עם hindiii במקרה זה הם 7.4 kb עבור אלל מקושר ביטוי חזק של CR1 (H: high אלל) ו 6.9 kb עבור אלל מקושר CR1 ביטוי נמוך (L: אלל נמוך). קישור זה נמצא בקווקז ובאסיאתים, אך לא באנשים ממוצא אפריקאי19.
רמת הביטוי של אריתרופואריציט CR1 הוא גם מתואם עם נוכחות של נוקלאוטיד הנקודה מוטציות ב אקסון 13 קידוד SCR 10 (I643T) ו ב אקסון 19 קידוד SCR16 (Q981H). הוא גבוה ב homozygous 643I/981Q ונמוך ב homozygous 643I/981Q אנשים20. כך, אנשים "נמוכים" מבטאים סביב 150 CR1/E, "בינוני" אנשים לבטא סביב 500 CR1/E, ו "גבוהה" אנשים מבטאים סביב 1,000 CR1/E.
בנוסף לפולימורפיזם דחיסות זו, CR1 מאופיין בפולימורפיזם אורך התואם לארבעה אלוסוגים של גדלים שונים: CR1 * 1 (190 kDa), CR1 * 2 (220 kDa), CR1 * 3 (160 kDa), ו CR1 * 4 (250 kDa)21 ו פולימורפיזם אנטיגניים המתאימים לקבוצת הדם KN22.
אנו מציגים את השיטה שלנו מבוסס על הזרימה cy, נסה לקבוע את צפיפות CR1/E. באמצעות שלושה נושאים שצפיפות CR1/E שלהם ידועה, ביטוי רמת צפיפות נמוכה (180 CR1/E), רמת צפיפות בינונית (646 CR1/E), ורמת צפיפות גבוהה (966 CR1/E), קל למדוד את עוצמת הזריחה הממוצע (MFI) של האריתרופוציטים שלהם או כדוריות הדם האדומות (RBC), או RBC MFI, אחרי אנטי CR1 מכתים באמצעות cytometry זרימה. ניתן להתוות קו סטנדרטי המייצג את MFI כפונקציה של צפיפות CR1/E. מדידת MFI של נושאים שצפיפות ה-CR1/E שלהם אינה ידועה ומשווה אותו לקו סטנדרטי זה, ניתן לקבוע את צפיפות הCR1/E של האנשים. טכניקה זו שימש במשך שנים רבות במעבדה, והוא איפשר לנו לזהות הפחתה בביטוי של אריתרופולוגיה CR1 בפתווגיות רבות כגון זאבת מערכתית מאריטתסוס (הדלקת)23, תסמונת כשל חיסוני נרכש (איידס)24, מלריה25, ומחלת אלצהיימר לאחרונה (AD)26,27. התפתחות התרופות מיקוד CR1 לזוג עם אריתרופוציטים, כמו במקרה של תרופות נגד טרומבוטיים28 דורש הערכה של CR1/E צפיפות, ואת הזמינות של טכניקה איתנה לכמת CR1.
הפרוטוקול שהוצג. פועל בסינגליאט הוא ניתן להתאמה כדי לקבוע את צפיפות CR1/E על אנשים רבים באמצעות ספציפי מסחרית זמין 96 לוחות היטב (ראה לוח חומרים). למטרה זו, קל להתאים את השיטה שלנו לצלחת כל 96. עבור כל דוגמה, השעיית תא של אריתרופוציטים (0.5 x 106– 1 x 106 אריתרופוציטים) מופץ בכל טוב. עבור כל באר, תחילה את הנוגדן העיקרי anti-CR1 מתווסף, אז streptavidin PE, נוגדן אנטי streptavidin משני, ושוב streptavidin PE, באמצעות הדילול זהה לאלה של השיטה שלנו, אבל על ידי התאמת כרכים וכיבוד המידתיות.
דגימות הדם מהנושאים של הטווח ומנושאים שיש לכמת עבור CR1 צריכות להיות מצוירות באותו זמן, מאוחסנות במקרר ב -4 ° c ומטופלות ב -4 ° צ' (על קרח ו/או במקרר).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:752px;" width="753">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">1000E Barrier Tip</td>
			<td style="width:239px;">Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France</td>
			<td style="width:119px;">2079E</td>
			<td style="width:179px;">sample pipetting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">1-100 &#181;L Bevelled, filter tip</td>
			<td style="width:239px;">Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany</td>
			<td style="width:119px;">S1120-1840</td>
			<td>sample pipetting</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Biotinylated anti-CR1 monoclonal antibody (J3D3)</td>
			<td style="width:239px;">Home production of non-commercial monoclonal antibody, courtesy of Dr J. Cook</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Blouse</td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>protection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bovin serum albumin (7,5%)</td>
			<td style="width:239px;">Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France</td>
			<td style="width:119px;">15260037</td>
			<td>cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:239px;">Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France</td>
			<td style="width:119px;">11176917</td>
			<td>centrifugation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Clean Solution</td>
			<td style="width:239px;">BD, F-38801 Le Pont de Claix, France</td>
			<td style="width:119px;">340345</td>
			<td>cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Comorack-96</td>
			<td style="width:239px;">Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath</td>
			<td style="width:119px;">944060P</td>
			<td>rack</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Cytometer Setup &#38; Tracking Beads Kit</td>
			<td style="width:239px;">BD, F-38801 Le Pont de Claix, France</td>
			<td style="width:119px;">655051</td>
			<td>cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Formaldehyde solution 36.5 %</td>
			<td style="width:239px;">Sigma Aldrich, F-38070 Saint Quentin Fallavier, France</td>
			<td style="width:119px;">F8775-25ML</td>
			<td>Fixation</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">10 &#181;L Graduated, filter tip</td>
			<td style="width:239px;">Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany</td>
			<td style="width:119px;">S1121-3810</td>
			<td>sample pipetting</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">LSRFORTESSA Flow Cytometer</td>
			<td style="width:239px;">BD, F-38801 Le Pont de Claix, France</td>
			<td style="width:119px;">647788</td>
			<td>cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Microman Capillary Pistons</td>
			<td style="width:239px;">Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath</td>
			<td style="width:119px;">067494</td>
			<td>sample pipetting</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Micronic 1.40 mL round bottom tubes</td>
			<td style="width:239px;">Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath</td>
			<td style="width:119px;">MP32051</td>
			<td>mix</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Micropipette Microman - type M25 -</td>
			<td style="width:239px;">Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath</td>
			<td style="width:119px;">066379</td>
			<td>sample pipetting</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Phosphate buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:239px;">Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France</td>
			<td style="width:119px;">10010031</td>
			<td>cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Pipette PS 325 mm, 10 mL</td>
			<td style="width:239px;">Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath</td>
			<td style="width:119px;">391952</td>
			<td>sample pipetting</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">powder-free Nitrile Exam gloves</td>
			<td style="width:239px;">Medline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, USA</td>
			<td style="width:119px;">486802</td>
			<td>sample protection</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Reference 2 pipette, 0,5-10 &#181;L</td>
			<td style="width:239px;">Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France</td>
			<td style="width:119px;">4920000024</td>
			<td>sample pipetting</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Reference 2 pipette, 20-100 &#181;L</td>
			<td style="width:239px;">Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France</td>
			<td style="width:119px;">4920000059</td>
			<td>sample pipetting</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">Reference 2 pipette, 100-1000 &#181;L</td>
			<td style="width:239px;">Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France</td>
			<td style="width:119px;">4920000083</td>
			<td>sample pipetting</td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;">Rinse Solution</td>
			<td style="width:239px;">BD, F-38801 Le Pont de Claix, France</td>
			<td style="width:119px;">340346</td>
			<td>cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;">Round bottom tube</td>
			<td style="width:239px;">Sarstedt, F-70150 Marnay, France</td>
			<td style="width:119px;">55.1579</td>
			<td>cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Safe-Lock Tubes, 1.5 mL</td>
			<td style="width:239px;">Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France</td>
			<td style="width:119px;">0030120086</td>
			<td>mix</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">streptavidin R-PE</td>
			<td style="width:239px;">Tebu Bio, F-78612 Le Perray-en-Yvelines, France</td>
			<td style="width:119px;">AS-60669</td>
			<td>immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:216px;">Tapered Centrifuge Tubes 50 mL</td>
			<td style="width:239px;">Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France</td>
			<td>10203001</td>
			<td>mix</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Vector anti streptavidin biotin</td>
			<td style="width:239px;">Eurobio Ingen, F-91953 Les Ulis, France</td>
			<td style="width:119px;">BA-0500</td>
			<td>immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Vortex-Genie 2</td>
			<td style="width:239px;">Scientific Industries, Inc, Bohemia, NY 111716, USA</td>
			<td style="width:119px;">SI-0236</td>
			<td>mix</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring erythrocyte complement receptor 1 using flow cytometry

CR1 (CD35, משלים מסוג הקולטן 1 עבור C3b/C4b) הוא הממברנה מולקולרית משקל גבוה גליקופרוטאין של כ 200 kda כי שולטת הפעלה משלימים, הובלות מתחמי החיסון, ומשתתפת תגובות החיסונית ומוראלית הסלולר. CR1 נמצא על פני השטח של סוגים רבים של תאים, כולל אריתרופוציטים, ומוצגים פולימריות באורך, מבנה (Knops, או KN, קבוצת דם), וצפיפות. הצפיפות הממוצעת של CR1 לאריתרופואריציט (CR1/E) היא 500 מולקולות לכל אריתרופואריציט. צפיפות זו משתנה מאדם אחד למשנהו (100 – 1200 CR1/E) ומתוך אריתרופואריציט אחד למשנהו באותו אדם. אנו מציגים כאן השיטה החזקה cy, למדוד את הצפיפות של CR1/E, כולל בנושאים המבטא צפיפות נמוכה, בעזרת מערכת חיסונית הגברה. שיטה זו אפשרה לנו להראות את הורדת הביטוי CR1 אריתרופוציטים במחלות כגון מחלת אלצהיימר (AD), זאבת מערכתית שושנה (מיקרו), איידס, או מלריה.

אריתרופוציטים של שלושה נושאים אשר צפיפות CR1 ידועה ("נמוך" נושא [180 CR1/E], "בינוני" נושא [646 CR1/E], ו "גבוהה" נושא [966 CR1/E]), ו של שני נושאים שצפיפות הCR1 שלהם צריך להיקבע היו מוכתם בנוגדן אנטי CR1 מצמידים למערכת הגברה באמצעות הפילוקוארירין fluorochrome. בהתחלה, הצפיפות הCR1 של הנושאים מהטווח הנמוך נקבע על-ידי שיט...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Erythrocyte Complement Receptor 1 Using Flow Cytometry at JoVE.com

Measuring Erythrocyte Complement Receptor 1 Using Flow Cytometry

מטרת שיטה זו היא לקבוע את צפיפות CR1 ב אריתרופוציטים של כל נושא על ידי השוואת עם שלושה נושאים שצפיפות הCR1 של erythrocyte ידועה. השיטה משתמשת cy, לאחר כתמים חיסוני של הנבדקים ' אריתרופוציטים על ידי נוגדן אנטי CR1 שבטיים מצמידים למערכת מוגברת באמצעות phycoארימתרין (PE).

מדידת קולטן אריתרופוציט 1 באמצעות שימוש בשיטת זרימה

CR1 (CD35, Complement Receptor type 1 for C3b/C4b) is a high molecular weight membrane glycoprotein of about 200 kDa that controls complement activation, ...

פרוטוקול זה יכול לשמש כדי למדוד את מספר האתרים האנטיגניים על קולטן הסלולר של עניין. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מייצרת תוצאות חזקות, אפילו עבור קולטנים לידי ביטוי בצפיפות נמוכה. שיטה זו מאפשרת הערכה של הפחתת ביטוי אריתרוסיטים CR1 וזה כגון אלצהיימר, זאבת אדרתמטוסוס מערכתית, איידס ומלריה.פרוטוקול זה שימושי עבור כל ניתוח של צפיפות קולטן התא והוא יכול להיות מיושם גם על המחקר של ביטוי קולטן התא על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. אנו ממליצים על ריווח הצינורות במהלך התפלגות התאים והנוגדנים, ולהוות על ידי מומחה ציטומטרי במהלך הניתוח הראשון במידת האפשר. הדגמה חזותית של כשל חיסוני וכימות צפיפות על ידי ציטומטריית זרימה היא קריטית להבנת האופן שבו ניתן להגדיר כראוי את פרמטרי הניתוח.לפני תחילת הניתוח, להוסיף 250 microliters של נתרן EDTA נוגד קרישה דם שלם מצינורות אחסון דם לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר המכיל 20 מיליליטר של ארבע מעלות צלזיוס PBS-BSA. מערבבים את תכולת הצינור על ידי היפוך עדין ומסובבים את התאים על ידי צנטריפוגה. השתמש פיפטה 10 מיליליטר כדי להשליך את supernatant בזהירות resuspend את גלולה בנפח שיורית של פתרון.הוסף 20 מיליליטר של PBS-BSA קר צנטריפוגה התאים שוב. בסוף הצנטריפוגה, מניחים את הצינור במתלה, מניחים על קרח ומעבירים שמונה מיקרוליטרים של אריתרוקיטים שטופים לצינור 50 מיליליטר המכיל שלושה מיליליטר של PBS-BSA. ואז לערבב את אריתרוציטים בעדינות על ידי ספינינג כדי לקבל השעיית תא הומוגני.עבור immunostaining אריתרוקיטים, בזהירות להעביר 100 microliters של אריתרוציטים מדולל לתוך צינורות בודדים 1.5 מיליליטר ולאסוף את תאי הדם האדומים על ידי צנטריפוגה. לאחר השלכת supernatants, בזהירות להוסיף 20 microliters של 0.5 מיקרוגרם לכל ריכוז microliter של נוגדן biotinylated נגד CR1 J3D3 ב PBS-BSA, ישירות לכל גלולה. הוסיפו 20 מיקרוליטרים של מאגר PBS-BSA לבד לתאי הבקרה השליליים עם ערבוב עדין והדגירה של הדגימות במשך 45 דקות בארבע מעלות צלזיוס.בסוף הדגירה, לשטוף את הדגימות פעמיים עם 750 microliters של PBS-BSA טרי לצינור, לכל לשטוף. לאחר הכביסה השנייה, מוסיפים 20 מיקרוליטרים של דילול של פיקוארין סטרפטבידין ב- PBS-BSA לכל צינור עם ערבוב עדין, ומדגרים את הדגימות במשך 45 דקות בארבע מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, לשטוף את הדגימות פעמיים, כפי שהודגם.לאחר הכביסה השנייה, לתקן כל גלולה מדגם התא עם 450 microliters של חיץ קיבוע במהלך מערבולת, לפני העברת כל מדגם לתוך צינורות תחתונים עגולים בודדים חמישה מיליליטר עד 48 שעות של אחסון בארבע מעלות צלזיוס. כדי לנתח את אריתרוציטים מוכתמים לכשלים בזרימה, לחץ על לחצן הניסוי החדש בציטומטר הזרימה ושנה את שם הניסוי החדש. בחר פיזור קדימה, פיזור צדדי ו- PE בחלון הגדרות הציטומטר.בניסוי הפתוח, בחר הגדרות יישום של הגדרות ציטומטר וצור גליון עבודה גלובלי, תוך שימוש בתיבות האפורות ובצלבים כדי להנחות את המיטוב. כאשר כל הפרמטרים נקבעו, לטעון את צינור הבקרה לא מוכתם על הציטרומטר ולהפעיל את הרכישה, אופטימיזציה של מתחי פיזור קדימה וצד כדי לחסל פסולת כדי להבטיח כי האוכלוסייה של עניין הוא בקנה מידה. לאחר מכן, צייר שער סביב תאי הדם האדומים בחלקת הפיזור קדימה לעומת הצד והצג את אוכלוסיית תאי הדם האדומים בחלקת הנקודה של פלואורסצנטיות PE.אם האוכלוסיות החיוביות נמצאות בקנה מידה גדול, טען את צינור הבקרה המוכתם על הציטרומטר והפעל את הרכישה. כדי להקליט ולנתח דגימות, בטל את טעינת הדגימה המוכתמת וצור חלקת פיזור קדימה לעומת צד והיסטוגרמה פלואורסצנטית PE בגליון עבודה גלובלי חדש. לטעון את הדגימה הראשונה על הציטרומטר, להפעיל את הרכישה ולצייר שער תא דם אדום סביב אריתרוציטים בחלקת פיזור קדימה לעומת הצד.הצג את אוכלוסיית תאי הדם האדומים בהיסטוגרמה פלואורסצנטיות PE ותחת לשונית הסטטיסטיקה, בחר את הממוצע עבור הפרמטרים פלואורסצנטיות PE על אוכלוסיות תאי דם אדומים. בלוח המחוונים של הרכישה, בחר את כל האירועים בשער העצירה ו- 10,000 אירועים לתיעוד ולחץ על נתוני רשומה. לאחר שהקלטת האירוע הושלמה, הסר את הצינור מהציטרומטר.ההתוויות הכלליות של גליון העבודה צריכות להיראות כמודגמות. ניתוח ציטומטרי זרימה של אריתרוציטים מוכתמים בכשלושה נושאים של צפיפות CR1 ידועה מאפשר מדידה של עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת של התיוג עבור כל נושא. התוויית עקומה באמצעות ערכי הנושא עם הצפיפות הידועה של אריתרוקיטים CR1 מאפשרת דיווח על נתונים אלה כפונקציה של עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת.השוואה בין קו הרגרסיה הנובע מעקומה זו לערכים של עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת של הנבדקים האחרים מאפשרת קביעת צפיפות אריתרוקיטים CR1 שלהם. יש לדאוג כי אריתרוציטים ונוגדנים מופצים כראוי, כך עקומות הכיול של דגימות ניסויים על הבקרה השלילית נמצאים בטווח של הגדרות הציטרומטר. ניתן להתאים הליך זה למדידת קולטנים תאיים אחרים בצפיפות, פשוט על ידי שינוי הנוגדן העיקרי ו/או התאמת שכבות ההגברה.בכל פעם שאתה מטפל בדם, קיים סיכון לזיהום פתוגן. לכן, הקפד להשתמש בשיטות מעבדה טובות וללבוש את ציוד המגן האישי המתאים.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring the 50% Haemolytic Complement (CH50) Activity of Serum

Measuring the 50% Haemolytic Complement CH50 Activity of Serum

מדידת משלים Haemolytic 50% (CH 50) פעילות של סרום

The complement system is a group of proteins that when activated lead to target cell lysis and facilitates phagocytosis through opsonisation. Individual ...

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

מדידת פעילות Calpain בתוך תאים חיים קבוע על ידי זרימת cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

אנושי במבחנה דיכוי ככלי מיון עבור הכרה של מדינת מוקדם של חוסר איזון החיסון

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

מתא בודד ניתוח בצילוס subtilis Biofilms באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ו cytometry זרימה

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

מדידה מצורף והפנמה של שפעת וירוס בתאי A549 על ידי cytometry הזרימה

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

מיון תא מופעל קרינה עבור טיהור של תאי דנדריטים Plasmacytoid ממח עצם העכבר

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

להערכת תפקוד רשתית microglial Phagocytic<em&gt; In vivo</em&gt; שימוש cytometry זרימה מבוסס Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

מדידת T Cell Alloreactivity שימוש cytometry זרימה הדמיה

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

בידוד והתרבות במבחנה של מקרופאגים מכתשי מאתר ואנושי

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

הכנת מח עצם שלם לניתוח המוני Cy, לטיפול בניופיל-תאי השושלת

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...