Name: measuring erythrocyte complement receptor 1 using flow cytometry
Uploaded: 2020-05-19T12:30:00
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Ringraziamo tutti i membri della piattaforma tecnica URCACyt, la piattaforma tecnica di citometria di flusso, lo staff del Dipartimento di Immunologia e lo staff del Dipartimento di Medicina Interna e Geriatria, che hanno contribuito a ottimizzare e convalidare il protocollo. Questo lavoro è stato finanziato dalla Reims University Hospitals (numero di sovvenzione AOL11UF9156).

Il protocollo per la raccolta e la manipolazione del sangue umano è stato rivisto e approvato dal comitato etico regionale (CPP Est II), e il numero di protocollo è 2011-A00594-37. Poiché il seguente protocollo descrive la manipolazione del sangue umano, devono essere seguite linee guida istituzionali per lo smaltimento di materiale biopericoloso. Devono essere indossate attrezzature di sicurezza di laboratorio, come cappotti da laboratorio e guanti.
1. Lavaggio eretritrita
<p class="jove...

Sono disponibili diverse tecniche per determinare la densità dell'eritrocito CR1 (CR1/E). Le prime tecniche utilizzate sono state l'agglutinazione dei globuli rossi dagli anticorpi anti-CR131 e la formazione di rosette in presenza di eritrociti rivestiti con C3b32. Queste tecniche rudimentali sono state rapidamente sostituite da metodi di immunostainizzazione utilizzando anticorpi anti-CR1 radioetichettati1,33. È ...

CR1 (recettore di complemento di tipo 1, CD35) è una glicoproteina transmembrana da 200 kDa presente sulla superficie di molti tipi di cellule, come gli eritrociti1, B linfociti2, cellule monocitiche, alcune cellule T, cellule dendritiche follicolari3, astrociti fetali4e glomerari podociti5. CR1 che interferisce con i suoi ligandi C3b, C4b, C3bi6,7,8,9, una sottounità del primo componente complementare, C1q10 e MBL (mannan-leg lectin)11 inibisce l'attivazione del complemento ed è coinvolto nella risposta immunitaria umorale e cellulare.
Nei primati, compresi gli esseri umani, l'eritrocite CR1 è coinvolto nel trasporto di complessi immunitari al fegato e alla milza, per purificare il sangue e prevenirne l'accumulo nei tessuti vulnerabili come la pelle o i reni12,13,14. Questo fenomeno di adesione immunitaria tra complessi immunitari ed eritrociti dipende dal numero di molecole CR115. Nell'uomo, la densità media di CR1/E è solo 500 (cioè 500 molecole di CR1 per eritrocito). Questa densità varia da un individuo all'altro (100-1.200 CR1/E) e da un eritrocito all'altro nello stesso individuo. Alcuni individui di fenotipo "null" esprimono meno di 20 CR1/E16.
La densità di CR1/E è regolata da due alleli autosomici co-dominanti legati a una mutazione puntiforme nell'intron 27 della codifica genica per CR1-117,18. Questa mutazione produce un sito di restrizione aggiuntiva per l'enzima HindIII. I frammenti di restrizione ottenuti dopo la digestione con HindIII in questo caso sono 7,4 kb per l'allele legato a una forte espressione di CR1 (H: high allele) e 6,9 kb per l'allele legato alla bassa espressione CR1 (L: basso allele). Questo collegamento si trova in caucasici e asiatici, ma non in persone di origine africana19.
Il livello di espressione dell'eritrocite CR1 è anche correlato alla presenza di mutazioni di nucleotidi puntuali nella codifica exon 13 SCR 10 (I643T) e nella codifica exon 19 SCR16 (Q981H). È alto in omozigolo 643I/981Q e basso in omozygous 643T/981H individui20. Così, individui "bassi" esprimono circa 150 CR1/E, individui "medi" esprimono circa 500 CR1/E, e le persone "alte" esprimono circa 1.000 CR1/E.
Oltre a questo polimorfismo a densità di eritrociti, CR1 è caratterizzato da un polimorfismo di lunghezza corrispondente a quattro allotipi di diverse dimensioni: CR1,1 (190 kDa), CR1-2 (220 kDa), CR1-3 (160 kDa) e CR1-4 (250 kDa)21 e un antimorfismo corrispondente al gruppo sanguigno KN22.
Presentiamo il nostro metodo basato sulla citometria di flusso per determinare la densità di CR1/E. Utilizzando tre soggetti la cui densità CR1/E è nota, esprimendo un basso livello di densità (180 CR1/E), un livello di densità media (646 CR1/E) e un alto livello di densità (966 CR1/E), è facile misurare l'intensità media di fluorescenza (MFI) dei loro eritrociti o globuli rossi (RBC) o RBC MFI, dopo l'anti-CR1ining utilizzando un citometro a flusso. Si può quindi tracciare una linea standard che rappresenta la MFI in funzione della densità CR1/E. Misurando le MFI di soggetti la cui densità CR1/E non è nota e confrontandola con questa linea standard, è possibile determinare la densità CR1/E degli individui. Questa tecnica è stata utilizzata per molti anni in laboratorio, e ci ha permesso di rilevare una riduzione dell'espressione di eritrocite CR1 in molte patologie come il lupus erythematosos sistemico (SLE)23, Sindrome da immunodeficienza acquisita (AIDS)24,malaria25e recentemente malattia di Alzheimer (AD)26,27. Lo sviluppo di farmaci destinati a CR1 ad accoppiarsi con eritrociti, come nel caso dei farmaci antitroculo28 richiede la valutazione della densità CR1/E e la disponibilità di una tecnica robusta per quantificare CR1.
Il protocollo presentato viene eseguito nel singliatore. È adattabile per determinare la densità di CR1/E su molti individui utilizzando specifiche lastre disponibili in commercio 96 pozze (vedi Tabella dei materiali). A tal fine, è facile adattare il nostro metodo a qualsiasi piastra da 96 pozzi. Per ogni campione, una sospensione cellulare di eritrociti (0,5 x 106–1 x 106 eretrociti) viene distribuita per ogni pozzo. Per ogni pozzo, prima viene aggiunto l'anticorpo anti-CR1 primario, poi streptavidin PE, l'anticorpo anti-streptavidin secondario, e di nuovo streptavidin PE, utilizzando le stesse diluizioni del nostro metodo, ma adattando i volumi e rispettando la proporzionalità.
I campioni di sangue provenienti da soggetti della gamma e da soggetti da quantificare per CR1 devono essere prelevati contemporaneamente, conservati in frigorifero a 4 gradi centigradi e trattati a 4 gradi centigradi (sul ghiaccio e/o in frigorifero).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:752px;" width="753">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">1000E Barrier Tip</td>
			<td style="width:239px;">Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France</td>
			<td style="width:119px;">2079E</td>
			<td style="width:179px;">sample pipetting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">1-100 &#181;L Bevelled, filter tip</td>
			<td style="width:239px;">Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany</td>
			<td style="width:119px;">S1120-1840</td>
			<td>sample pipetting</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Biotinylated anti-CR1 monoclonal antibody (J3D3)</td>
			<td style="width:239px;">Home production of non-commercial monoclonal antibody, courtesy of Dr J. Cook</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Blouse</td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>protection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bovin serum albumin (7,5%)</td>
			<td style="width:239px;">Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France</td>
			<td style="width:119px;">15260037</td>
			<td>cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:239px;">Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France</td>
			<td style="width:119px;">11176917</td>
			<td>centrifugation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Clean Solution</td>
			<td style="width:239px;">BD, F-38801 Le Pont de Claix, France</td>
			<td style="width:119px;">340345</td>
			<td>cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Comorack-96</td>
			<td style="width:239px;">Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath</td>
			<td style="width:119px;">944060P</td>
			<td>rack</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Cytometer Setup &#38; Tracking Beads Kit</td>
			<td style="width:239px;">BD, F-38801 Le Pont de Claix, France</td>
			<td style="width:119px;">655051</td>
			<td>cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Formaldehyde solution 36.5 %</td>
			<td style="width:239px;">Sigma Aldrich, F-38070 Saint Quentin Fallavier, France</td>
			<td style="width:119px;">F8775-25ML</td>
			<td>Fixation</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">10 &#181;L Graduated, filter tip</td>
			<td style="width:239px;">Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany</td>
			<td style="width:119px;">S1121-3810</td>
			<td>sample pipetting</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">LSRFORTESSA Flow Cytometer</td>
			<td style="width:239px;">BD, F-38801 Le Pont de Claix, France</td>
			<td style="width:119px;">647788</td>
			<td>cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Microman Capillary Pistons</td>
			<td style="width:239px;">Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath</td>
			<td style="width:119px;">067494</td>
			<td>sample pipetting</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Micronic 1.40 mL round bottom tubes</td>
			<td style="width:239px;">Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath</td>
			<td style="width:119px;">MP32051</td>
			<td>mix</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Micropipette Microman - type M25 -</td>
			<td style="width:239px;">Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath</td>
			<td style="width:119px;">066379</td>
			<td>sample pipetting</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Phosphate buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:239px;">Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France</td>
			<td style="width:119px;">10010031</td>
			<td>cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Pipette PS 325 mm, 10 mL</td>
			<td style="width:239px;">Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath</td>
			<td style="width:119px;">391952</td>
			<td>sample pipetting</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">powder-free Nitrile Exam gloves</td>
			<td style="width:239px;">Medline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, USA</td>
			<td style="width:119px;">486802</td>
			<td>sample protection</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Reference 2 pipette, 0,5-10 &#181;L</td>
			<td style="width:239px;">Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France</td>
			<td style="width:119px;">4920000024</td>
			<td>sample pipetting</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Reference 2 pipette, 20-100 &#181;L</td>
			<td style="width:239px;">Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France</td>
			<td style="width:119px;">4920000059</td>
			<td>sample pipetting</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">Reference 2 pipette, 100-1000 &#181;L</td>
			<td style="width:239px;">Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France</td>
			<td style="width:119px;">4920000083</td>
			<td>sample pipetting</td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;">Rinse Solution</td>
			<td style="width:239px;">BD, F-38801 Le Pont de Claix, France</td>
			<td style="width:119px;">340346</td>
			<td>cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;">Round bottom tube</td>
			<td style="width:239px;">Sarstedt, F-70150 Marnay, France</td>
			<td style="width:119px;">55.1579</td>
			<td>cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Safe-Lock Tubes, 1.5 mL</td>
			<td style="width:239px;">Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France</td>
			<td style="width:119px;">0030120086</td>
			<td>mix</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">streptavidin R-PE</td>
			<td style="width:239px;">Tebu Bio, F-78612 Le Perray-en-Yvelines, France</td>
			<td style="width:119px;">AS-60669</td>
			<td>immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:216px;">Tapered Centrifuge Tubes 50 mL</td>
			<td style="width:239px;">Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France</td>
			<td>10203001</td>
			<td>mix</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Vector anti streptavidin biotin</td>
			<td style="width:239px;">Eurobio Ingen, F-91953 Les Ulis, France</td>
			<td style="width:119px;">BA-0500</td>
			<td>immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Vortex-Genie 2</td>
			<td style="width:239px;">Scientific Industries, Inc, Bohemia, NY 111716, USA</td>
			<td style="width:119px;">SI-0236</td>
			<td>mix</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring erythrocyte complement receptor 1 using flow cytometry

CR1 (CD35, Complement Receptor tipo 1 per C3b/C4b) è una glicoproteina a membrana ad alto peso molecolare di circa 200 kDa che controlla l'attivazione del complemento, trasporta i complessi immunitari e partecipa alle risposte immunitarie umorali e cellulari. CR1 è presente sulla superficie di molti tipi di cellule, tra cui eritrociti, ed esibisce polimorfismi in lunghezza, struttura (Knops, o KN, gruppo sanguigno), e densità. La densità media di CR1 per eritrocite (CR1/E) è di 500 molecole per eritrocito. Questa densità varia da un individuo all'altro (100-1.200 CR1/E) e da un eritrocito all'altro nello stesso individuo. Qui presentiamo un robusto metodo di citometria di flusso per misurare la densità di CR1/E, anche in soggetti che esprimono una bassa densità, con l'aiuto di un sistema di immunostaining amplificante. Questo metodo ci ha permesso di mostrare l'abbassamento dell'espressione di cr1 errociti in malattie come il morbo di Alzheimer (AD), il lupus erythematosus (SLE), l'AIDS o la malaria.

Gli eritrociti di tre soggetti la cui densità di CR1 è nota ("bassa" [180 CR1/E], soggetto "medio" [646 CR1/E], e soggetto "alto" [966 CR1/E]), e di due soggetti la cui densità di CR1 doveva essere determinata sono stati immunostained da un anti-organismo anti-CR1 accoppiato ad un sistema di amplificazione utilizzando il fisiologia. All'inizio, la densità CR1 dei soggetti della fascia bassa-alta è stata determinata dal metodo Scatchard29 utilizzando anticorpi radioetichettati. Gli standard (b...

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Measuring Erythrocyte Complement Receptor 1 Using Flow Cytometry

Lo scopo di questo metodo è quello di determinare la densità di CR1 negli eritrociti di qualsiasi soggetto confrontandosi con tre soggetti la cui densità di eritrocito CR1 è nota. Il metodo utilizza la citometria di flusso dopo l'immunostaining degli eritrociti dei soggetti da parte di un anticorpo monoclonale anti-CR1 accoppiato a un sistema amplificato utilizzando la ficoerythrina (PE).

Misurazione del recettore del complemento dell'eritrocite 1 utilizzando la citometria di flusso

CR1 (CD35, Complement Receptor type 1 for C3b/C4b) is a high molecular weight membrane glycoprotein of about 200 kDa that controls complement activation, ...

Questo protocollo può essere utilizzato per misurare il numero di siti antigenici sul recettore cellulare di interesse. Il vantaggio principale di questa tecnica è che produce risultati robusti, anche per i recettori espressi a bassa densità. Questo metodo consente la valutazione della riduzione dell'espressione degli etitrociti CR1 e questo è come Alzheimer, lupus eritematoso sistemico, AIDS e malaria.Questo protocollo è utile per qualsiasi analisi della densità del recettore cellulare e può anche essere applicato allo studio dell'espressione del recettore cellulare tramite microscopio a fluorescenza. Si consiglia di spaziare i tubi durante la distribuzione cellulare e anticorpale e di essere accompagnati da uno specialista citometrico durante la prima analisi, se possibile. La dimostrazione visiva dell'immunostaining e della quantificazione della densità per citometria del flusso è fondamentale per capire come impostare correttamente i parametri di analisi.Prima di iniziare l'analisi, aggiungere 250 microlitri di sangue intero anticoagulato DI SODIO EDTA da tubi di stoccaggio del sangue in un tubo conico da 50 millilitri contenente 20 millilitri di quattro gradi Celsius PBS-BSA. Mescolare il contenuto del tubo per inversione delicata e far girare le cellule per centrifugazione. Utilizzare una pipetta da 10 millilitri per scartare il supernatante e rimescolare con cura il pellet nel volume residuo della soluzione.Aggiungere 20 millilitri di PBS-BSA freddo e centrifugare nuovamente le cellule. Al termine della centrifugazione, posizionare il tubo in un rack, posto sul ghiaccio e trasferire otto microlitri degli eriociti lavati in un tubo da 50 millilitri contenente tre millilitri di PBS-BSA. Quindi mescolare delicatamente gli eriociti girando per ottenere una sospensione cellulare omogenea.Per l'immunosottenimento degli etitrociti, trasferire con cura 100 microlitri degli eriociti diluiti in singoli tubi da 1,5 millilitri e raccogliere i globuli rossi mediante centrifugazione. Dopo aver scartato i supernaganti, aggiungere con cura 20 microlitri di una concentrazione di 0,5 microgrammi per microlitri di anticorpo biotinilato anti-CR1 J3D3 in PBS-BSA, direttamente ad ogni pellet. Aggiungere 20 microlitri di tampone PBS-BSA alle sole celle di controllo negative con miscelazione delicata e incubare i campioni per 45 minuti a quattro gradi Celsius.Al termine dell'incubazione, lavare i campioni due volte con 750 microlitri di PBS-BSA fresco per tubo, per lavaggio. Dopo il secondo lavaggio, aggiungere 20 microlitri di una o 10 diluizione di fichererina streptavidina in PBS-BSA a ciascun tubo con miscelazione delicata e incubare i campioni per 45 minuti a quattro gradi Celsius. Alla fine dell'incubazione, lavare i campioni due volte, come dimostrato.Dopo il secondo lavaggio, fissare ogni pellet di campione di cella con 450 microlitri di tampone di fissaggio durante il vortice, prima di trasferire ogni campione in singoli tubi inferiori rotondi da cinque millilitri per un massimo di 48 ore di conservazione a quattro gradi Celsius. Per analizzare gli eriociti immunososteniati per la citometria del flusso, fare clic sul nuovo pulsante dell'esperimento nel citometro di flusso e rinominare il nuovo esperimento. Selezionate dispersione in avanti, dispersione laterale e PE nella finestra delle impostazioni del citometro.Nell'esperimento aperto, selezionare le impostazioni dell'applicazione delle impostazioni del citometro e creare un foglio di lavoro globale, utilizzando le scatole grigie e i capelli incrociati per guidare l'ottimizzazione. Una volta impostati tutti i parametri, caricare il tubo di controllo non macchiato sul citometro ed eseguire l'acquisizione, ottimizzando le tensioni di dispersione avanti e laterale per eliminare i detriti e garantire che la popolazione di interesse sia su larga scala. Successivamente, disegna un cancello intorno ai globuli rossi sulla trama di dispersione anteriore contro laterale e mostra la popolazione di globuli rossi nella trama puntino della fluorescenza pe.Se le popolazioni positive sono in scala, caricare il tubo di controllo macchiato sul citometro ed eseguire l'acquisizione. Per registrare e analizzare campioni, scaricare il campione colorato e creare un grafico a dispersione avanti o laterale e un istogramma a fluorescenza PE in un nuovo foglio di lavoro globale. Caricare il primo campione sul citometro, eseguire l'acquisizione e disegnare un cancello rosso dei globuli attorno agli eriociti nella trama di dispersione anteriore o laterale.Visualizzare la popolazione di globuli rossi nell'istogramma a fluorescenza PE e nella scheda statistiche selezionare la media per i parametri di fluorescenza pe sulle popolazioni di globuli rossi. Nel dashboard di acquisizione selezionare tutti gli eventi nel gate di arresto e 10.000 eventi da registrare e fare clic su registra dati. Al termine della registrazione dell'evento, rimuovere il tubo dal citometro.I grafici globali del foglio di lavoro devono essere come illustrato. L'analisi citometrica del flusso degli eriociti immunososteniati provenienti da tre soggetti di densità CR1 note consente di misurare l'intensità media di fluorescenza dell'etichettatura per ciascun soggetto. Tracciare una curva utilizzando i valori del soggetto con la densità nota dell'eriocite CR1 consente di riportarli in funzione dell'intensità media della fluorescenza.Il confronto della linea di regressione risultante da questa curva con i valori dell'intensità media di fluorescenza degli altri soggetti consente di determinare la loro densità di eriociti CR1. Fare attenzione che gli eriociti e gli anticorpi siano distribuiti correttamente, quindi le curve di calibrazione dei campioni sperimentati sul controllo negativo rientrano nell'intervallo delle impostazioni del citometro. È possibile adattare questa procedura per misurare altri recettori cellulari di densità, semplicemente cambiando l'anticorpo primario e /o adattando gli strati di amplificazione.Ogni volta che si maneggia il sangue, c'è il rischio di contaminazione da agenti patogeni. Pertanto, assicurarsi di utilizzare buone pratiche di laboratorio e di indossare i dispositivi di protezione individuale appropriati.

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