Name: measuring erythrocyte complement receptor 1 using flow cytometry
Uploaded: 2020-05-19T12:30:00
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URCACyt、フローサイトメトリー技術プラットフォームのメンバー、免疫学科のスタッフ、およびプロトコルの最適化と検証に貢献した内科学・老年医学省のスタッフに感謝します。この研究はランス大学病院(助成金番号AOL11UF9156)によって資金提供されました。

ヒトの採血と取り扱いの議定書は、地域倫理委員会(CPP Est II)によって審査され、承認され、プロトコル番号は2011-A00594-37です。以下のプロトコルは、ヒトの血液の取扱いについて説明しているので、生体有害物質の廃棄に関する制度上のガイドラインに従うべきである。ラボコートや手袋などの実験室の安全装置を着用する必要があります。
1. 赤血球洗浄
<p class="jove_con...

赤血球CR1(CR1/E)の密度を決定するためにいくつかの技術が利用可能です。第1の技術は、抗CR1抗体31による赤血球の凝集と、C3b32でコーティングされた赤血球の存在下でのロゼットの形成であった。32これらの初歩的な技術は、放射性標識抗CR1抗体11、3333を用いた免疫染色法によって迅速に置換された。また、酵素結...

CR1(補体受容体型1、CD35)は、赤血球1、Bリンパ球2、単球細胞、一部のT細胞、濾胞樹状細胞3、胎児アストロサイト4、および糸球体ポドサイト5のような多くの細胞型の表面に存在する200kDa膜貫通糖タンパク質である。CR1は、そのリガンドC3b、C4b、C3bi6、7、8、9、第1の補体成分のサブユニット、C1q6,7,8,910およびMBL(マンナン結合レクチン)11は、補体の活性化を阻害し、体液性および細胞性免疫応答に関与する。
ヒトを含む霊長類において、赤血球CR1は、肝臓および脾臓への免疫複合体の輸送に関与し、血液を浄化し、皮膚または腎臓12、13、14,13,14などの脆弱な組織に蓄積するのを防ぐ。免疫複合体と赤血球との間の免疫接着のこの現象は、CR1分子15の数に依存する。ヒトでは、CR1/Eの平均密度はわずか500(すなわち、赤血球当たりCR1の500分子)である。この密度は、ある個体(100~1,200 CR1/E)、同一個体の赤血球から別の赤血球へと変化する。"null" 表現型の一部の個体は、20 CR1/E16未満を表現する。
CR1/Eの密度は、CR1*117、18,18に対してコードする遺伝子のイントロン27における点突然変異に結合した2つの共支配性常染色体対立遺伝子によって調節される。この変異は、HindIII酵素に対する追加の制限部位を生成する。この場合のHindIIIでの消化後に得られた制限フラグメントは、CR1(H:高アレル)の強い発現にリンクされたアレルの7.4kb、低CR1発現にリンクされたアレルの6.9kb(L:低アレル)である。このリンクは白人やアジア人に見られますが、アフリカ系の人々には見られません19.
赤血球CR1の発現レベルは、SCR10をコードするエキソン13(I643T)およびExON 19コードSCR16(Q981H)におけるポイントヌクレオチド突然変異の存在とも相関している。ホモ接合643I/981Qでは高く、ホモ接合体643T/981H個体20では低い。したがって、「低い」個体は約150 CR1/Eを表現し、「中程度」の個体は約500のCR1/Eを表現し、「高い」個体は約1,000 CR1/Eを表現する。
この赤血球密度多型に加えて、CR1は、異なるサイズの4つの異なる異形型に対応する長さの多形によって特徴付けられる:CR1*1(190 kDa)、CR1*2(220kDa)、CR1*3(160kDa)、およびCR1*4(250 kDa)21と抗原多型の22に対応する。21
CR1/Eの密度が既知の3つの被験者を用いて、CR1/Eの密度を決定するためのフローサイトメトリーに基づく方法を提示します。 低密度レベル(180 CR1/E)、中密度レベル(646 CR1/E)、高密度レベル(966 CR1/E)を発現し、赤血球または赤血球(RBC)の平均蛍光強度(MFI)、またはRBC MFIを測定することは容易です。その後、MFI を CR1/E 密度の関数として表す標準線をプロットできます。CR1/E密度が知られていない被験者のMFIを測定し、これをこの標準線と比較して、個人のCR1/E密度を決定することができる。この技術は、研究室で長年使用されており、全身性エリテマトース(SLE)23、後天性免疫不全症候群(AIDS)24、マラリア25、および最近アルツハイマー病(AD)26、27など多くの病態において、赤血球CR1の発現の低下を検出することを可能26に27している。23抗血栓薬28の場合のように、赤血球と結合するCR1を標的とする薬物の開発は、CR1/E密度の評価、およびCR1を定量化するための堅牢な技術の入手可能性を必要とする。
提示されたプロトコルは、1回で実行されます。特定の市販の96ウェルプレートを使用して多くの個人のCR1/Eの密度を決定するために適応可能です(材料表を参照)。この上で、それは任意の96ウェルプレートに私たちの方法を適応させることは容易です。各サンプルについて、赤血球の細胞懸濁液(0.5 x 106-1 x 106赤血球)がウェルごとに分布する。各井戸に対して、最初の一次抗CR1抗体を添加し、次にストレプトアビジンPE、二次抗ストレプトアビジン抗体、および再びストレプトアビジンPEを、我々の方法のものと同じ希釈を用いるが、体積を適応させ、比例性を尊重することによって。
CR1の範囲の被験者および被験者から採検される被験者からの血液サンプルは、同時に採取し、4°Cの冷蔵庫に保存し、4°C(氷上および/または冷蔵庫)で取り扱う必要があります。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:752px;" width="753">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">1000E Barrier Tip</td>
			<td style="width:239px;">Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France</td>
			<td style="width:119px;">2079E</td>
			<td style="width:179px;">sample pipetting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">1-100 &#181;L Bevelled, filter tip</td>
			<td style="width:239px;">Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany</td>
			<td style="width:119px;">S1120-1840</td>
			<td>sample pipetting</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Biotinylated anti-CR1 monoclonal antibody (J3D3)</td>
			<td style="width:239px;">Home production of non-commercial monoclonal antibody, courtesy of Dr J. Cook</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Blouse</td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>protection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bovin serum albumin (7,5%)</td>
			<td style="width:239px;">Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France</td>
			<td style="width:119px;">15260037</td>
			<td>cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:239px;">Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France</td>
			<td style="width:119px;">11176917</td>
			<td>centrifugation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Clean Solution</td>
			<td style="width:239px;">BD, F-38801 Le Pont de Claix, France</td>
			<td style="width:119px;">340345</td>
			<td>cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Comorack-96</td>
			<td style="width:239px;">Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath</td>
			<td style="width:119px;">944060P</td>
			<td>rack</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Cytometer Setup &#38; Tracking Beads Kit</td>
			<td style="width:239px;">BD, F-38801 Le Pont de Claix, France</td>
			<td style="width:119px;">655051</td>
			<td>cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Formaldehyde solution 36.5 %</td>
			<td style="width:239px;">Sigma Aldrich, F-38070 Saint Quentin Fallavier, France</td>
			<td style="width:119px;">F8775-25ML</td>
			<td>Fixation</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">10 &#181;L Graduated, filter tip</td>
			<td style="width:239px;">Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany</td>
			<td style="width:119px;">S1121-3810</td>
			<td>sample pipetting</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">LSRFORTESSA Flow Cytometer</td>
			<td style="width:239px;">BD, F-38801 Le Pont de Claix, France</td>
			<td style="width:119px;">647788</td>
			<td>cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Microman Capillary Pistons</td>
			<td style="width:239px;">Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath</td>
			<td style="width:119px;">067494</td>
			<td>sample pipetting</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Micronic 1.40 mL round bottom tubes</td>
			<td style="width:239px;">Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath</td>
			<td style="width:119px;">MP32051</td>
			<td>mix</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Micropipette Microman - type M25 -</td>
			<td style="width:239px;">Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath</td>
			<td style="width:119px;">066379</td>
			<td>sample pipetting</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Phosphate buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:239px;">Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France</td>
			<td style="width:119px;">10010031</td>
			<td>cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Pipette PS 325 mm, 10 mL</td>
			<td style="width:239px;">Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath</td>
			<td style="width:119px;">391952</td>
			<td>sample pipetting</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">powder-free Nitrile Exam gloves</td>
			<td style="width:239px;">Medline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, USA</td>
			<td style="width:119px;">486802</td>
			<td>sample protection</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Reference 2 pipette, 0,5-10 &#181;L</td>
			<td style="width:239px;">Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France</td>
			<td style="width:119px;">4920000024</td>
			<td>sample pipetting</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Reference 2 pipette, 20-100 &#181;L</td>
			<td style="width:239px;">Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France</td>
			<td style="width:119px;">4920000059</td>
			<td>sample pipetting</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">Reference 2 pipette, 100-1000 &#181;L</td>
			<td style="width:239px;">Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France</td>
			<td style="width:119px;">4920000083</td>
			<td>sample pipetting</td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;">Rinse Solution</td>
			<td style="width:239px;">BD, F-38801 Le Pont de Claix, France</td>
			<td style="width:119px;">340346</td>
			<td>cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;">Round bottom tube</td>
			<td style="width:239px;">Sarstedt, F-70150 Marnay, France</td>
			<td style="width:119px;">55.1579</td>
			<td>cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Safe-Lock Tubes, 1.5 mL</td>
			<td style="width:239px;">Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France</td>
			<td style="width:119px;">0030120086</td>
			<td>mix</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">streptavidin R-PE</td>
			<td style="width:239px;">Tebu Bio, F-78612 Le Perray-en-Yvelines, France</td>
			<td style="width:119px;">AS-60669</td>
			<td>immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:216px;">Tapered Centrifuge Tubes 50 mL</td>
			<td style="width:239px;">Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France</td>
			<td>10203001</td>
			<td>mix</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Vector anti streptavidin biotin</td>
			<td style="width:239px;">Eurobio Ingen, F-91953 Les Ulis, France</td>
			<td style="width:119px;">BA-0500</td>
			<td>immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Vortex-Genie 2</td>
			<td style="width:239px;">Scientific Industries, Inc, Bohemia, NY 111716, USA</td>
			<td style="width:119px;">SI-0236</td>
			<td>mix</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring erythrocyte complement receptor 1 using flow cytometry

CR1(CD35、C3b/C4b用補体受容体1型)は、約200kDaの高分子膜糖タンパク質であり、補体活性化を制御し、免疫複合体を輸送し、体液性および細胞性免疫応答に関与する。CR1は、赤血球を含む多くの細胞型の表面に存在し、長さ、構造(Knops、またはKN、血液群)、および密度において多型を示す。赤血球当たりのCR1(CR1/E)の平均密度は、赤血球当たり500分子である。この密度は、ある個体(100~1,200 CR1/E)、同一個体の赤血球から別の赤血球へと変化する。ここでは、増幅免疫染色システムの助けを借りて、低密度を発現する被験者を含むCR1/Eの密度を測定する堅牢なフローサイトメトリー法を提示する。この方法により、アルツハイマー病(AD)、全身性エリテマトーシス(SLE)、エイズ、マラリアなどの疾患におけるCR1赤血球発現の低下を示す。

CR1の密度が知られている3人の被験者の赤血球("低"被験者[180 CR1/E]、中型の被験者[646 CR1/E]、および「高」被験者[966 CR1/E])、およびCR1密度を決定する必要がある2つの被験者の赤血球は、フィロクロム系を用いて免疫染色された。初めに、低い高い範囲からの被験者のCR1密度は、放射線標識抗体を用いてScatchard法29によって決定された。測定された基準(低、中、高)は、較正曲線...

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Measuring Erythrocyte Complement Receptor 1 Using Flow Cytometry

この方法の目的は、赤血球CR1密度が知られている3人の被験者と比較することによって、任意の被験体の赤血球中のCR1密度を決定することである。この方法は、フィコエリスリン(PE)を用いて増幅系に結合した抗CR1モノクローナル抗体による被験者の赤血球の免疫染色後のフローサイトメトリーを使用する。

フローサイトメトリーを用いた赤血球補体受容体1の測定

CR1 (CD35, Complement Receptor type 1 for C3b/C4b) is a high molecular weight membrane glycoprotein of about 200 kDa that controls complement activation, ...

このプロトコルは、対象となる細胞受容体上の抗原部位の数を測定するために使用することができる。この技術の主な利点は、低密度で発現する受容体に対しても、堅牢な結果を生み出す点である。この方法は、CR1赤血球発現の低下の評価を可能にし、これは、アルツハイマー病、全身性エリテマトーシス、エイズ、マラリアなどのものである。このプロトコルは、細胞受容体密度の解析に有用であり、また蛍光顕微鏡による細胞受容体発現の研究に適用することができる。細胞および抗体の分布の間に管を間隔を空け、可能であれば最初の分析の間に細胞測定の専門家を伴うことをお勧めします。フローサイトメトリーによる免疫染色と密度定量の視覚的実証は、解析パラメータを適切に設定する方法を理解するために重要です。分析を開始する前に、血液貯蔵管から250マイクロリットルのEDTA抗凝固全血を摂氏4度の20ミリリットルのPBS-BSAを含む50ミリリットルの円錐管に加える。管の内容物を優しい反転で混ぜ、遠心分離によって細胞を回転させます。上清を捨てるには10ミリリットルのピペットを使用し、溶液の残留容積のペレットを慎重に再懸濁します。20ミリリットルの冷たいPBS-BSAを加え、再び遠心分離機を加えます。遠心分離の終わりに、チューブをラックに入れ、氷の上に置き、洗浄された赤血球の8マイクロリットルをPBS-BSAの3ミリリットルを含む50ミリリットルのチューブに移します。次いで、赤血球を紡糸して穏やかに混ぜ、均質な細胞懸濁液を得る。赤血球免疫染色の場合、希釈赤血球の100マイクロリットルを個々の1.5ミリリットルチューブに慎重に移し、遠心分離によって赤血球を採取する。上清を捨てた後、PBS-BSAのビオチン化抗CR1 J3D3抗体のマイクロリットル濃度あたり0.5マイクログラムの20マイクロリットルを各ペレットに直接加えます。PBS-BSAバッファーの20マイクロリットルを穏やかな混合で陰性対照細胞に加え、摂氏4度で45分間サンプルをインキュベートします。インキュベーションの終わりに、1回の洗浄ごとに、チューブあたり750マイクロリットルの新鮮なPBS-BSAでサンプルを2回洗浄します。2回目の洗浄後、PBS-BSAのストレプトアビジンフィコエリスリンを1~10マイクロリットル加え、各チューブに穏やかな混合で加え、サンプルを摂氏4度で45分間インキュベートします。インキュベーションの終わりに、実例のようにサンプルを2回洗います。2回目の洗浄後、各細胞サンプルペレットをボルテックス中に450マイクロリットルの固定バッファーで固定し、各サンプルを個々の5ミリリットルの丸底管に移し、摂氏4度で最大48時間保存します。フローサイトメトリーの免疫染色赤血球を解析するには、フローサイトメーターの新しい実験ボタンをクリックし、新しい実験の名前を変更します。サイトメーター設定ウィンドウで、前方散乱、側面散乱、PEを選択します。開いた実験で、サイトメーター設定のアプリケーション設定を選択し、最適化を導くためにグレーのボックスと十字線を使用して、グローバルワークシートを作成します。すべてのパラメータが設定されたら、染色されていないコントロールチューブをサイトメーターにロードして取得を実行し、前方および側面の散乱電圧を最適化して、デブリを排除し、関心のある集団がスケールになるようにします。次に、前方対側散乱プロット上の赤血球の周りにゲートを描き、PE蛍光のドットプロットに赤血球集団を表示する。正の集団がスケール上にある場合は、染色されたコントロールチューブをサイトメーターにロードし、取得を実行します。サンプルを記録して分析するには、染色したサンプルをアンロードし、新しいグローバルワークシートに前方対側散布図とPE蛍光ヒストグラムを作成します。最初のサンプルを細胞メーターにロードし、取得を実行し、前方対側散乱プロットの赤血球の周りに赤血球ゲートを描画します。PE蛍光ヒストグラムで赤血球集団を表示し、統計タブの下で、赤血球集団に関するPE蛍光パラメータの平均を選択する。取得ダッシュボードで、停止ゲート内のすべてのイベントと記録する 10,000 イベントを選択し、[レコード データ] をクリックします。イベント記録が完了したら、サイトメーターからチューブを取り外します。グローバルワークシートのプロットは図のように見えるはずです。既知のCR1濃度の3つの被験者からの免疫染色赤血球のフローサイトメトリック解析は、被検者ごとに標識の平均蛍光強度の測定を可能にする。赤血球CR1の既知の密度を有する対象の値を用いて曲線をプロットすることにより、これらのデータを平均蛍光強度の関数として報告することができる。この曲線から得られる回帰線を他の被験者の平均蛍光強度の値と比較することで、それらのCR1赤血球密度の判定が可能になる。赤血球と抗体が適切に分布しているので、陰性制御上の実験サンプルの較正曲線はサイトメーターの設定の範囲内にあるように注意してください。この手順を適応させることは、単に一次抗体を変更し、増幅層を適応させることによって、他の密度細胞受容体を測定するために可能である。血液を取り扱うときはいつでも、病原体汚染のリスクがあります。したがって、適切な実験室の練習を使用し、適切な個人的な保護具を着用してください。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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50パーセント溶血補体（CHの測定 50</sub血清中>）活動

The complement system is a group of proteins that when activated lead to target cell lysis and facilitates phagocytosis through opsonisation. Individual ...

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

フローサイトメトリーで固定し、生細胞におけるカルパイン活性の測定

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

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ヒトのインビトロ</em免疫バランスの初期状態の認識のためのスクリーニングツールとして>抑制

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

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Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

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Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

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