Name: measuring erythrocyte complement receptor 1 using flow cytometry
Uploaded: 2020-05-19T12:30:00
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Agradecemos a todos os membros da URCACyt, plataforma técnica de citometria de fluxo, equipe do Departamento de Imunologia, e a equipe do Departamento de Medicina Interna e Geriatria, que contribuíram para otimizar e validar o protocolo. Este trabalho foi financiado pelo Reims University Hospitals (número de subvenção AOL11UF9156).

O protocolo de coleta e manuseio de sangue humano foi revisado e aprovado pelo Comitê Regional de Ética (CPP Est II), e o número do protocolo é 2011-A00594-37. Como o protocolo a seguir descreve o manuseio do sangue humano, devem ser seguidas as diretrizes institucionais para o descarte de material bioperigoso. Equipamentos de segurança de laboratório, como jalecos e luvas, devem ser usados.
1. Lavagem de eritrócitos
NOTA: Um dia antes do manuseio, prepare um t...

Várias técnicas estão disponíveis para determinar a densidade do eritrócito CR1 (CR1/E). As primeiras técnicas utilizadas foram a aglutinação de glóbulos vermelhos por anticorpos anti-CR131 e a formação de rosetas na presença de eritrócitos revestidos com C3b32. Estas técnicas rudimentares foram rapidamente substituídas por métodos de imunocoloração usando anticorpos anti-CR1 radiorotulados1,33. Ta...

CR1 (receptor complementar tipo 1, CD35) é uma glicoproteína transmembrana de 200 kDa presente na superfície de muitos tipos de células, tais como eritrócitos1, Linfócitos B2,células monocíticas, algumas células T, células dendríticas foliculares3, ostrócitos fetais4, e podocitos glomerulares5. CR1 interferindo com seus ligantes C3b, C4b, C3bi6,7,8,9, uma subunidade do primeiro componente complementar, C1q10 e MBL (lectina de ligação manan)11 inibe a ativação do complemento e está envolvido na resposta imune humoral e celular.
Em primatas, incluindo humanos, o eritrócito CR1 está envolvido no transporte de complexos imunológicos para o fígado e baço, para purificar o sangue e prevenir seu acúmulo em tecidos vulneráveis como a pele ou rins12,13,14. Este fenômeno de adesão imune entre complexos imunológicos e eritrócitos depende do número de moléculas cr115. Em humanos, a densidade média de CR1/E é de apenas 500 (ou seja, 500 moléculas de CR1 por eritrócito). Essa densidade varia de um indivíduo para outro (100-1.200 CR1/E) e de um eritrócito para outro no mesmo indivíduo. Alguns indivíduos de fenótipo "nulo" expressam menos de 20 CR1/E16.
A densidade de CR1/E é regulada por dois alelos autossômicos co-dominantes ligados a uma mutação de ponto no intron 27 da codificação genética para CR1*117,18. Esta mutação produz um local de restrição adicional para a enzima HindIII. Os fragmentos de restrição obtidos após a digestão com HindIII neste caso são de 7,4 kb para o alelo ligado a uma forte expressão de CR1 (H: alelo alto) e 6,9 kb para o alelo ligado à baixa expressão CR1 (L: alelo baixo). Este elo é encontrado em caucasianos e asiáticos, mas não em pessoas de ascendência africana19.
O nível de expressão do eritrócito CR1 também está correlacionado com a presença de mutações de nucleotídeos pontuais no exon 13 codificando SCR 10 (I643T) e na codificação exon 19 SCR16 (Q981H). É alta em homozigosos 643I/981Q e baixa em indivíduos homozigos os 643T/981H20. Assim, indivíduos "baixos" expressam cerca de 150 CR1/E, indivíduos "médios" expressam cerca de 500 CR1/E e indivíduos "altos" expressam cerca de 1.000 CR1/E.
Além desse polimorfismo de densidade eritrócito, CR1 é caracterizado por um polimorfismo de comprimento correspondente a quatro alotipos de tamanhos diferentes: CR1*1 (190 kDa), CR1*2 (220 kDa), CR1*3 (160 kDa) e CR1*4 (250 kDa)21 e um polimorfismo antigênico correspondente ao grupo sanguíneo KN22.
Apresentamos nosso método baseado na citometria de fluxo para determinar a densidade de CR1/E. Utilizando três sujeitos cuja densidade CR1/E é conhecida, expressando um nível de baixa densidade (180 CR1/E), um nível de densidade média (646 CR1/E) e um nível de alta densidade (966 CR1/E), é fácil medir a intensidade média de fluorescência (Fi) de seus eritrócitos ou glóbulos vermelhos (RBC), ou RBC MFI, após imunocoloração anti-CR1 usando um citometro de fluxo. Pode-se então traçar uma linha padrão representando o MFI em função da densidade CR1/E. Medindo o FI de sujeitos cuja densidade CR1/E não é conhecida e comparando-a a esta linha padrão, é possível determinar a densidade cr1/E dos indivíduos. Esta técnica tem sido utilizada há muitos anos em laboratório, e nos permitiu detectar uma redução na expressão do eritrócito CR1 em muitas patologias como lúpus eritematoso sistêmico (SLE)23, Síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS)24, malária25, e recentemente doença de Alzheimer (AD)26,27. O desenvolvimento de medicamentos voltados para CR1 para acoplamento com eritrócitos, como no caso de drogas antitrombóticas28 requer a avaliação da densidade cr1/E, e a disponibilidade de uma técnica robusta para quantificar CR1.
O protocolo apresentado funciona em singlicato. É adaptável para determinar a densidade de CR1/E em muitos indivíduos que utilizam 96 placas de poços disponíveis comercialmente específicas (ver Tabela de Materiais). Para isso, é fácil adaptar nosso método a qualquer placa de poço 96. Para cada amostra, uma suspensão celular de eritrócitos (0,5 x 106–1 x 106 eritrócitos) é distribuída por poço. Para cada poço, primeiro é adicionado o anticorpo anti-CR1 primário, depois a streptavidin PE, o anticorpo anti-streptavidin secundário, e novamente streptavidin PE, usando as mesmas diluições que as do nosso método, mas adaptando volumes e respeitando a proporcionalidade.
As amostras de sangue dos sujeitos da faixa e dos sujeitos a serem quantificados para CR1 devem ser colhidas ao mesmo tempo, armazenadas na geladeira a 4 °C e manuseadas a 4 °C (no gelo e/ou na geladeira).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:752px;" width="753">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">1000E Barrier Tip</td>
			<td style="width:239px;">Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France</td>
			<td style="width:119px;">2079E</td>
			<td style="width:179px;">sample pipetting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">1-100 &#181;L Bevelled, filter tip</td>
			<td style="width:239px;">Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany</td>
			<td style="width:119px;">S1120-1840</td>
			<td>sample pipetting</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Biotinylated anti-CR1 monoclonal antibody (J3D3)</td>
			<td style="width:239px;">Home production of non-commercial monoclonal antibody, courtesy of Dr J. Cook</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Blouse</td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>protection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bovin serum albumin (7,5%)</td>
			<td style="width:239px;">Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France</td>
			<td style="width:119px;">15260037</td>
			<td>cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:239px;">Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France</td>
			<td style="width:119px;">11176917</td>
			<td>centrifugation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Clean Solution</td>
			<td style="width:239px;">BD, F-38801 Le Pont de Claix, France</td>
			<td style="width:119px;">340345</td>
			<td>cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Comorack-96</td>
			<td style="width:239px;">Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath</td>
			<td style="width:119px;">944060P</td>
			<td>rack</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Cytometer Setup &#38; Tracking Beads Kit</td>
			<td style="width:239px;">BD, F-38801 Le Pont de Claix, France</td>
			<td style="width:119px;">655051</td>
			<td>cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Formaldehyde solution 36.5 %</td>
			<td style="width:239px;">Sigma Aldrich, F-38070 Saint Quentin Fallavier, France</td>
			<td style="width:119px;">F8775-25ML</td>
			<td>Fixation</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">10 &#181;L Graduated, filter tip</td>
			<td style="width:239px;">Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany</td>
			<td style="width:119px;">S1121-3810</td>
			<td>sample pipetting</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">LSRFORTESSA Flow Cytometer</td>
			<td style="width:239px;">BD, F-38801 Le Pont de Claix, France</td>
			<td style="width:119px;">647788</td>
			<td>cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Microman Capillary Pistons</td>
			<td style="width:239px;">Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath</td>
			<td style="width:119px;">067494</td>
			<td>sample pipetting</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Micronic 1.40 mL round bottom tubes</td>
			<td style="width:239px;">Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath</td>
			<td style="width:119px;">MP32051</td>
			<td>mix</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Micropipette Microman - type M25 -</td>
			<td style="width:239px;">Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath</td>
			<td style="width:119px;">066379</td>
			<td>sample pipetting</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Phosphate buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:239px;">Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France</td>
			<td style="width:119px;">10010031</td>
			<td>cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Pipette PS 325 mm, 10 mL</td>
			<td style="width:239px;">Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath</td>
			<td style="width:119px;">391952</td>
			<td>sample pipetting</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">powder-free Nitrile Exam gloves</td>
			<td style="width:239px;">Medline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, USA</td>
			<td style="width:119px;">486802</td>
			<td>sample protection</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Reference 2 pipette, 0,5-10 &#181;L</td>
			<td style="width:239px;">Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France</td>
			<td style="width:119px;">4920000024</td>
			<td>sample pipetting</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Reference 2 pipette, 20-100 &#181;L</td>
			<td style="width:239px;">Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France</td>
			<td style="width:119px;">4920000059</td>
			<td>sample pipetting</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">Reference 2 pipette, 100-1000 &#181;L</td>
			<td style="width:239px;">Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France</td>
			<td style="width:119px;">4920000083</td>
			<td>sample pipetting</td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;">Rinse Solution</td>
			<td style="width:239px;">BD, F-38801 Le Pont de Claix, France</td>
			<td style="width:119px;">340346</td>
			<td>cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;">Round bottom tube</td>
			<td style="width:239px;">Sarstedt, F-70150 Marnay, France</td>
			<td style="width:119px;">55.1579</td>
			<td>cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Safe-Lock Tubes, 1.5 mL</td>
			<td style="width:239px;">Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France</td>
			<td style="width:119px;">0030120086</td>
			<td>mix</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">streptavidin R-PE</td>
			<td style="width:239px;">Tebu Bio, F-78612 Le Perray-en-Yvelines, France</td>
			<td style="width:119px;">AS-60669</td>
			<td>immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:216px;">Tapered Centrifuge Tubes 50 mL</td>
			<td style="width:239px;">Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France</td>
			<td>10203001</td>
			<td>mix</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Vector anti streptavidin biotin</td>
			<td style="width:239px;">Eurobio Ingen, F-91953 Les Ulis, France</td>
			<td style="width:119px;">BA-0500</td>
			<td>immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Vortex-Genie 2</td>
			<td style="width:239px;">Scientific Industries, Inc, Bohemia, NY 111716, USA</td>
			<td style="width:119px;">SI-0236</td>
			<td>mix</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring erythrocyte complement receptor 1 using flow cytometry

CR1 (CD35, Receptor Complementar tipo 1 para C3b/C4b) é uma glicoproteína de membrana de alto peso molecular de cerca de 200 kDa que controla a ativação complementar, transporta complexos imunológicos e participa de respostas imunes humorais e celulares. CR1 está presente na superfície de muitos tipos de células, incluindo eritrócitos, e exibe polimorfismos em comprimento, estrutura (Knops, ou KN, grupo sanguíneo) e densidade. A densidade média de CR1 por eritrócito (CR1/E) é de 500 moléculas por eritrócito. Essa densidade varia de um indivíduo para outro (100-1.200 CR1/E) e de um eritrócito para outro no mesmo indivíduo. Apresentamos aqui um método robusto de citometria de fluxo para medir a densidade de CR1/E, inclusive em sujeitos que expressam baixa densidade, com a ajuda de um sistema de imunocoloração amplificador. Este método nos permitiu mostrar a redução da expressão eritrócito cr1 em doenças como a doença de Alzheimer (DA), lúpus eritematoso sistêmico (LE), AIDS ou malária.

Os eritrócitos de três sujeitos cuja densidade de CR1 é conhecida (sujeito "baixo" [180 CR1/E], sujeito "médio" [646 CR1/E], e "alto" sujeito [966 CR1/E]), e de dois sujeitos cuja densidade cr1 precisava ser determinada foram imunostados por um anticorpo anti-CR1 acoplado a um sistema de amplificação usando o ficoeritrinor No início, a densidade cr1 dos sujeitos da faixa baixa-alta foi determinada pelo método Scatchard29 usando anticorpos rotulados por radiorótulo. As normas (baixa, médi...

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Measuring Erythrocyte Complement Receptor 1 Using Flow Cytometry

O objetivo deste método é determinar a densidade cr1 nos eritrócitos de qualquer sujeito, comparando-se com três sujeitos cuja densidade eritrócito CR1 é conhecida. O método utiliza citometria de fluxo após a imunocoloração dos eritrócitos dos sujeitos por um anticorpo monoclonal anti-CR1 acoplado a um sistema amplificado usando ficoitrina (PE).

Medição do receptor complemento eririotcyte 1 usando citometria de fluxo

CR1 (CD35, Complement Receptor type 1 for C3b/C4b) is a high molecular weight membrane glycoprotein of about 200 kDa that controls complement activation, ...

Este protocolo pode ser usado para medir o número de sítios antigênicos no receptor celular de interesse. A principal vantagem dessa técnica é que ela produz resultados robustos, mesmo para receptores expressos em baixa densidade. Este método permite a avaliação da redução da expressão do eritrócito CR1 e isso é como Alzheimer, lúpus eritematoso sistêmico, AIDS e malária.Este protocolo é útil para qualquer análise da densidade do receptor celular e também pode ser aplicado ao estudo da expressão do receptor celular por microscópio de fluorescência. Recomendamos espaçamento dos tubos durante a distribuição de células e anticorpos, e ser acompanhado por um especialista citométrico durante a primeira análise, se possível. A demonstração visual da quantificação de imunostaining e densidade por citometria de fluxo é fundamental para entender como definir adequadamente os parâmetros de análise.Antes de iniciar a análise, adicione 250 microliters de sódio EDTA anticoagulado sangue inteiro de tubos de armazenamento de sangue em um tubo cônico de 50 mililitros contendo 20 mililitros de quatro graus Celsius PBS-BSA. Misture o conteúdo do tubo por uma inversão suave e gire as células por centrifugação. Use uma pipeta de 10 mililitros para descartar o supernaspe e resuspenque cuidadosamente a pelota no volume residual da solução.Adicione 20 mililitros de PBS-BSA frio e centrifugar as células novamente. No final da centrifugação, coloque o tubo em um rack, colocado no gelo e transfira oito microliters dos eritrócitos lavados em um tubo de 50 mililitros contendo três mililitros de PBS-BSA. Em seguida, misture os eritrócitos suavemente girando para obter uma suspensão celular homogênea.Para imunostaining eritrócito, transfira cuidadosamente 100 microlitadores dos eritrócitos diluídos em tubos individuais de 1,5 mililitro e colete os glóbulos vermelhos por centrifugação. Depois de descartar os supernantes, adicione cuidadosamente 20 microlitadores de uma concentração de 0,5 microgramas por microlitra de anticorpo anti-CR1 J3D3 biotiningado em PBS-BSA, diretamente a cada pelota. Adicione 20 microliters de tampão PBS-BSA sozinho às células de controle negativas com mistura suave e incubar as amostras por 45 minutos a quatro graus Celsius.Ao final da incubação, lave as amostras duas vezes com 750 microliters de PBS-BSA frescos por tubo, por lavagem. Após a segunda lavagem, adicione 20 microlitadores de uma diluição de 1 a 10 de ficoerythrina streptavidina em PBS-BSA a cada tubo com mistura suave, e incubar as amostras por 45 minutos a quatro graus Celsius. No final da incubação, lave as amostras duas vezes, como demonstrado.Após a segunda lavagem, fixe cada pelota de amostra de célula com 450 microliters de tampão de fixação durante o vórtice, antes de transferir cada amostra para tubos de fundo redondos individuais de cinco mililitros por até 48 horas de armazenamento a quatro graus Celsius. Para analisar os eritrócitos imunossuídos para citometria de fluxo, clique no novo botão de experimento no citômetro de fluxo e renomeie o novo experimento. Selecione dispersão para a frente, dispersão lateral e PE na janela de configurações do cítômetro.No experimento aberto, selecione as configurações do aplicativo de configurações de cytómetro e crie uma planilha global, usando as caixas cinzas e os cabelos cruzados para orientar a otimização. Quando todos os parâmetros tiverem sido definidos, carregue o tubo de controle não manchado no citômetro e execute a aquisição, otimizando as tensões de dispersão para frente e lateral para eliminar detritos e garantir que a população de interesse esteja em escala. Em seguida, desenhe um portão em torno das células vermelhas do gráfico de dispersão dianteira versus lateral e mostre a população de glóbulos vermelhos no gráfico de pontos da fluorescência de PE.Se as populações positivas estiverem em escala, carregue o tubo de controle manchado no citômetro e execute a aquisição. Para registrar e analisar amostras, descarregue a amostra manchada e crie um gráfico de dispersão para frente versus lado e um histograma de fluorescência de PE em uma nova planilha global. Carregue a primeira amostra no citômetro, execute a aquisição e desenhe um portão de glóbulos vermelhos ao redor dos eritrócitos no gráfico de dispersão dianteira versus lateral.Exibir a população de glóbulos vermelhos no histograma de fluorescência de PE e sob a guia estatística, selecione a média para os parâmetros de fluorescência de PE em populações de glóbulos vermelhos. No painel de aquisição, selecione todos os eventos no portão de parada e 10.000 eventos para gravar e clique em registrar dados. Quando a gravação do evento estiver concluída, remova o tubo do cítômetro.As tramas globais da planilha devem parecer ilustradas. A análise citométrica de fluxo de eritrócitos imunossuados de três sujeitos de densidades cr1 conhecidas permite medir a intensidade média de fluorescência da rotulagem para cada sujeito. Traçar uma curva usando os valores do sujeito com a densidade conhecida do eritrócito CR1 permite que esses dados sejam relatados em função da intensidade média da fluorescência.A comparação da linha de regressão resultante dessa curva aos valores da intensidade média de fluorescência dos outros sujeitos permite a determinação de sua densidade de eritrócito CR1. Tome cuidado para que os eritrócitos e anticorpos estejam devidamente distribuídos, de modo que as curvas de calibração das amostras experimentadas no controle negativo estão dentro do intervalo das configurações do citômetro. É possível adaptar este procedimento para medir outros receptores celulares de densidade, simplesmente alterando o anticorpo primário e/ou adaptando as camadas de amplificação.Sempre que você está manuseando sangue, há o risco de contaminação de patógenos. Portanto, não deixe de usar boas práticas laboratoriais e usar os equipamentos de proteção individual adequados.

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