Name: measuring erythrocyte complement receptor 1 using flow cytometry
Uploaded: 2020-05-19T12:30:00
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Agradecemos a todos los miembros de la URCACyt, plataforma técnica de citometría de flujo, el personal del Departamento de Inmunología, y el personal del Departamento de Medicina Interna y Geriatría, que contribuyeron a optimizar y validar el protocolo. Este trabajo fue financiado por los hospitales universitarios de Reims (número de subvención AOL11UF9156).

El protocolo para la recolección y el manejo de la sangre humana fue revisado y aprobado por el comité de ética regional (CPP Est II), y el número de protocolo es 2011-A00594-37. Debido a que el siguiente protocolo describe el manejo de la sangre humana, se deben seguir las pautas institucionales para la eliminación de material biopeligroso. Se debe usar equipo de seguridad de laboratorio, como batas de laboratorio y guantes.
1. Lavado de eritrocitos
NOTA: El dí...

Hay varias técnicas disponibles para determinar la densidad del eritrocito CR1 (CR1/E). Las primeras técnicas utilizadas fueron la aglutinación de glóbulos rojos por anticuerpos anti-CR131 y la formación de rosetas en presencia de eritrocitos recubiertos con C3b32. Estas técnicas rudimentarias fueron rápidamente reemplazadas por métodos de inmunomancha utilizando anticuerpos radiomarcados anti-CR11,33. Tambi...

CR1 (receptor de complemento tipo 1, CD35) es una glicoproteína transmembrana de 200 kDa presente en la superficie de muchos tipos de células, tales como eritrocitos1, linfocitos B2, células monocíticas, algunas células T, células dendríticas foliculares3, astrocitos fetales4,y podocitos glomerulares5. CR1 interfiriendo con sus ligandos C3b, C4b, C3bi6,7,8,9, una subunidad del primer componente de complemento, C1q10 y MBL (lectina de unión al mannan)11 inhibe la activación del complemento y participa en la respuesta inmune humoral y celular.
En primates, incluidos los humanos, eritrocitos CR1 participa en el transporte de complejos inmunes al hígado y al bazo, para purificar la sangre y prevenir su acumulación en tejidos vulnerables como la piel o los riñones12,,13,,14. Este fenómeno de adhesión inmune entre complejos inmunes y eritrocitos depende del número de moléculas CR115. En los seres humanos, la densidad media de CR1/E es de sólo 500 (es decir, 500 moléculas de CR1 por eritrocitos). Esta densidad varía de un individuo a otro (100–1,200 CR1/E) y de un eritrocitos a otro en el mismo individuo. Algunos individuos de fenotipo "nulo" expresan menos de 20 CR1/E16.
La densidad de CR1/E está regulada por dos alelos autosómicos codominantes vinculados a una mutación puntual en el intrón 27 de la codificación genética para CR1*117,,18. Esta mutación produce un sitio de restricción adicional para la enzima HindIII. Los fragmentos de restricción obtenidos después de la digestión con HindIII en este caso son 7,4 kb para el alelo vinculado a una fuerte expresión de CR1 (H: alelo alto) y 6,9 kb para el alelo vinculado a la expresión baja de CR1 (L: alelo bajo). Este enlace se encuentra en los caucásicos y asiáticos, pero no en las personas de ascendencia africana19.
El nivel de expresión de eritrocitos CR1 también está correlacionado con la presencia de mutaciones de nucleótidos puntuales en el exón 13 codificando SCR 10 (I643T) y en el exón 19 codificando SCR16 (Q981H). Es alto en individuos homocigotos 643I/981Q y bajos en individuos homocigotos 643T/981H20. Por lo tanto, los individuos "bajos" expresan alrededor de 150 CR1/E, los individuos "medios" expresan alrededor de 500 individuos CR1/E, y los individuos "altos" expresan alrededor de 1,000 CR1/E.
Además de este polimorfismo de densidad de eritrocitos, CR1 se caracteriza por un polimorfismo de longitud correspondiente a cuatro alotipos de diferentes tamaños: CR1*1 (190 kDa), CR1*2 (220 kDa), CR1*3 (160 kDa) y CR1*4 (250 kDa)21 y un polimorfismo antigénico correspondiente al grupo sanguíneo KN22.
Presentamos nuestro método basado en la citometría de flujo para determinar la densidad de CR1/E. Utilizando tres sujetos cuya densidad CR1/E se conoce, expresando un nivel de baja densidad (180 CR1/E), un nivel de densidad media (646 CR1/E) y un nivel de densidad alto (966 CR1/E), es fácil medir la intensidad media de fluorescencia (MFI) de sus eritrocitos o glóbulos rojos (RBC), o RBC MFI, después de la inmunomancha anti-CR1 utilizando un citómetro de flujo. A continuación, se puede trazar una línea estándar que representa la IMF en función de la densidad CR1/E. La medición de la IMF de sujetos cuya densidad CR1/E no se conoce y compararla con esta línea estándar, es posible determinar la densidad CR1/E de los individuos. Esta técnica se ha utilizado durante muchos años en el laboratorio, y nos ha permitido detectar una reducción en la expresión de eritrocitos CR1 en muchas patologías como el lupus eritematoso sistémico (LES)23, síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA)24, malaria25,y recientemente la enfermedad de Alzheimer (AD)26,27. El desarrollo de fármacos dirigidos a CR1 a la pareja de eritrocitos, como en el caso de los fármacos antitrombóticos28 requiere la evaluación de la densidad CR1/E, y la disponibilidad de una técnica robusta para cuantificar CR1.
El protocolo presentado se ejecuta en singlicado. Es adaptable para determinar la densidad de CR1/E en muchas personas utilizando 96 placas de pozo disponibles comercialmente específicas (ver Tabla de Materiales). Para ello, es fácil adaptar nuestro método a cualquier placa de pozo 96. Para cada muestra, se distribuye una suspensión celular de eritrocitos (0,5 x 106–1 x 106 eritrocitos) por pocto. Para cada pozo, primero se añade el anticuerpo primario anti-CR1, luego la estreptavidina PE, el anticuerpo secundario anti-estreptavidina, y de nuevo la estreptavidina PE, utilizando las mismas diluciones que las de nuestro método, pero adaptando los volúmenes y respetando la proporcionalidad.
Las muestras de sangre de los sujetos de la gama y de los sujetos que deben cuantificarse para CR1 deben extraerse al mismo tiempo, almacenarse en el frigorífico a 4 oC y manipularse a 4 oC (sobre hielo y/o en el frigorífico).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:752px;" width="753">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">1000E Barrier Tip</td>
			<td style="width:239px;">Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France</td>
			<td style="width:119px;">2079E</td>
			<td style="width:179px;">sample pipetting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">1-100 &#181;L Bevelled, filter tip</td>
			<td style="width:239px;">Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany</td>
			<td style="width:119px;">S1120-1840</td>
			<td>sample pipetting</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Biotinylated anti-CR1 monoclonal antibody (J3D3)</td>
			<td style="width:239px;">Home production of non-commercial monoclonal antibody, courtesy of Dr J. Cook</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Blouse</td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>protection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bovin serum albumin (7,5%)</td>
			<td style="width:239px;">Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France</td>
			<td style="width:119px;">15260037</td>
			<td>cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:239px;">Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France</td>
			<td style="width:119px;">11176917</td>
			<td>centrifugation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Clean Solution</td>
			<td style="width:239px;">BD, F-38801 Le Pont de Claix, France</td>
			<td style="width:119px;">340345</td>
			<td>cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Comorack-96</td>
			<td style="width:239px;">Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath</td>
			<td style="width:119px;">944060P</td>
			<td>rack</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Cytometer Setup &#38; Tracking Beads Kit</td>
			<td style="width:239px;">BD, F-38801 Le Pont de Claix, France</td>
			<td style="width:119px;">655051</td>
			<td>cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Formaldehyde solution 36.5 %</td>
			<td style="width:239px;">Sigma Aldrich, F-38070 Saint Quentin Fallavier, France</td>
			<td style="width:119px;">F8775-25ML</td>
			<td>Fixation</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">10 &#181;L Graduated, filter tip</td>
			<td style="width:239px;">Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany</td>
			<td style="width:119px;">S1121-3810</td>
			<td>sample pipetting</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">LSRFORTESSA Flow Cytometer</td>
			<td style="width:239px;">BD, F-38801 Le Pont de Claix, France</td>
			<td style="width:119px;">647788</td>
			<td>cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Microman Capillary Pistons</td>
			<td style="width:239px;">Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath</td>
			<td style="width:119px;">067494</td>
			<td>sample pipetting</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Micronic 1.40 mL round bottom tubes</td>
			<td style="width:239px;">Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath</td>
			<td style="width:119px;">MP32051</td>
			<td>mix</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Micropipette Microman - type M25 -</td>
			<td style="width:239px;">Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath</td>
			<td style="width:119px;">066379</td>
			<td>sample pipetting</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Phosphate buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:239px;">Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France</td>
			<td style="width:119px;">10010031</td>
			<td>cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Pipette PS 325 mm, 10 mL</td>
			<td style="width:239px;">Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath</td>
			<td style="width:119px;">391952</td>
			<td>sample pipetting</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">powder-free Nitrile Exam gloves</td>
			<td style="width:239px;">Medline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, USA</td>
			<td style="width:119px;">486802</td>
			<td>sample protection</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Reference 2 pipette, 0,5-10 &#181;L</td>
			<td style="width:239px;">Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France</td>
			<td style="width:119px;">4920000024</td>
			<td>sample pipetting</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Reference 2 pipette, 20-100 &#181;L</td>
			<td style="width:239px;">Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France</td>
			<td style="width:119px;">4920000059</td>
			<td>sample pipetting</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">Reference 2 pipette, 100-1000 &#181;L</td>
			<td style="width:239px;">Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France</td>
			<td style="width:119px;">4920000083</td>
			<td>sample pipetting</td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;">Rinse Solution</td>
			<td style="width:239px;">BD, F-38801 Le Pont de Claix, France</td>
			<td style="width:119px;">340346</td>
			<td>cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;">Round bottom tube</td>
			<td style="width:239px;">Sarstedt, F-70150 Marnay, France</td>
			<td style="width:119px;">55.1579</td>
			<td>cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">Safe-Lock Tubes, 1.5 mL</td>
			<td style="width:239px;">Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France</td>
			<td style="width:119px;">0030120086</td>
			<td>mix</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">streptavidin R-PE</td>
			<td style="width:239px;">Tebu Bio, F-78612 Le Perray-en-Yvelines, France</td>
			<td style="width:119px;">AS-60669</td>
			<td>immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:216px;">Tapered Centrifuge Tubes 50 mL</td>
			<td style="width:239px;">Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France</td>
			<td>10203001</td>
			<td>mix</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Vector anti streptavidin biotin</td>
			<td style="width:239px;">Eurobio Ingen, F-91953 Les Ulis, France</td>
			<td style="width:119px;">BA-0500</td>
			<td>immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Vortex-Genie 2</td>
			<td style="width:239px;">Scientific Industries, Inc, Bohemia, NY 111716, USA</td>
			<td style="width:119px;">SI-0236</td>
			<td>mix</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring erythrocyte complement receptor 1 using flow cytometry

CR1 (CD35, Receptor De complemento tipo 1 para C3b/C4b) es una glicoproteína de membrana de alto peso molecular de unos 200 kDa que controla la activación de complemento, transporta complejos inmunológicos y participa en respuestas inmunitarias humorales y celulares. CR1 está presente en la superficie de muchos tipos de células, incluyendo eritrocitos, y exhibe polimorfismos en longitud, estructura (Knops, o KN, grupo sanguíneo), y densidad. La densidad media de CR1 por eritrocitos (CR1/E) es de 500 moléculas por eritrocitos. Esta densidad varía de un individuo a otro (100–1,200 CR1/E) y de un eritrocitos a otro en el mismo individuo. Presentamos aquí un método de citometría de flujo robusto para medir la densidad de CR1/E, incluso en sujetos que expresan una baja densidad, con la ayuda de un sistema de inmunomancha amplificante. Este método nos ha permitido mostrar la disminución de la expresión de eritrocitos CR1 en enfermedades como la enfermedad de Alzheimer (AD), el lupus eritematoso sistémico (LES), el SIDA o la malaria.

Los eritrocitos de tres sujetos cuya densidad de CR1 se conoce ("sujeto bajo" [180 CR1/E], sujeto "medio" [646 CR1/E] y sujeto "alto" [966 CR1/E]), y de dos sujetos cuya densidad CR1 debía determinarse fueron inmunomanchados por un anticuerpo anti-CR1 acoplado a un sistema de amplificación utilizando la fluoracrotrina fierrín. Al principio, la densidad CR1 de los sujetos del rango bajo-alto fue determinada por el método Scatchard29 utilizando anticuerpos radiomarcados. Los estándares (bajos, ...

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Measuring Erythrocyte Complement Receptor 1 Using Flow Cytometry

El objetivo de este método es determinar la densidad CR1 en los eritrocitos de cualquier sujeto comparando con tres sujetos cuya densidad de eritrocitos CR1 se conoce. El método utiliza citometría de flujo después de la inmunomancha de los eritrocitos de los sujetos por un anticuerpo monoclonal anti-CR1 acoplado a un sistema amplificado utilizando fileeritrina (PE).

Medición del receptor de complemento de eritrocitos 1 mediante citometría de flujo

CR1 (CD35, Complement Receptor type 1 for C3b/C4b) is a high molecular weight membrane glycoprotein of about 200 kDa that controls complement activation, ...

Este protocolo se puede utilizar para medir el número de sitios antigénicos en el receptor celular de interés. La principal ventaja de esta técnica es que produce resultados robustos, incluso para receptores expresados a baja densidad. Este método permite evaluar la reducción de la expresión de eritrocitos CR1 y esto es como la enfermedad de Alzheimer, lupus eritematoso sistémico, SIDA y malaria.Este protocolo es útil para cualquier análisis de la densidad del receptor celular y también se puede aplicar al estudio de la expresión del receptor celular por microscopio de fluorescencia. Recomendamos espaciar los tubos durante la distribución celular y de anticuerpos, y estar acompañados por un especialista citométrico durante el primer análisis si es posible. La demostración visual de la inmunosuferiente y la cuantificación de la densidad por citometría de flujo es fundamental para comprender cómo establecer correctamente los parámetros de análisis.Antes de comenzar el análisis, agregue 250 microlitros de sangre entera anticoagulada EDTA de sodio de tubos de almacenamiento de sangre en un tubo cónico de 50 mililitros que contenga 20 mililitros de cuatro grados Celsius PBS-BSA. Mezclar el contenido del tubo mediante una inversión suave y girar las células por centrifugación. Utilice una pipeta de 10 mililitros para desechar el sobrenadante y resuspender cuidadosamente el pellet en el volumen residual de solución.Añadir 20 mililitros de PBS-BSA frío y centrifugar las células de nuevo. Al final de la centrifugación, coloque el tubo en un estante, colocado sobre hielo y transfiera ocho microlitros de los eritrocitos lavados en un tubo de 50 mililitros que contenga tres mililitros de PBS-BSA. A continuación, mezcle los eritrocitos suavemente girando para obtener una suspensión celular homogénea.Para la inmunosuculación de eritrocitos, transfiera cuidadosamente 100 microlitros de los eritrocitos diluidos a tubos individuales de 1,5 mililitros y recoja los glóbulos rojos por centrifugación. Después de desechar los sobrenadantes, agregue cuidadosamente 20 microlitros de una concentración de 0,5 microgramos por microlitro de anticuerpos anti-CR1 J3D3 biotinilados en PBS-BSA, directamente a cada pellet. Agregue 20 microlitros de tampón PBS-BSA solo a las células de control negativos con una mezcla suave e incubar las muestras durante 45 minutos a cuatro grados centígrados.Al final de la incubación, lave las muestras dos veces con 750 microlitros de PBS-BSA fresco por tubo, por lavado. Después del segundo lavado, añadir 20 microlitros de uno a 10 dilución de fitotrepavitina fitoerythrin en PBS-BSA a cada tubo con mezcla suave, e incubar las muestras durante 45 minutos a cuatro grados Celsius. Al final de la incubación, lave las muestras dos veces, como se ha demostrado.Después del segundo lavado, fije cada pellet de muestra de célula con 450 microlitros de tampón de fijación durante el vórtice, antes de transferir cada muestra a tubos inferiores redondos de cinco mililitros individuales durante hasta 48 horas de almacenamiento a cuatro grados centígrados. Para analizar los eritrocitos inmunotenidos para la citometría de flujo, haga clic en el nuevo botón de experimento en el citometro de flujo y cambie el nombre del nuevo experimento. Seleccione la dispersión hacia delante, la dispersión lateral y el PE en la ventana de configuración del citómetro.En el experimento abierto, seleccione la configuración de la aplicación de configuración del citometro y cree una hoja de trabajo global, utilizando las cajas grises y los pelos cruzados para guiar la optimización. Una vez establecidos todos los parámetros, cargue el tubo de control no manchado en el citometro y ejecute la adquisición, optimizando los voltajes de dispersión hacia delante y lateral para eliminar los residuos y asegurarse de que la población de interés está a escala. A continuación, dibuje una puerta alrededor de los glóbulos rojos en la gráfica de dispersión hacia delante frente a lado y muestre la población de glóbulos rojos en la gráfica de puntos de fluorescencia de PE.Si las poblaciones positivas están a escala, cargue el tubo de control manchado en el citómetro y ejecute la adquisición. Para registrar y analizar muestras, descargue la muestra manchada y cree una gráfica de dispersión hacia delante frente a lado y un histograma de fluorescencia de PE en una nueva hoja de trabajo global. Cargue la primera muestra en el citometro, ejecute la adquisición y dibuje una puerta de glóbulos rojos alrededor de los eritrocitos en la gráfica de dispersión hacia adelante frente a lado.Muestre la población de glóbulos rojos en el histograma de fluorescencia de PE y, en la pestaña de estadísticas, seleccione la media para los parámetros de fluorescencia de PE en las poblaciones de glóbulos rojos. En el panel de adquisición, seleccione todos los eventos en la puerta de detención y 10.000 eventos para registrar y haga clic en los datos de registro. Cuando se haya completado la grabación del evento, retire el tubo del citometro.Las gráficas de hoja de cálculo global deben tener el aspecto que se ilustra. El análisis citométrico de flujo de eritrocitos inmunotenidos de tres sujetos de densidades CR1 conocidas permite medir la intensidad media de fluorescencia del etiquetado para cada sujeto. La gráfica de una curva utilizando los valores del sujeto con la densidad conocida de eritrocitos CR1 permite que estos datos se notifiquen como una función de la intensidad media de fluorescencia.La comparación de la línea de regresión resultante de esta curva con los valores de la intensidad media de fluorescencia de los otros sujetos permite determinar su densidad de eritrocitos CR1. Tenga cuidado de que los eritrocitos y anticuerpos estén distribuidos correctamente, por lo que las curvas de calibración de las muestras experimentadas en el control negativo están dentro del rango de los ajustes del citómetro. Es posible adaptar este procedimiento para medir otros receptores celulares de densidad, simplemente cambiando el anticuerpo primario y/o adaptando las capas de amplificación.Siempre que esté manejando sangre, existe el riesgo de contaminación por patógenos. Por lo tanto, asegúrese de utilizar buenas prácticas de laboratorio y de usar el equipo de protección personal adecuado.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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The complement system is a group of proteins that when activated lead to target cell lysis and facilitates phagocytosis through opsonisation. Individual ...

Investigación

Inmunología e Infección

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Medición de la actividad calpaína en células fijadas y vivir por citometría de flujo

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

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Humano In Vitro Supresión como herramienta de cribado para el reconocimiento de un estado inicial de desequilibrio inmunológico

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

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