Name: magnetic adjustment of afterload in engineered heart tissues
Uploaded: 2020-05-05T13:30:00
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作者感谢朱塔·斯塔巴蒂在组织文化工作方面的支持，阿克塞尔·基希霍夫的摄影，爱丽丝·卡萨格兰德·塞斯科内托的编辑工作，以及特别感谢贝伦特·阿克塞希尔利奥卢在开发该设备方面提供技术支持。B.B.由德国心血管研究中心（德国心血管研究中心）学者格兰特、惠特克国际博士后学者格兰特和M.N.H.基金支持。

1. 准备装后调谐平台
注：协议中这一部分涉及的步骤不区分时间。
<ol><li>制造磁力响应式硅胶机架 注：这些机架是 EHT 的培养平台。每个 EHT 悬浮在两个硅胶柱之间，这些硅胶柱会向组织提供后负荷。后载的程度与这些柱子的刚度直接相关。要启用磁后负载调谐，某些柱子需要磁响应。<ol>
<li>获取硅胶柱的 24 孔板兼容机架（补充图 1?...

<ol>
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N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetics-Based+Approach+for+Fine-Tuning+Afterload+in+Engineered+Heart+Tissues.">Magnetics-Based Approach for Fine-Tuning Afterload in Engineered Heart Tissues.</a> ACS Biomaterials Science &amp; Engineering. 5 (7), 3663-3675 (2019).</li><li>Mannhardt, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Contraction+Analysis+of+Human+Engineered+Heart+Tissue+for+Cardiac+Drug+Safety+Screening.">Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (122), e55461 (2017).</li></ol>

本文概述的协议描述了一种在工程心脏组织中磁改变后负荷的新技术。该技术依靠压电级将一盘强磁体转化为硅胶柱的磁响应式机架。两组磁铁越接近，EHT 在它们上培养的后负载就越强。
有几个步骤对于此系统的成功生产和使用至关重要。在制造磁响应硅胶机架时，确保柱体内的所有磁体都以相同的极性定向至关重要。如果磁体置于相反的方向，它将削弱而不是增强磁场的?...

后负荷是心室收缩负荷后，它已经开始弹出血液1。在心脏发育期间，适当的后负荷对心肌酸成熟至关重要2。在成年后，心室后负荷水平低（例如，在卧床不起的脊髓损伤3或非常特殊的情况下，如太空飞行4）可能导致心脏萎缩。相反，高后负荷可能导致心脏肥大5。虽然耐力运动员或孕妇的心脏肥大被认为是有益的和生理的，与长期动脉高血压或严重的主动脉瓣狭窄相关的肥大是有害的，因为它容易导致心脏心律失常和心力衰竭6。虽然心力衰竭患者的5年死亡率从20世纪80年代的70%下降到目前的40-50%7，但仍然非常需要新的治疗方案7，以治疗这种高度普遍的情况（目前占西方人口的2.2%）8。8
为了研究病理性心脏肥大的分子机制，并测试治疗这种疾病的预防或治疗策略，在体内已经开发了99，10，11，12。10,11,12虽然这些模型提供了有益的见解后负荷对心室性能的影响，他们不允许精细控制后负荷幅度。或者，对切除心脏和肌肉制剂进行后负荷的体外研究可以更精细地控制组织负荷，但这些模型不利于纵向研究13、14、15。13,14,15
为了克服这些问题，我们开发了工程心脏组织（EHTs）16、17中高后负荷的体16,17外模型。该模型是一种三维培养格式，用于嵌入在柔性空心硅胶柱之间悬浮在纤维蛋白基质中的大鼠心脏细胞。这些组织自发地跳动（对抗硅胶柱的电阻），并执行辅助性工作。在以前的实验中，通过将硬金属支架插入空心硅胶柱，将应用于 EHT 的后负载增加了 12 倍，这导致了许多变化，病理性心脏肥大的特点18，19，20：心肌细胞肥大，部分肾病，收缩力下降，组织放松受损，胎儿基因计划的恢复，代谢转变从脂肪酸氧化到厌氧糖解，以及纤维化增加。18,19,20虽然这个程序已经成功地应用于几项研究17，21，22，它有一些缺点。17,21,22卸载后只有两种状态，即低或非常高（12 倍），该过程需要手动处理 EHT，这限制了其时间灵活性，并带来了污染风险。
最近，Leonard等人使用类似的技术来调节在硅胶柱23上培养的EHT的后负荷。不同长度的支架被放置在柱子外侧，以限制其弯曲运动。这项研究的作者报告说，负载的中度单次增加增强了人类iPS衍生EHT的力发展和成熟，而高负荷则导致病理状态。然而，与我们自己的系统类似，这种技术只允许后负载的奇异增加，其大小由大括号的长度决定。因此，使用这些技术，无法对后装进行细微的改动、随时间而改变后装和精确的装载方案。
在这里，我们为一个可用于调节后电阻的系统提供了协议，即电磁24的EHT后负载。该平台便于对后装进行微调，启用用户定义的后加载方案，并确保 EHT 无菌性。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cylindrical plate magnets</td>
			<td>HKCM</td>
			<td>9962-55184</td>
			<td>h = 14 mm, d = 13 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cylindrical post magnets</td>
			<td>HKCM</td>
			<td>9962-63571</td>
			<td>h = 2 mm, d = 0.5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental wire</td>
			<td>Ormco</td>
			<td>266-1316</td>
			<td>d = 0.016 inches (0.406 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad</td>
			<td>GraphPad Software, La Jolla, California, USA</td>
			<td>version 6.00 for Windows</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motion control software for piezo motor</td>
			<td>Micronix USA</td>
			<td></td>
			<td>free download on manufacturer homepage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motion controller for piezo motor</td>
			<td>Micronix USA</td>
			<td>MMC-100-01000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical contractility analysis platform</td>
			<td>EHT technologies</td>
			<td>A0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piezoelectric linear motor</td>
			<td>Micronix USA</td>
			<td>PPS-20-15206</td>
			<td>fitted with linear optical encoder, incubator-environment compatible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Styrene Rod</td>
			<td>Plastruct</td>
			<td>MR-15</td>
			<td>d= 0.015 inches (0.381 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB camera</td>
			<td>Reichelt Elektronik</td>
			<td>REFLECTA 66142</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

magnetic adjustment of afterload in engineered heart tissues

后负荷是已知的推动生理和病理性心脏状态的发展。因此，研究改变后负荷状态的结果可以对控制这些关键过程的机制产生重要的见解。然而，目前缺乏一种实验技术，可以精确微调心脏组织中随时间的后负荷。本文介绍了一种基于磁性的新技术，用于在工程心脏组织（EHTs）中实现这种控制。为了产生磁响应的 EHT （MR-EHT），组织安装在空心硅胶柱上，其中一些它们含有小型永磁体。第二组永磁体被压入丙烯酸板中，因此它们以相同的极性定向，并与后磁体轴向对齐。为了调整后载，使用装有编码器的压电级从后磁体（更高的后负载）或离去（较低的后负载）上转换此板磁铁。用于调整阶段定位的运动控制软件允许开发用户定义的后加载方案，而编码器可确保该阶段纠正其位置中的任何不一致。本工作描述了该系统的制造、校准和实施，以便在全球其他实验室开发类似的平台。包括两个独立实验的代表性结果，以举例说明可使用此系统进行的不同研究的范围。

磁铁后刚度量化 水平定向磁响应硅胶柱安装在固定位置，轴向对齐校准磁体被放置在与该柱子的多个定义距离（"磁体间距"）处。已知重量的测试载荷从硅胶柱的末端悬挂，导致该柱弯曲。这种偏转在光学上被量化。在所有磁体间距上观察到测试载荷的引力与产生的后偏转之间的线性关系（图6A）。从这些线性关系派生的刚度值遵循负指数趋势，磁体间距增大...

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Magnetic Adjustment of Afterload in Engineered Heart Tissues

该协议提供了详细的方法，描述了基于磁性的后负荷调谐平台的制造和实现，用于工程心脏组织。

工程心脏组织中后负荷的磁调节

Afterload is known to drive the development of both physiological and pathological cardiac states. As such, studying the outcomes of altered afterload ...

该系统可用于将工程心脏组织暴露在各种后负荷方案内，以研究这些刺激对组织力发育、重塑和成熟的影响。我们的技术允许人们精确地将跳动的组织在长时间的培养中接受广泛的可定制后加载程序，甚至无需打开细胞培养板。我们的方法可以修改，以控制其他肌肉组织培养系统的后加载，如骨骼肌，平滑肌肉或切除的皮毛肌。由于我们的系统方法相当独特，具有许多科学家不熟悉的技术方面，视觉演示可能有助于重新创建我们的设置。为了制造磁响应硅胶机架，获得文本协议中描述的24个井板可以划桨硅胶柱架。使用固定的极性，用水润滑磁铁，并一次插入一个到硅胶架的最外层柱上。使用一块混合的不锈钢牙线小心地将它们推到空心柱腔的底部。每个柱上最多可以堆叠五块磁铁。使用圆鼻钳将不锈钢牙线弯曲成宽 11.25 毫米、长 15 毫米的支架。为了确保实现正确的尺寸，可以使用自制夹具来帮助电线弯曲，然后使用钢丝切割机切割大括号和文件来平滑切割表面。用水润滑支架或柱子，并将其插入硅胶架中，在工艺中将第二个和第三个支架固定到最外层的柱子上。开始准备后加载调谐装置，如文本协议所述，使用非磁性材料连接到压电级，这可以使用L形铝片实现。为了能够对组织进行可视化分析，请安装后加载调谐装置中的光源。这里使用了一系列LED，从下面照亮工程师的心脏组织。要校准后加载调节系统，请使用非磁性材料安装其中一个硅胶机架并垂直安装，以便磁响应硅胶柱水平定向。现在，将其中一块板磁铁安装在水平行驶的线性舞台上，以便与磁响应柱轴向对齐。使用水平级将校准磁体与磁响应硅胶柱定位为一定距离。将摄像机放在此设置的一侧，以便能够在测试负载的影响下以光学速度记录柱子偏转。确保柱下方有足够的空间，以便附加的负载自由悬挂。在没有任何权重的情况下拍摄帖子的照片，用作职位中性位置的参考。在不更改相机透视的情况下，将其中一个负载连接到硅胶柱的末尾，然后在重量的影响下拍摄后弯曲的照片。现在绘制 x 轴上的硅胶柱对 y 轴上每个测试重量的重力的偏转图。这应该产生力和偏转之间的线性关系。绘制通过 00 的线性回归函数和获取数据。此功能的斜率是受测试磁铁间距下磁响应硅胶柱的刚度 k。在 dmax 和 dmin 之间的几个间距下重复这些步骤。这里对8个不同的磁体位置的偏转进行了分析，从大约31毫米到5毫米不等。通过这些值实现大量回归函数。例如，在分析软件中使用非线性拟合、一相衰减函数。此回归函数描述磁体间距和后荷载之间的关系。要准备后加载调谐装置进行实验，请将压电级电机连接到运动控制器，然后将运动控制器连接到计算机。确保运动控制器也连接到电源。然后启动运动控制器平台软件，在安装运动控制软件时选择指定为舞台板的端口，将软件连接到压电级电机，然后单击打开端口按钮。转到系统面板，在"循环下拉菜单"中选择"开环"。手动将磁板移动到其最高位置，尽可能接近的磁体间距 dmin。磁铁板应与培养板支座接触。现在转到运动面板，如零按钮，将压电级阶段的当前位置重置为零毫米。手动将磁叶片移动到其最低可能的位置，记下编码器位置以确定压电级电机的运动范围。将系统面板中的行驶限制设置为上一步中确定的运动范围内的值。这样可以防止磁铁刀片撞到培养片或后加载调谐设备的底部。再次，将磁铁刀片移动到其最高位置，然后单击零按钮。转到系统面板并将反馈循环模式更改为闭环，这样做可确保阶段将纠正其定位中的任何错误。单击存储参数框中的保存按钮，将这些设置存储在系统中。现在，将包含工程心脏组织的 24 井培养板放在培养板支架上的磁性响应硅胶机架上。要计算实现所需后荷载所需的磁体间距，请求解较早确定的 d 非线性回归函数。从计算的磁体间距中减去 dmin， d.结果是磁板必须从零位置行驶的距离，以实现所需的后荷载。在"运动"面板中的"目标位置一个输入"字段中键入此值，然后单击"转到"以将工程心脏组织的后加载量调整为计算值。控制由大鼠心脏产生的 MREHT 在磁后加载的情况下培养，直到达到收缩力的高原。在这一天，MREHTs和受控的 EHTs 具有类似的均值力。在接下来的一周里，对 MREHT 的后载量从点 91 增加到 6 点 8 5 毫米，而控制 EHT 的后载量保持不变。平均收缩力增加与后载量增加，高达点95毫纽顿，这标志着超过三倍的力增加相比，测量的受控 1，6月。另一方面，与控制组织相比，后偏转减少。在培养的最后一天，MREHTs测量的主要偏转只有点一毫米，而点四八毫米控制EHT。磁响应硅胶柱上的 Rad EHTs 以最小后负载培养，每毫米 9 点 1 毫微吨，直到达到稳定强度和收缩力。从这一天起，MREHTs经历了7天的后装方案，使EHT暴露在每毫米第9点1和6点8毫米之间交替的后载循环中。在整个培养期间，控制 EHT 的后负载在每毫米 6 点零毫新吨保持不变。观察到的差异在统计学上没有显著性。结合光学收缩分析，该方法可实时测量对余震波动幅度的短期收缩反应，对研究生理肌肉特性有一定作用。强磁铁可能会突然相互粘附，可能会对用户造成伤害并损坏磁铁本身，以避免这种情况，使磁铁在安全距离内保持分离。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

在胚胎小鼠心脏采用免疫荧光心肌发展分析

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

科研

发育生物学

Improved Generation of Induced Cardiomyocytes Using a Polycistronic Construct Expressing Optimal Ratio of Gata4, Mef2c and Tbx5

诱发心肌细胞的使用多顺反子构建表达GATA4，MEF2C和Tbx5中的最优比率改善发电

Direct conversion of cardiac fibroblasts (CFs) into induced cardiomyocytes (iCMs) holds great potential for regenerative medicine by offering alternative ...

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

心脏分化的表观遗传调控胚胎干细胞和组织

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

Maturation of Human Stem Cell-derived Cardiomyocytes in Biowires Using Electrical Stimulation

使用电刺激人干细胞衍生的心肌细胞的成熟中Biowires

Human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hPSC-CMs) have been a promising cell source and have thus encouraged the investigation of their ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

脊髓培养法研究胚胎鸡组织的发展

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart

纳米粒子介导的 siRNA 基因沉默在斑马鱼心脏中的表达

Mammals have a very limited capacity to regenerate the heart after myocardial infarction. On the other hand, the adult zebrafish regenerates its heart ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone

小鼠颅面组织和未切除骨骼的组织制备及免疫染色

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

基于微注射的免疫胚胎心肌细胞体内植入系统

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

In Vitro Generation of Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells

小鼠心脏场特定心脏祖细胞的体外生成

Pluripotent stem cells offer great potential for understanding heart development and disease and for regenerative medicine. While recent advances in ...

Analysis of Congenital Heart Defects in Mouse Embryos Using Qualitative and Quantitative Histological Methods

使用定性和定量组织方法对小鼠胚胎先天性心脏缺陷的分析

Congenital heart defects (CHD) are the most common type of birth defect in humans, affecting up to 1% of all live births. However, the underlying causes ...