Name: magnetic adjustment of afterload in engineered heart tissues
Uploaded: 2020-05-05T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Magnetic Adjustment of Afterload in Engineered Heart Tissues at JoVE.com

Forfatterne takker Jutta Starbatty for hendes støtte i vævkultur arbejde, Axel Kirchhof for fotografering, Alice Casagrande Cesconetto for redigering arbejde, og en særlig tak til Bülent Aksehirlioglu for teknisk støtte i udviklingen af denne enhed. B.B. blev støttet af en DZHK (tysk Center for Cardiovascular Research) Scholar Grant, M.L.R. af en Whitaker International Postdoctoral Scholar Grant og M.N.H. med midler fra DZHK.

1. Forberedelse af efterbelastningsindstillingsplatformen
BEMÆRK: De trin, der er involveret i denne del af protokollen, er ikke tidsfølsomme.
<ol><li>Fremstilling af magnetisk responsive silikonestativer BEMÆRK: Disse stativer fungerer som kulturplatform for EHT'er. Hver EHT er suspenderet mellem to silikone stillinger, som giver efterbelastning til vævet. Graden af efterbelastning er direkte relateret til stivheden af disse stillinger. For at muligg...

<ol>
	<li>Zipes, D. P., Libby, P., Bonow, R. O., Mann, D. L., Tomaselli, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Braunwald's Heart Disease: A Textbook of Cardiovascular Medicine. 11th edn. , (2018).</li><li>McCain, M. L., Yuan, H., Pasqualini, F. S., Campbell, P. H., Parker, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+elasticity+regulates+the+optimal+cardiac+myocyte+shape+for+contractility.">Matrix elasticity regulates the optimal cardiac myocyte shape for contractility.</a> American Journal of Physiology- Heart and Circulatory Physiology. 306 (11), 1525-1539 (2014).</li><li>de Groot, P. C., van Dijk, A., Dijk, E., Hopman, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preserved+cardiac+function+after+chronic+spinal+cord+injury.">Preserved cardiac function after chronic spinal cord injury.</a> Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 87 (9), 1195-1200 (2006).</li><li>Perhonen, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+atrophy+after+bed+rest+and+spaceflight.">Cardiac atrophy after bed rest and spaceflight.</a> Journal of Applied Physiology. 91 (2), 645-653 (2001).</li><li>Levy, D., Larson, M. G., Vasan, R. S., Kannel, W. B., Ho, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+progression+from+hypertension+to+congestive+heart+failure.">The progression from hypertension to congestive heart failure.</a> Journal of the American Medical Association. 275 (20), 1557-1562 (1996).</li><li>Levy, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+trends+in+the+incidence+of+and+survival+with+heart+failure.">Long-term trends in the incidence of and survival with heart failure.</a> The New England Journal of Medicine. 347 (18), 1397-1402 (2002).</li><li>Maggioni, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EURObservational+Research+Programme:+regional+differences+and+1-year+follow-up+results+of+the+Heart+Failure+Pilot+Survey+(ESC-HF+Pilot).">EURObservational Research Programme: regional differences and 1-year follow-up results of the Heart Failure Pilot Survey (ESC-HF Pilot).</a> European Journal of Heart Failure. 15 (7), 808-817 (2013).</li><li>Mozaffarian, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+disease+and+stroke+statistics--2015+update:+a+report+from+the+American+Heart+Association.">Heart disease and stroke statistics--2015 update: a report from the American Heart Association.</a> Circulation. 131 (4), 29 (2015).</li><li>Klautz, R. J., Teitel, D. F., Steendijk, P., van Bel, F., Baan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+afterload+and+contractility+in+the+newborn+heart:+evidence+of+homeometric+autoregulation+in+the+intact+circulation.">Interaction between afterload and contractility in the newborn heart: evidence of homeometric autoregulation in the intact circulation.</a> Journal of the American College of Cardiology. 25 (6), 1428-1435 (1995).</li><li>Liedtke, A. J., Pasternac, A., Sonnenblick, E. H., Gorlin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+canine+ventricular+dimensions+with+acute+changes+in+preload+and+afterload.">Changes in canine ventricular dimensions with acute changes in preload and afterload.</a> The American Journal of Physiology. 223 (4), 820-827 (1972).</li><li>Toischer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+cardiac+remodeling+in+preload+versus+afterload.">Differential cardiac remodeling in preload versus afterload.</a> Circulation. 122 (10), 993-1003 (2010).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Hypertrophy+and+Increased+Susceptibility+to+Spontaneous+Calcium-Release+of+Rat+Left+Atrial+Myocytes+Due+to+Elevated+Afterload.">Cellular Hypertrophy and Increased Susceptibility to Spontaneous Calcium-Release of Rat Left Atrial Myocytes Due to Elevated Afterload.</a> PloS one. 10 (12), 0144309 (2015).</li><li>Hori, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loading+sequence+is+a+major+determinant+of+afterload-dependent+relaxation+in+intact+canine+heart.">Loading sequence is a major determinant of afterload-dependent relaxation in intact canine heart.</a> The American Journal of Physiology. 249, 747-754 (1985).</li><li>Schotola, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contractile+adaption+to+preload+depends+on+the+amount+of+afterload.">The contractile adaption to preload depends on the amount of afterload.</a> ESC Heart Failure. 4 (4), 468-478 (2017).</li><li>Sonnenblick, E. H., Downing, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Afterload+as+a+primary+determinat+of+ventricular+performance.">Afterload as a primary determinat of ventricular performance.</a> The American Journal of Physiology. 204, 604-610 (1963).</li><li>Hirt, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+afterload+induces+pathological+cardiac+hypertrophy:+a+new+in+vitro+model.">Increased afterload induces pathological cardiac hypertrophy: a new in vitro model.</a> Basic Research in Cardiology. 107 (6), 307 (2012).</li><li>Hirt, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+microRNA+signature+of+pathological+cardiac+hypertrophy+by+engineered+heart+tissue-+and+sequencing-technology.">Deciphering the microRNA signature of pathological cardiac hypertrophy by engineered heart tissue- and sequencing-technology.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 81, 1-9 (2015).</li><li>Dorn, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fuzzy+logic+of+physiological+cardiac+hypertrophy.">The fuzzy logic of physiological cardiac hypertrophy.</a> Hypertension. 49 (5), 962-970 (2007).</li><li>Hill, J. A., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+plasticity.">Cardiac plasticity.</a> The New England Journal of Medicine. 358 (13), 1370-1380 (2008).</li><li>Maillet, M., van Berlo, J. H., Molkentin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+physiological+heart+growth:+fundamental+concepts+and+new+players.">Molecular basis of physiological heart growth: fundamental concepts and new players.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (1), 38-48 (2013).</li><li>Stenzig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+in+an+engineered+heart+tissue+model+of+cardiac+hypertrophy:+common+signatures+and+effects+of+DNA+methylation+inhibitors.">DNA methylation in an engineered heart tissue model of cardiac hypertrophy: common signatures and effects of DNA methylation inhibitors.</a> Basic Research in Cardiology. 111 (1), 9 (2016).</li><li>Werner, T. R., Kunze, A. C., Stenzig, J., Eschenhagen, T., Hirt, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blockade+of+miR-140-3p+prevents+functional+deterioration+in+afterload-enhanced+engineered+heart+tissue.">Blockade of miR-140-3p prevents functional deterioration in afterload-enhanced engineered heart tissue.</a> Scientific Reports. 9 (1), 11494 (2019).</li><li>Leonard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Afterload+promotes+maturation+of+human+induced+pluripotent+stem+cell+derived+cardiomyocytes+in+engineered+heart+tissues.">Afterload promotes maturation of human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes in engineered heart tissues.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 118, 147-158 (2018).</li><li>Rodriguez, M. L., Werner, T. R., Becker, B., Eschenhagen, T., Hirt, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetics-Based+Approach+for+Fine-Tuning+Afterload+in+Engineered+Heart+Tissues.">Magnetics-Based Approach for Fine-Tuning Afterload in Engineered Heart Tissues.</a> ACS Biomaterials Science &amp; Engineering. 5 (7), 3663-3675 (2019).</li><li>Mannhardt, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Contraction+Analysis+of+Human+Engineered+Heart+Tissue+for+Cardiac+Drug+Safety+Screening.">Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (122), e55461 (2017).</li></ol>

Protokollen skitseret heri beskriver en ny teknik til magnetisk ændre efterbelastning i manipuleret hjertevæv. Denne teknik er afhængig af brugen af en piezoelektrisk fase til at oversætte en plade af stærke magneter mod og væk fra magnetisk lydhør stativer af silikone stillinger. Jo tættere de to sæt magneter er, jo stærkere er efterbelastningen, som EHT'erne har dyrket på dem.
Der er flere trin, der er afgørende for en vellykket produktion og brug af dette system. Mens fremstilli...

Efterbelastning er den systoliske belastning på hjertekammer, efter at det er begyndt at skubbe blod1. Under hjerteudvikling er en passende efterbelastning af afgørende betydning for kardiomyocytmodning2. I voksenalderen kan lave niveauer af ventrikulær efterbelastning (f.eks. hos sengeliggende patienter med rygmarvsskade på højt niveau3 eller i meget specielle tilfælde som rumflyvning4) resultere i hjertebenådende hypotrofi. Omvendt kan høj efterbelastning føre til hjertehypertrofi5. Mens hjertehypertrofi i udholdenhed atleter eller gravide kvinder anses for gavnlige og fysiologiske, hypertrofi forbundet med langvarig arteriel hypertension eller svær aortaklappen stenose er skadelig, da det prædisponerer en til hjertearytmier og hjertesvigt6. Selv om den 5-årige dødelighed for hjertesvigt patienter er faldet fra ~ 70% i 1980'erne6 til 40-50%7 i øjeblikket, er der stadig et stort behov for nye terapeutiske behandlingsmuligheder for denne meget udbredte tilstand (i øjeblikket 2,2% af befolkningen i den vestlige verden)8.
For at undersøge de molekylære mekanismer i patologisk hjertehypertrofi og for at teste forebyggende eller terapeutiske strategier til behandling af denne sygdom er der udviklet in vivo-modeller for efterbelastning9,10,11,12. Mens disse modeller har tilbudt gavnlig indsigt i virkningerne af efterbelastning på ventrikulær ydeevne, de giver ikke mulighed for fin kontrol over efterbelastning størrelsesorden. Alternativt giver in vitro-undersøgelser af efterbelastning udført på udsathjertede hjerter og muskelpræparater mulighed for bedre kontrol over vævsbelastning, men disse modeller er ikke befordrende for langsgående undersøgelser13,14,15.
For at overvinde disse problemer, vi udviklet en in vitro model af forhøjet efterbelastning i manipuleret hjertevæv (EHTs)16,17. Denne model er en 3-dimensionel kultur format for rotte hjerteceller indlejret i en fibrin matrix suspenderet mellem fleksible hule silikone stillinger. Disse væv slå spontant (mod modstanden af silikone stillinger) og udføre auxotoniske arbejde. Vi har øget efterbelastningen anvendt på EHTs med en faktor på 12 i tidligere forsøg ved indsættelse af stive metal seler i den hule silikone stillinger i en uge. Dette førte til et væld af ændringer, karakteristisk for patologisk hjertehypertrofi18,19,20: kardiomyocyt hypertrofi, delvis necroptosis, et fald i kontraktile kraft, svækkelseaf væv afslapning, reaktivering af fosterets genprogram, en metabolisk skift fra fedtsyre oxidation til anaerob glykolyse, og en stigning i fibrose. Selv om denne procedure har været med succes ansat i flere undersøgelser17,21,22, det har nogle ulemper. Der er kun to tilstande, lav eller meget høj (12 gange) efterbelastning, og proceduren kræver manuel håndtering af EHT'erne, hvilket begrænser dens tidsmæssige fleksibilitet og udgør en risiko for forurening.
For nylig, Leonard et al. brugt en lignende teknik til at modulere efterbelastning i EHTs kulturerede på silikone stillinger23. Seler af varierende længder blev placeret omkring ydersiden af stolperne for at begrænse deres bøjning bevægelse. Forfatterne af denne undersøgelse rapporterede, at en enestående lille til mellemstor stigning i belastningen forbedret kraft udvikling og modning af menneskelige iPS-afledte EHTs, mens højere belastninger resulterede i en patologisk tilstand. Men i lighed med vores eget system, denne teknik kun giver mulighed for ental stigninger i efterbelastning, hvis størrelsesorden er dikteret af længden af seler. Som sådan, fine ændringer i efterbelastning, ændringer i efterbelastning over tid, og præcis lastning regimer er ikke muligt med disse teknikker.
Her leverer vi protokollen for et system, der kan bruges til at modulere post-modstand, dvs efterladning af EHTs magnetisk24. Denne platform letter finjusteringen af efterlæsning, muliggør brugerdefinerede efterbelastningsregimer og sikrer EHT-sterilitet.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cylindrical plate magnets</td>
			<td>HKCM</td>
			<td>9962-55184</td>
			<td>h = 14 mm, d = 13 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cylindrical post magnets</td>
			<td>HKCM</td>
			<td>9962-63571</td>
			<td>h = 2 mm, d = 0.5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental wire</td>
			<td>Ormco</td>
			<td>266-1316</td>
			<td>d = 0.016 inches (0.406 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad</td>
			<td>GraphPad Software, La Jolla, California, USA</td>
			<td>version 6.00 for Windows</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motion control software for piezo motor</td>
			<td>Micronix USA</td>
			<td></td>
			<td>free download on manufacturer homepage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motion controller for piezo motor</td>
			<td>Micronix USA</td>
			<td>MMC-100-01000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical contractility analysis platform</td>
			<td>EHT technologies</td>
			<td>A0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piezoelectric linear motor</td>
			<td>Micronix USA</td>
			<td>PPS-20-15206</td>
			<td>fitted with linear optical encoder, incubator-environment compatible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Styrene Rod</td>
			<td>Plastruct</td>
			<td>MR-15</td>
			<td>d= 0.015 inches (0.381 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB camera</td>
			<td>Reichelt Elektronik</td>
			<td>REFLECTA 66142</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

magnetic adjustment of afterload in engineered heart tissues

Efterbelastning er kendt for at drive udviklingen af både fysiologiske og patologiske hjertetilstande. Som sådan, studere resultaterne af ændrede efterbelastning stater kunne give vigtig indsigt i de mekanismer, der styrer disse kritiske processer. Men en eksperimentel teknik til præcist finjustering efterbelastning i hjertevæv over tid er i øjeblikket mangler. Her beskrives en nyudviklet magnetisk baseret teknik til at opnå denne kontrol i manipuleret hjertevæv (EHT'er). For at producere magnetisk responsive EHTs (MR-EHTs), er vævene monteret på hule silikone stolper, hvoraf nogle indeholder små permanente magneter. Et andet sæt af permanente magneter er tryk-fit i en akryl plade, således at de er orienteret med samme polaritet og er aksialt justeret med stillingen magneter. For at justere efterbelastningen, er denne plade af magneter oversat mod (højere efterbelastning) eller væk (lavere efterbelastning) fra stillingen magneter ved hjælp af en piezoelektrisk fase udstyret med en koder. Den motion control software, der anvendes til at justere fase positionering giver mulighed for udvikling af brugerdefinerede efterbelastning regimer, mens koderen sikrer, at scenen korrigerer for eventuelle uoverensstemmelser i sin placering. Dette arbejde beskriver fremstilling, kalibrering og implementering af dette system for at muliggøre udvikling af lignende platforme i andre laboratorier rundt om i verden. Repræsentative resultater fra to separate forsøg er inkluderet for at eksemplificere rækken af forskellige undersøgelser, der kan udføres ved hjælp af dette system.

Magnet post stivhed kvantificering En vandret orienteret magnetisk responsiv silikonestolpe blev monteret i en fast position, og en aksialt justeret kalibreringsmagnet blev placeret på flere definerede afstande ("magnetafstande") fra dette indlæg. Test belastninger af kendt vægt blev suspenderet fra slutningen af silikone post, forårsager stillingen til at bøje. Denne afbøjning blev kvantificeret optisk. Der blev observeret en lineær forbindelse mellem testbelastningens tyngdekraft og den deraf...

Watch this Scientific Journal Video about Magnetic Adjustment of Afterload in Engineered Heart Tissues at JoVE.com

Magnetic Adjustment of Afterload in Engineered Heart Tissues

Denne protokol indeholder detaljerede metoder, der beskriver fremstilling og gennemførelse af en magnetisk-baseret efterbelastning tuning platform for manipuleret hjertevæv.

Magnetisk justering af efterbelastning i manipuleret hjertevæv

Afterload is known to drive the development of both physiological and pathological cardiac states. As such, studying the outcomes of altered afterload ...

Dette system kan bruges til at udsætte manipuleret hjerte væv til varierende regimer af efterload, med henblik på at undersøge virkningerne af disse stimuli på væv kraft udvikling, remodeling og modning. Vores teknik gør det muligt for en præcist at udsætte slå væv til en bred vifte af tilpasselig efterload rutiner over længere perioder af kultur uden selv at skulle åbne cellekultur plade. Vores metode kan ændres til at kontrollere efterbelastning i andre muskelvæv kultur system, såsom skeletmuskulatur, glatte muskler eller punkterede papillære muskler.Da vores systemtilgang er ret unik og har tekniske aspekter, som mange forskere ikke kender, kan visuel demonstration hjælpe med at genskabe vores setup. For at fremstille de magnetisk lydhøre silikone stativer, erhverve de 24 godt plade kan padle stativer af silikone stillinger, der er beskrevet i tekstprotokollen. Smør magneterne med vand ved hjælp af en fast polaritet, og sæt dem en ad gangen ind i silikonestativernes yderste stolper.Brug et blandet stykke rustfrit stål tandtråd til forsigtigt at skubbe dem til bunden af den hule post hulrum. Op til fem magneter kan stables i hvert indlæg. Brug runde næsetænger til at bøje rustfrit stål tandtråd i seler 11,25 millimeter bred og 15 millimeter lang.For at sikre de korrekte dimensioner er opnået, kan man bruge en self made jig at støtte i wiren bøjning, derefter bruge wire cutters at skære seler og filen til at udjævne skærefladen. Smør seler eller stolper med vand og indsæt dem i silikone rack fastsættelse den anden og tredje til den yderste post i processen. Begynd at forberede efterlæsse tuning enhed som beskrevet i tekstprotokollen, tillægger magnet indehaveren til piezoelektriske fase ved hjælp af en ikke magnetisk materiale, kan dette opnås ved hjælp af en L formet stykke aluminium.For at muliggøre visuel analyse af vævene skal du installere en lyskilde i efterbelastningstueenheden. Her blev der ansat en række led' til at belyse ingeniøren til hjertevæv nedefra. For at kalibrere efterbelastningsjusteringssystemet monteres et af silikonestativerne og lodret ved hjælp af ikke-magnetiske materialer, således at de magnetisk responsive silikonestillinger er orienteret vandret.Nu montere en af pladen magneter på en vandret rejser lineær fase, således at det er aksialt på linje med den magnetisk lydhøre post. Anbring kalibreringsmagen en defineret afstand fra magnetisk responsiv silikonepost ved hjælp af den vandrette fase. Placer et kamera på siden af denne opsætning for at kunne optage indlægdeflbøjningen optisk under indflydelse af testbelastningerne.Sørg for, at der er tilstrækkelig plads under indlægget til, at de tilhørende belastninger kan hænge frit. Tag et billede af stillingen i mangel af vægte til brug som reference for stillinger neutral position. Uden at ændre kameraets perspektiv, vedhæfte en af belastningerne til slutningen af silikone post, derefter tage et billede af stillingen bøjning under indflydelse af vægten.Nu grafer afbøjningen af silikoneposten på x-aksen mod tyngdekraften af hver testvægt på y-aksen. Dette bør give en lineær sammenhæng mellem kraft og afbøjning. Afbilde en lineær regressionsfunktion, der går gennem 00, og anskaffe data.Hældningen af denne funktion er stivheden, k af den magnetisk lydhøre silikone stolpe ved den testede magnetafstand. Gentag disse trin ved flere mellemrum mellem dmax og et dmin. Her blev afbøjninger på otte forskellige magnetpositioner, der spænder fra omkring 31 millimeter til omkring fem millimeter, analyseret.En masse regressionsfunktion gennem disse værdier. Brug for eksempel ikke-lineær pasform, en faseforfaldsfunktion i analysesoftwaren. Denne regressionsfunktion beskriver forholdet mellem magnetafstand og efterbelastning.Hvis du vil forberede efterloadtuningsenheden til eksperimenter, skal du slutte den piezoelektriske scenemotor til bevægelsescontrolleren og slutte bevægelsescontrolleren til computeren. Sørg for, at bevægelsescontrolleren også er tilsluttet en strømkilde. Start derefter motion controller platform software, skal du tilslutte softwaren til piezo fase motor ved at vælge den port, der er udpeget som fase bord under installationen af motion control software og derefter klikke på den åbne port-knappen.Gå til systempanelet, vælg åben løkke, i rullemenuen løkke. Flyt magnetpladen manuelt til sin højeste position, den tættest mulige magnetafstand dmin. Magnetpladen skal komme i kontakt med kulturplademonteringen.Gå nu til bevægelsespanelet, f.eks. Flyt magnetbladet manuelt til den lavest mulige position, skriv koderpositionen ned for at bestemme bevægelsesområdet for den piezoelektriske scenemotor. Indstil rejsegrænserne i systempanelet til værdier inden for det bevægelsesområde, der blev fastlagt i det forrige trin.Dette forhindrer magnetbladet i at støde ind i kulturbladet eller bunden af efterbelastningstuningsenheden. Endnu en gang skal du flytte magnetbladet til sin højeste position og klikke på nulknappen. Gå til systempanelet og ændre feedback loop mode til lukket sløjfe, gør dette sikrer, at scenen vil korrigere for eventuelle fejl i sin placering.Klik på knappen Gem i feltet butiksparametre for at gemme disse indstillinger i systemet. Placer nu den 24 brøndkulturplade, der indeholder manipuleret hjertevæv, på magnetisk responsive silikonestativer på kulturplademonteringen. For at beregne magnetafstanden, der er nødvendig for at opnå den ønskede efterbelastning, skal den ikke-lineære regressionsfunktion, der er fastlagt tidligere for d, løses.Træk dmin fra den beregnede magnetafstand, d. Resultatet er den afstand magnetpladen skal rejse fra sin nulposition for at opnå den ønskede efterbelastning. Skriv denne værdi i feltet Målposition ét inputfelt i panelet Bevægelse, og klik på Gå for at justere det manipulerede hjertevævs efterbelastning til den beregnede værdi.Kontrol en MREHTs fremstillet af rotte hjerter blev dyrket i mangel af magnetisk efterbelastning, indtil et plateau i kontraktile kraft blev nået. På denne dag havde MREHT'er og kontrollerede EHT'er lignende middelstyrker. I løbet af den næste uge, efterbelastningen udøves på MREHTs blev gradvist øget fra punkt ni en til seks point otte fem millinewton's per millimeter, mens efterbelastning for at kontrollere EHTs forblev konstant.Den gennemsnitlige kontraktile kraft steg med stigende efterbelastning op til punkt ni fem millinewton, hvilket markerer mere end en tredobling i kraft i forhold til den gennemsnitlige værdi målt for kontrollerede EHT'er. Post afbøjning på den anden side faldt i forhold til kontrol væv. På den sidste kulturdag var den vigtigste afbøjning målt for MREHT'er kun punkt en millimeter, sammenlignet med punkt fire otte millimeter for kontrol EHT's.Rad EHTs på magnetisk lydhør silikone stillinger blev dyrket på en minimal efterbelastning af punkt ni en millinewton per millimeter, indtil et plateau og kontraktile kraft blev nået. Fra denne dag og fremefter, MREHTs gennemgik en syv dage efterlast regime, der udsætter EHTs til cyklusser af efterload skiftevis mellem punkt ni et og seks punkt otte fem millinewton per millimeter. Den efterbelastning af kontrol EHT's blev holdt konstant på punkt seks nul millinewton per millimeter i hele varigheden af kulturen.De observerede forskelle var ikke statistisk signifikante. Kombineret med optisk kontraktilitetsanalyse muliggør denne metode realtidsmåling af kortsigtet kontrakttil respons på svingende størrelser af efterbelastning, hvilket kan være nyttigt til undersøgelse af fysiologiske muskelegenskaber. Stærke magneter kan pludselig klamre sig til hinanden, potentielt forårsage skade på brugeren og beskadige magneter selv, for at undgå dette, holde magneten adskilt på en sikker afstand.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

Analyse af Cardiomyocyte Development hjælp Immunofluorescens i embryonale Mouse Hjerte

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Improved Generation of Induced Cardiomyocytes Using a Polycistronic Construct Expressing Optimal Ratio of Gata4, Mef2c and Tbx5

Forbedret generation af inducerede cardiomyocytes Ved hjælp af en polycistronisk Construct udtrykker optimale forhold for Gata4, Mef2c og Tbx5

Direct conversion of cardiac fibroblasts (CFs) into induced cardiomyocytes (iCMs) holds great potential for regenerative medicine by offering alternative ...

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

Epigenetisk forordning af Cardiac Differentiering af embryonale stamceller og væv

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

Maturation of Human Stem Cell-derived Cardiomyocytes in Biowires Using Electrical Stimulation

Modning af humane stamceller afledt Cardiomyocytter i Biowires Brug af elektrisk stimulering

Human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hPSC-CMs) have been a promising cell source and have thus encouraged the investigation of their ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

Organotypic kultur metode til at studere udviklingen af embryonale kylling væv

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart

Nanopartikler-medieret siRNA genhæmning i voksen zebrafisk hjerte

Mammals have a very limited capacity to regenerate the heart after myocardial infarction. On the other hand, the adult zebrafish regenerates its heart ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone

Vævs præparation og immun farvning af mus craniofacial væv og Undecalcificeret knogle

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Mikroinjektion-baseret System for i Vivo Implantation af embryonale Cardiomyocytes i aviær Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

In Vitro Generation of Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells

In vitro-generering af muse hjerte felt-specifikke kardiale progenitorceller

Pluripotent stem cells offer great potential for understanding heart development and disease and for regenerative medicine. While recent advances in ...

Analysis of Congenital Heart Defects in Mouse Embryos Using Qualitative and Quantitative Histological Methods

Analyse af medfødte hjertefejl i museembryoner ved hjælp af kvalitative og kvantitative histologiske metoder

Congenital heart defects (CHD) are the most common type of birth defect in humans, affecting up to 1% of all live births. However, the underlying causes ...