Name: magnetic adjustment of afterload in engineered heart tissues
Uploaded: 2020-05-05T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Magnetic Adjustment of Afterload in Engineered Heart Tissues at JoVE.com

De auteurs danken Jutta Starbatty voor haar steun in weefselkweekwerk, Axel Kirchhof voor fotografie, Alice Casagrande Cesconetto voor het bewerken van werk, en een speciale dank aan Bülent Aksehirlioglu voor technische ondersteuning bij de ontwikkeling van dit apparaat. B.B. werd ondersteund door een DZHK (German Centre for Cardiovascular Research) Scholar Grant, M.L.R. door een Whitaker International Postdoctoral Scholar Grant en M.N.H. door fondsen van de DZHK.

1. Voorbereiding van het Afterload Tuning Platform
LET OP: De stappen die betrokken zijn bij dit deel van het protocol zijn niet tijdsgevoelig.
<ol><li>Productie van de magnetisch responsieve siliconen rekken LET OP: Deze rekken dienen als het cultuurplatform voor EHT's. Elke EHT wordt opgehangen tussen twee siliconen palen, die nalading geven aan het weefsel. De mate van nabelasting is direct gerelateerd aan de stijfheid van deze posten. Om magnetische n...

<ol>
	<li>Zipes, D. P., Libby, P., Bonow, R. O., Mann, D. L., Tomaselli, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Braunwald's Heart Disease: A Textbook of Cardiovascular Medicine. 11th edn. , (2018).</li><li>McCain, M. L., Yuan, H., Pasqualini, F. S., Campbell, P. H., Parker, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+elasticity+regulates+the+optimal+cardiac+myocyte+shape+for+contractility.">Matrix elasticity regulates the optimal cardiac myocyte shape for contractility.</a> American Journal of Physiology- Heart and Circulatory Physiology. 306 (11), 1525-1539 (2014).</li><li>de Groot, P. C., van Dijk, A., Dijk, E., Hopman, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preserved+cardiac+function+after+chronic+spinal+cord+injury.">Preserved cardiac function after chronic spinal cord injury.</a> Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 87 (9), 1195-1200 (2006).</li><li>Perhonen, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+atrophy+after+bed+rest+and+spaceflight.">Cardiac atrophy after bed rest and spaceflight.</a> Journal of Applied Physiology. 91 (2), 645-653 (2001).</li><li>Levy, D., Larson, M. G., Vasan, R. S., Kannel, W. B., Ho, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+progression+from+hypertension+to+congestive+heart+failure.">The progression from hypertension to congestive heart failure.</a> Journal of the American Medical Association. 275 (20), 1557-1562 (1996).</li><li>Levy, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+trends+in+the+incidence+of+and+survival+with+heart+failure.">Long-term trends in the incidence of and survival with heart failure.</a> The New England Journal of Medicine. 347 (18), 1397-1402 (2002).</li><li>Maggioni, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EURObservational+Research+Programme:+regional+differences+and+1-year+follow-up+results+of+the+Heart+Failure+Pilot+Survey+(ESC-HF+Pilot).">EURObservational Research Programme: regional differences and 1-year follow-up results of the Heart Failure Pilot Survey (ESC-HF Pilot).</a> European Journal of Heart Failure. 15 (7), 808-817 (2013).</li><li>Mozaffarian, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+disease+and+stroke+statistics--2015+update:+a+report+from+the+American+Heart+Association.">Heart disease and stroke statistics--2015 update: a report from the American Heart Association.</a> Circulation. 131 (4), 29 (2015).</li><li>Klautz, R. J., Teitel, D. F., Steendijk, P., van Bel, F., Baan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+afterload+and+contractility+in+the+newborn+heart:+evidence+of+homeometric+autoregulation+in+the+intact+circulation.">Interaction between afterload and contractility in the newborn heart: evidence of homeometric autoregulation in the intact circulation.</a> Journal of the American College of Cardiology. 25 (6), 1428-1435 (1995).</li><li>Liedtke, A. J., Pasternac, A., Sonnenblick, E. H., Gorlin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+canine+ventricular+dimensions+with+acute+changes+in+preload+and+afterload.">Changes in canine ventricular dimensions with acute changes in preload and afterload.</a> The American Journal of Physiology. 223 (4), 820-827 (1972).</li><li>Toischer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+cardiac+remodeling+in+preload+versus+afterload.">Differential cardiac remodeling in preload versus afterload.</a> Circulation. 122 (10), 993-1003 (2010).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Hypertrophy+and+Increased+Susceptibility+to+Spontaneous+Calcium-Release+of+Rat+Left+Atrial+Myocytes+Due+to+Elevated+Afterload.">Cellular Hypertrophy and Increased Susceptibility to Spontaneous Calcium-Release of Rat Left Atrial Myocytes Due to Elevated Afterload.</a> PloS one. 10 (12), 0144309 (2015).</li><li>Hori, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loading+sequence+is+a+major+determinant+of+afterload-dependent+relaxation+in+intact+canine+heart.">Loading sequence is a major determinant of afterload-dependent relaxation in intact canine heart.</a> The American Journal of Physiology. 249, 747-754 (1985).</li><li>Schotola, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contractile+adaption+to+preload+depends+on+the+amount+of+afterload.">The contractile adaption to preload depends on the amount of afterload.</a> ESC Heart Failure. 4 (4), 468-478 (2017).</li><li>Sonnenblick, E. H., Downing, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Afterload+as+a+primary+determinat+of+ventricular+performance.">Afterload as a primary determinat of ventricular performance.</a> The American Journal of Physiology. 204, 604-610 (1963).</li><li>Hirt, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+afterload+induces+pathological+cardiac+hypertrophy:+a+new+in+vitro+model.">Increased afterload induces pathological cardiac hypertrophy: a new in vitro model.</a> Basic Research in Cardiology. 107 (6), 307 (2012).</li><li>Hirt, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+microRNA+signature+of+pathological+cardiac+hypertrophy+by+engineered+heart+tissue-+and+sequencing-technology.">Deciphering the microRNA signature of pathological cardiac hypertrophy by engineered heart tissue- and sequencing-technology.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 81, 1-9 (2015).</li><li>Dorn, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fuzzy+logic+of+physiological+cardiac+hypertrophy.">The fuzzy logic of physiological cardiac hypertrophy.</a> Hypertension. 49 (5), 962-970 (2007).</li><li>Hill, J. A., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+plasticity.">Cardiac plasticity.</a> The New England Journal of Medicine. 358 (13), 1370-1380 (2008).</li><li>Maillet, M., van Berlo, J. H., Molkentin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+physiological+heart+growth:+fundamental+concepts+and+new+players.">Molecular basis of physiological heart growth: fundamental concepts and new players.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (1), 38-48 (2013).</li><li>Stenzig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+in+an+engineered+heart+tissue+model+of+cardiac+hypertrophy:+common+signatures+and+effects+of+DNA+methylation+inhibitors.">DNA methylation in an engineered heart tissue model of cardiac hypertrophy: common signatures and effects of DNA methylation inhibitors.</a> Basic Research in Cardiology. 111 (1), 9 (2016).</li><li>Werner, T. R., Kunze, A. C., Stenzig, J., Eschenhagen, T., Hirt, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blockade+of+miR-140-3p+prevents+functional+deterioration+in+afterload-enhanced+engineered+heart+tissue.">Blockade of miR-140-3p prevents functional deterioration in afterload-enhanced engineered heart tissue.</a> Scientific Reports. 9 (1), 11494 (2019).</li><li>Leonard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Afterload+promotes+maturation+of+human+induced+pluripotent+stem+cell+derived+cardiomyocytes+in+engineered+heart+tissues.">Afterload promotes maturation of human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes in engineered heart tissues.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 118, 147-158 (2018).</li><li>Rodriguez, M. L., Werner, T. R., Becker, B., Eschenhagen, T., Hirt, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetics-Based+Approach+for+Fine-Tuning+Afterload+in+Engineered+Heart+Tissues.">Magnetics-Based Approach for Fine-Tuning Afterload in Engineered Heart Tissues.</a> ACS Biomaterials Science &amp; Engineering. 5 (7), 3663-3675 (2019).</li><li>Mannhardt, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Contraction+Analysis+of+Human+Engineered+Heart+Tissue+for+Cardiac+Drug+Safety+Screening.">Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (122), e55461 (2017).</li></ol>

Het hierbeschreven protocol beschrijft een nieuwe techniek voor het magnetisch veranderen van nabelasting in gemanipuleerde hartweefsels. Deze techniek is gebaseerd op het gebruik van een piëzo-elektrisch stadium om een plaat van sterke magneten te vertalen naar en uit de buurt van magnetisch responsieve rekken van siliconen palen. Hoe dichter de twee sets magneten, hoe sterker de nalading ervaren door de EHTs gekweekt op hen.
Er zijn verschillende stappen die van cruciaal belang zijn voor de...

Nalading is de systolische belasting op de ventrikel nadat het is begonnen met het uitwerpen van bloed1. Tijdens de cardiale ontwikkeling is een geschikte nabelasting van cruciaal belang voor cardiomyocyte rijping2. Op volwassen leeftijd kunnen lage niveaus van ventriculaire nabelasting (bijvoorbeeld bij bedlegerige patiënten met een dwarslaesie op hoog niveau3 of in zeer speciale gevallen zoals spaceflight4)leiden tot hypotrofie van het hart. Omgekeerd kan hoge nabelasting leiden tot cardiale hypertrofie5. Terwijl cardiale hypertrofie bij duursporters of zwangere vrouwen wordt beschouwd als gunstig en fysiologisch, hypertrofie geassocieerd met langdurige arteriële hypertensie of ernstige aortaklep stenose is schadelijk omdat het vatbaar is voor hartritmestoornissen en hartfalen6. Hoewel de 5-jarige mortaliteit voor patiënten met hartfalen is gedaald van ~ 70% in de jaren 19806 tot 40-50%7 op dit moment, is er nog steeds een grote behoefte aan nieuwe therapeutische behandeling opties voor deze zeer heersende aandoening (momenteel 2,2% van de bevolking in de westerse wereld)8.
Om de moleculaire mechanismen van pathologische cardiale hypertrofie te onderzoeken en preventieve of therapeutische strategieën voor de behandeling van deze ziekte te testen, zijn in vivo modellen van nalading ontwikkeld9,10,11,12. Hoewel deze modellen gunstige inzichten hebben geboden in de effecten van nabelasting op ventriculaire prestaties, staan ze geen fijne controle over de nabelastingsomvang toe. Als alternatief maken in vitro studies van nalading uitgevoerd op uitgesneden harten en spierpreparaten een fijnere controle over weefselbelasting mogelijk, maar deze modellen zijn niet bevorderlijk voor longitudinale studies13,14,15.
Om deze problemen op te lossen, ontwikkelden we een in vitro model van verhoogde nabelasting in ontworpen hartweefsels (EHT's)16,17. Dit model is een 3-dimensionaal kweekformaat voor rattenhartcellen ingebed in een fibrinematrix die tussen flexibele holle siliconenpalen wordt opgehangen. Deze weefsels slaan spontaan (tegen de weerstand van de siliconenpalen) en voeren auxotonic werk uit. We hebben de nalading die in eerdere experimenten op EHT's werd aangebracht met een factor 12 verhoogd door een week lang stijve metalen beugels in de holle siliconenpalen in te brengen. Dit leidde tot een veelheid aan veranderingen, kenmerkend voor pathologische cardiale hypertrofie18,19,20: cardiomyocyte hypertrofie, gedeeltelijke necroptose, een afname van de contractiele kracht, de aantasting van weefselontspanning, reactivering van het foetale genprogramma, een metabole verschuiving van vetzuuroxidatie naar anaerobe glycolyse en een toename van fibrose. Hoewel deze procedure met succes is toegepast in verschillende studies17,21,22, het heeft een aantal nadelen. Er zijn slechts twee toestanden, laag of zeer hoog (12-voudig) nalading, en de procedure vereist handmatige behandeling van de EHT's, wat de tijdelijke flexibiliteit beperkt en het risico van besmetting vormt.
Onlangs, Leonard et al. gebruikt een soortgelijke techniek te moduleren nalading in EHTs gekweekt op siliconen posten23. Beugels van verschillende lengtes werden geplaatst rond de buitenkant van de palen om hun buigen de beweging te beperken. De auteurs van deze studie rapporteerden dat een bijzondere kleine tot gemiddelde toename van de belasting de ontwikkeling en rijping van menselijke iPS-afgeleide EHT's verbeterde, terwijl hogere belastingen resulteerden in een pathologische toestand. Echter, vergelijkbaar met ons eigen systeem, deze techniek alleen zorgt voor enkelvoud verhogingen van de nabelasting, waarvan de omvang wordt gedicteerd door de lengte van de beugels. Als zodanig, fijne wijzigingen in nalading, wijzigingen in nabelasting na verloop van tijd, en nauwkeurige lading regimes zijn niet mogelijk met deze technieken.
Hier bieden we het protocol voor een systeem dat kan worden gebruikt om post-weerstand te moduleren, dat wil zeggen, nalading van EHTs magnetisch24. Dit platform vergemakkelijkt de fine-tuning van afterload, maakt door de gebruiker gedefinieerde naladingsregimes mogelijk en zorgt voor EHT-steriliteit.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cylindrical plate magnets</td>
			<td>HKCM</td>
			<td>9962-55184</td>
			<td>h = 14 mm, d = 13 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cylindrical post magnets</td>
			<td>HKCM</td>
			<td>9962-63571</td>
			<td>h = 2 mm, d = 0.5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental wire</td>
			<td>Ormco</td>
			<td>266-1316</td>
			<td>d = 0.016 inches (0.406 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad</td>
			<td>GraphPad Software, La Jolla, California, USA</td>
			<td>version 6.00 for Windows</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motion control software for piezo motor</td>
			<td>Micronix USA</td>
			<td></td>
			<td>free download on manufacturer homepage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motion controller for piezo motor</td>
			<td>Micronix USA</td>
			<td>MMC-100-01000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical contractility analysis platform</td>
			<td>EHT technologies</td>
			<td>A0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piezoelectric linear motor</td>
			<td>Micronix USA</td>
			<td>PPS-20-15206</td>
			<td>fitted with linear optical encoder, incubator-environment compatible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Styrene Rod</td>
			<td>Plastruct</td>
			<td>MR-15</td>
			<td>d= 0.015 inches (0.381 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB camera</td>
			<td>Reichelt Elektronik</td>
			<td>REFLECTA 66142</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

magnetic adjustment of afterload in engineered heart tissues

Van afterload is bekend dat het de ontwikkeling van zowel fysiologische als pathologische harttoestanden stimuleert. Als zodanig kan het bestuderen van de resultaten van gewijzigde naladingstoestanden belangrijke inzichten opleveren in de mechanismen die deze kritieke processen controleren. Echter, een experimentele techniek voor het nauwkeurig finetunen van nalading in hartweefsel na verloop van tijd ontbreekt momenteel. Hier wordt een nieuw ontwikkelde techniek op basis van magneten beschreven voor het bereiken van deze controle in gemanipuleerde hartweefsels (EHT's). Om magnetisch responsieve EHT's (MR-EHT's) te produceren, worden de weefsels gemonteerd op holle siliconenpalen, waarvan sommige kleine permanente magneten bevatten. Een tweede set permanente magneten is pers-fit in een acrylplaat zodanig dat ze zijn georiënteerd met dezelfde polariteit en zijn axiaal uitgelijnd met de post magneten. Om nalading aan te passen, wordt deze plaat van magneten vertaald naar (hogere nalading) of weg (lagere nalading) van de postmagneten met behulp van een piëzo-elektrisch stadium dat met een encoder wordt gepast. De motion control software die wordt gebruikt om de fase positionering aan te passen maakt de ontwikkeling van de gebruiker gedefinieerde nalading regimes, terwijl de encoder zorgt ervoor dat het stadium corrigeert voor eventuele inconsistenties in de locatie. Dit werk beschrijft de fabricage, kalibratie en implementatie van dit systeem om de ontwikkeling van soortgelijke platforms in andere laboratoria over de hele wereld mogelijk te maken. Representatieve resultaten van twee afzonderlijke experimenten zijn opgenomen om het bereik van verschillende studies die met dit systeem kunnen worden uitgevoerd, te illustreren.

De stijfheid swantificering van de magneetpost Een horizontaal georiënteerde magnetisch responsieve siliconen paal werd gemonteerd in een vaste positie, en een axiaal uitgelijnde kalibratie magneet werd geplaatst op verschillende gedefinieerde afstanden ("magneet afstanden") van dit bericht. Testladingen van bekend gewicht werden opgehangen aan het einde van de siliconen paal, waardoor de paal te buigen. Deze afbuiging werd optisch gekwantificeerd. Bij alle magneetafstanden (figu...

Watch this Scientific Journal Video about Magnetic Adjustment of Afterload in Engineered Heart Tissues at JoVE.com

Magnetic Adjustment of Afterload in Engineered Heart Tissues

Dit protocol biedt gedetailleerde methoden waarin de fabricage en implementatie van een op magneten gebaseerd naladingstuningplatform voor ontworpen hartweefsels wordt beschreven.

Magnetische aanpassing van nalading in engineered heart tissues

Afterload is known to drive the development of both physiological and pathological cardiac states. As such, studying the outcomes of altered afterload ...

Dit systeem kan worden gebruikt om gemanipuleerde hartweefsels bloot te stellen aan verschillende regimes van afterload, om de effecten van deze stimuli op weefselkrachtontwikkeling, remodellering en rijping te bestuderen. Onze techniek maakt het mogelijk om nauwkeurig te onderwerpen kloppen weefsels om een breed scala van aanpasbare afterload routines over langdurige perioden van cultuur zonder zelfs de noodzaak om de celkweek plaat te openen. Onze methode kan worden aangepast om na belasting in andere spierweefsel cultuur systeem, zoals skeletspier, gladde spier of accijnzen papillaire spier controle.Aangezien onze systeembenadering vrij uniek is en technische aspecten bevat die veel wetenschappers niet kennen, kan visuele demonstratie helpen bij het recreëren van onze setup. Voor de vervaardiging van de magnetisch responsieve siliconen rekken, het verwerven van de 24 put plaat kan peddelen rekken van siliconen palen beschreven in het tekstprotocol. Smeer de magneten met behulp van een vaste polariteit met water en steek ze één voor één in de buitenste palen van de siliconenrekken.Gebruik een gemengd stuk roestvrij staal tanddraad om ze voorzichtig naar de bodem van de holle postholte te duwen. In elke post kunnen maximaal vijf magneten worden gestapeld. Gebruik ronde neustang om roestvrij staal tanddraad te buigen in beugels 11,25 millimeter breed en 15 millimeter lang.Om ervoor te zorgen dat de juiste afmetingen worden bereikt, kan men gebruik maken van een zelfgemaakte mal om te helpen bij het buigen van de draad, gebruik dan draadsnijders om de beugels en het bestand te snijden om het snijoppervlak glad te maken. Smeer de beugels of palen met water en steek ze in het siliconenrek dat de tweede en derde tot de buitenste paal in het proces bevestigt. Begin met het voorbereiden van de afterload het stemapparaat zoals beschreven in het tekstprotocol, bevestig aan de magneethouder aan de piëzo-elektrische fase met behulp van een niet-magnetisch materiaal, dit kan worden bereikt met behulp van een L-vormige stuk aluminium.Installeer een lichtbron in het nabelastingentuningapparaat om visuele analyse van de weefsels mogelijk te maken. Hier werd een reeks LED's gebruikt om de ingenieur te verlichten om weefsels van onderen hartweefsels. Om het nabelastingtuningsysteem te kalibreren, monteer je een van de siliconenrekken en gebruik je verticaal met niet-magnetische materialen, zodat de magnetisch responsieve siliconenpalen horizontaal worden georiënteerd.Nu monteren een van de plaat magneten op een horizontaal reizende lineaire fase zodanig dat het axiaal is uitgelijnd met de magnetisch responsieve post. Plaats de kalibratiemagneet een bepaalde afstand tot magnetisch responsieve siliconenpost met behulp van het horizontale stadium. Plaats een camera aan de zijkant van deze opstelling om de afbuiging van de palen onder invloed van de testbelasting optisch te kunnen registreren.Zorg ervoor dat er voldoende ruimte onder de post voor de bijgevoegde ladingen vrij te hangen. Neem een foto van de post in de afwezigheid van gewichten te gebruiken als referentie voor de berichten neutrale positie. Zonder het perspectief van de camera te veranderen, bevestigt u een van de belastingen aan het einde van de siliconenpost en maakt u vervolgens een foto van de postbuiging onder invloed van het gewicht.Nu grafiek de afbuiging van de siliconen post op de x-as tegen de zwaartekracht van elke test gewicht op de y-as. Dit moet een lineaire relatie tussen kracht en afbuiging opleveren. Plot een lineaire regressiefunctie die door 00 en de acquire-gegevens gaat.De helling van deze functie is de stijfheid, k van de magnetisch responsieve siliconen post op de geteste magneet afstand. Herhaal deze stappen op verschillende afstanden tussen dmax en een dmin. Hier werden de afbuigingen op acht verschillende magneetposities, variërend van ongeveer 31 millimeter tot ongeveer vijf millimeter, geanalyseerd.Veel regressie functie door middel van deze waarden. Gebruik bijvoorbeeld niet-lineaire pasvorm, een fasevervalfunctie in de analysesoftware. Deze regressiefunctie beschrijft de relatie tussen magneetafstand en afterload.Als u het nabelastingenstemapparaat wilt voorbereiden op experimenten, sluit u de piëzo-elektrische fasemotor aan op de bewegingscontroller en sluit u de bewegingscontroller aan op de computer. Zorg ervoor dat de bewegingscontroller ook is aangesloten op een voedingsbron. Start vervolgens de motion controller platform software, sluit de software aan op de piëzo fase motor door het selecteren van de poort aangewezen als het podium bord tijdens de installatie van de motion control software en klik vervolgens op de open poort knop.Ga naar het systeempaneel, selecteer open lus, in het vervolgkeuzemenu Lus. Verplaats de magneetplaat handmatig naar de hoogste stand, de grootst mogelijke magneetafstand. De magneetplaat moet contact maken met de kweekplaathouder.Ga nu naar het bewegingspaneel, zoals de nulknop om de huidige positie van het piëzostadium terug te zetten naar nul millimeter. Beweeg het magneetblad handmatig naar de laagst mogelijke positie, schrijf de encoderpositie op om het bewegingsbereik voor de piëzo-elektrische trapmotor te bepalen. Stel de reislimieten in het systeempaneel in op waarden binnen het bewegingsbereik dat in de vorige stap is bepaald.Dit voorkomt dat het magneetblad tegen het kweekblad of de onderkant van het nabelastingstemapparaat botst. Verplaats het magneetblad nogmaals naar de hoogste stand en klik op de nulknop. Ga naar het systeempaneel en wijzig de feedbacklusmodus in gesloten lus, dit zorgt ervoor dat de fase corrigeert voor eventuele fouten in de positionering.Klik op de knop Opslaan in het vak Met de winkelparameters om deze instellingen in het systeem op te slaan. Plaats nu de 24 goed kweekplaat met gemanipuleerde hartweefsels op magnetisch responsieve siliconenrekken op de kweekplaatmount. Los de eerder voor d vastgestelde niet-lineaire regressiefunctie op om de magnetische afstand te berekenen die nodig is om een gewenste afterload te bereiken.Trek dmin af van de berekende magneetafstand, d. Het resultaat is de afstand die de magneetplaat van zijn nulpositie moet afleggen om de gewenste afterload te bereiken. Typ deze waarde in het invoerveld Doelpositie één invoerveld in het deelvenster Beweging en klik op Ga om de nabelasting van het ontworpen hartweefsel aan te passen aan de berekende waarde.Controle een MREHT's geproduceerd uit rattenharten werden gekweekt in de afwezigheid van magnetische afterload totdat een plateau in contractiele kracht werd bereikt. Op deze dag hadden MREHT's en gecontroleerde EHT's vergelijkbare gemiddelde krachten. In de loop van de volgende week, werd de afterload uitgeoefend op MREHTs stapsgewijs verhoogd van punt negen één tot zes punt acht vijf millinewton per millimeter, terwijl de afterload voor het controleren van EHTs constant bleef.Gemiddelde contractielkracht steeg met stijgende afterload tot punt negen vijf millinewton, die meer dan een drievoudige verhoging van kracht in vergelijking met de gemiddelde waarde merkt die voor gecontroleerde EHTs wordt gemeten. Post afbuiging aan de andere kant afgenomen in vergelijking met controle weefsels. Op de laatste dag van de cultuur was de belangrijkste afbuiging gemeten voor MREHTs slechts punt één millimeter, in vergelijking met punt vier acht millimeter voor controle EHT's.Rad EHT's op magnetisch responsieve siliconen palen werden gekweekt op een minimale afterload van punt negen een millinewton per millimeter tot een plateau en contractiele kracht werd bereikt. Vanaf deze dag ondergingen MREH's een zeven dagen na belasting regime dat de EHT's blootstelt aan cycli van afterload afwisselend punt negen een en zes punt acht vijf millinewton per millimeter. De afterload van controle EHT's werd constant gehouden op punt zes nul millinewton per millimeter over de gehele duur van de cultuur.De waargenomen verschillen waren statistisch niet significant. In combinatie met optische contractiliteitsanalyse maakt deze methode de real-time meting van contractiele respons op korte termijn op fluctuerende grootheden van afterload mogelijk, wat nuttig kan zijn voor het onderzoeken van fysiologische spiereigenschappen. Sterke magneten kunnen zich plotseling aan elkaar vastklampen, waardoor de gebruiker mogelijk gewond wordt en de magneten zelf beschadigd raken, om dit te voorkomen, de magneet op een veilige afstand gescheiden houden.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

Analyse van Cardiomyocyte Development behulp Immuunfluorescentie in Embryonale Muis Hart

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Improved Generation of Induced Cardiomyocytes Using a Polycistronic Construct Expressing Optimal Ratio of Gata4, Mef2c and Tbx5

Verbeterde Generatie van geïnduceerde Cardiomyocytes Met behulp van een polycistronisch Construct uitdrukken optimale verhouding van GATA4, MEF2C en Tbx5

Direct conversion of cardiac fibroblasts (CFs) into induced cardiomyocytes (iCMs) holds great potential for regenerative medicine by offering alternative ...

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

Epigenetische regulatie van Cardiac Differentiatie van embryonale stamcellen en weefsels

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

Maturation of Human Stem Cell-derived Cardiomyocytes in Biowires Using Electrical Stimulation

Rijping van menselijke stamcellen afgeleide cardiomyocyten als Biowires gebruiken elektrische stimulatie

Human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hPSC-CMs) have been a promising cell source and have thus encouraged the investigation of their ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

Organotypic cultuur methode om te studeren van de ontwikkeling van embryonale kip weefsels

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart

Nanoparticle-gemedieerde siRNA Gene-zwijgen in volwassen Zebrafish hart

Mammals have a very limited capacity to regenerate the heart after myocardial infarction. On the other hand, the adult zebrafish regenerates its heart ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone

Weefsel voorbereiding en immunokleuring van muis craniofaciale weefsels en Ondecalcificeerd bot

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Microinjection-gebaseerd systeem voor In Vivo implantatie van embryonale Cardiomyocytes in het aviaire Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

In Vitro Generation of Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells

In vitro generatie van muis Hartveld-specifieke hart voorlopercellen

Pluripotent stem cells offer great potential for understanding heart development and disease and for regenerative medicine. While recent advances in ...

Analysis of Congenital Heart Defects in Mouse Embryos Using Qualitative and Quantitative Histological Methods

Analyse van aangeboren hartafwijkingen in muisembryo's met behulp van kwalitatieve en kwantitatieve histologische methoden

Congenital heart defects (CHD) are the most common type of birth defect in humans, affecting up to 1% of all live births. However, the underlying causes ...