Name: magnetic adjustment of afterload in engineered heart tissues
Uploaded: 2020-05-05T13:30:00
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Les auteurs remercient Jutta Starbatty pour son soutien dans le travail de la culture tissulaire, Axel Kirchhof pour la photographie, Alice Casagrande Cesconetto pour le travail d’édition, et un merci spécial à B’lnt Aksehirlioglu pour le soutien technique dans le développement de ce dispositif. B.B. a été soutenu par un boursier DZHK (Centre allemand de recherche cardiovasculaire), M.L.R. par un Whitaker International Postdoctoral Scholar Grant et M.N.H. par des fonds de la DZHK.

1. Préparation de la plate-forme de réglage après charge
REMARQUE: Les étapes de cette partie du protocole ne sont pas sensibles au temps.
<ol><li>Fabrication des supports en silicone réactifs magnétiquement REMARQUE : Ces racks servent de plate-forme culturelle pour les EHT. Chaque EHT est suspendu entre deux poteaux en silicone, qui transmettent après chargement au tissu. Le degré d’après-charge est directement lié à la rigidité de ces pot...

<ol>
	<li>Zipes, D. P., Libby, P., Bonow, R. O., Mann, D. L., Tomaselli, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Braunwald's Heart Disease: A Textbook of Cardiovascular Medicine. 11th edn. , (2018).</li><li>McCain, M. L., Yuan, H., Pasqualini, F. S., Campbell, P. H., Parker, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+elasticity+regulates+the+optimal+cardiac+myocyte+shape+for+contractility.">Matrix elasticity regulates the optimal cardiac myocyte shape for contractility.</a> American Journal of Physiology- Heart and Circulatory Physiology. 306 (11), 1525-1539 (2014).</li><li>de Groot, P. C., van Dijk, A., Dijk, E., Hopman, M. 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N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetics-Based+Approach+for+Fine-Tuning+Afterload+in+Engineered+Heart+Tissues.">Magnetics-Based Approach for Fine-Tuning Afterload in Engineered Heart Tissues.</a> ACS Biomaterials Science &amp; Engineering. 5 (7), 3663-3675 (2019).</li><li>Mannhardt, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Contraction+Analysis+of+Human+Engineered+Heart+Tissue+for+Cardiac+Drug+Safety+Screening.">Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (122), e55461 (2017).</li></ol>

Le protocole décrit ici décrit une nouvelle technique pour modifier magnétiquement la charge après-charge dans les tissus cardiaques conçus. Cette technique repose sur l’utilisation d’un stade piézoélectrique pour traduire une plaque d’aimants forts vers et loin des supports magnétiquement réactifs de poteaux en silicone. Plus les deux ensembles d’aimants sont proches, plus l’afterload éprouvé par les EHT cultivés sur eux.
Il y a plusieurs étapes qui sont essentielles à...

Après charge est la charge systolique sur le ventricule après qu’il a commencé à éjecter le sang1. Pendant le développement cardiaque, une charge après-charge appropriée est d’importance critique pour la maturation cardiomyocyte2. À l’âge adulte, de faibles niveaux de chargement ventriculaire (p. ex., chez les patients alités atteints d’une lésion de la moelle épinière de haut niveau3 ou dans des cas très spéciaux comme le vol spatial4)peuvent entraîner une hypotrophie du cœur. Inversement, la charge après-charge élevée peut mener à l’hypertrophie cardiaque5. Tandis que l’hypertrophie cardiaque dans les athlètes d’endurance ou les femmes enceintes est considérée salutaire et physiologique, l’hypertrophie associée à l’hypertension artérielle à long terme ou la sténose aortique grave de valve est préjudiciable car elle prédispose un aux arythmies cardiaques et à l’insuffisance cardiaque6. Bien que le taux de mortalité sur cinq ans chez les patients souffrant d’insuffisance cardiaque ait diminué de 70 % dans les années 1980de 6 à 40 à 50 %7 actuellement, il y a encore un grand besoin de nouvelles options de traitement thérapeutique pour cette affection très répandue (actuellement 2,2 % de la population dans le monde occidental)8.
Afin d’étudier les mécanismes moléculaires de l’hypertrophie cardiaque pathologique et de tester des stratégies préventives ou thérapeutiques pour le traitement de cette maladie, les modèles in vivo de l’après-charge ont été développés9,10,11,12. Bien que ces modèles aient offert des aperçus bénéfiques des effets de l’après-charge sur les performances ventriculaires, ils ne permettent pas un contrôle fin sur l’ampleur de la charge après la charge. Alternativement, les études in vitro de l’après-charge effectuée sur les cœurs excisés et les préparations musculaires permettent un contrôle plus fin sur le chargement des tissus, mais ces modèles ne sont pas propices aux études longitudinales13,14,15.
Pour surmonter ces problèmes, nous avons développé un modèle in vitro de chargement élevé dans les tissus cardiaques (EHT)16,17. Ce modèle est un format de culture en 3 dimensions pour les cellules cardiaques de rat intégrées dans une matrice de fibrine suspendue entre les poteaux de silicone creux flexibles. Ces tissus battent spontanément (contre la résistance des poteaux en silicone) et effectuent un travail auxotonique. Nous avons augmenté après la charge appliquée aux EHT par un facteur de 12 dans les expériences précédentes par l’insertion d’accolades métalliques rigides dans les poteaux creux de silicone pendant une semaine. Ceci a mené à une multitude de changements, caractéristiques de l’hypertrophie cardiaque pathologique18,19,20: hypertrophie cardiomyocyte, nécroptose partielle, baisse de la force contractile, affaiblissement de la relaxation des tissus, réactivation du programme de gène foetal, changement métabolique de l’oxydation d’acide gras à la glycolyse anaérobie, et une augmentation de la fibrose. Bien que cette procédure a été utilisée avec succès dans plusieurs études17,21,22, il a quelques inconvénients. Il n’y a que deux états, faibles ou très élevés (12 fois) après la charge, et la procédure nécessite une manipulation manuelle des ERE, ce qui limite sa flexibilité temporelle et pose le risque de contamination.
Récemment, Leonard et coll. ont utilisé une technique similaire pour moduler l’après-décharge dans les EHT cultivés sur les poteaux de silicone23. Des accolades de longueurs variables ont été placées autour de l’extérieur des poteaux pour limiter leur mouvement de flexion. Les auteurs de cette étude ont indiqué qu’une augmentation singulière de petite à moyenne de la charge a amélioré le développement et la maturation des EHT humains iPS-dérivés, tandis que des charges plus élevées ont eu comme conséquence un état pathologique. Cependant, semblable à notre propre système, cette technique ne permet que des augmentations singulières de la charge après-charge, dont l’ampleur est dictée par la longueur des accolades. En tant que tel, de fines altérations dans la charge après la charge, des modifications dans l’après-charge au fil du temps, et des régimes de chargement précis ne sont pas possibles avec ces techniques.
Ici, nous fournissons le protocole pour un système qui peut être utilisé pour moduler la post-résistance, c’est-à-dire, après la charge des EHTs magnétiquement24. Cette plate-forme facilite l’ajustement fin de la charge après l’utilisation, permet des schémas de chargement d’après-dose définis par l’utilisateur et assure la stérilité ehT.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cylindrical plate magnets</td>
			<td>HKCM</td>
			<td>9962-55184</td>
			<td>h = 14 mm, d = 13 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cylindrical post magnets</td>
			<td>HKCM</td>
			<td>9962-63571</td>
			<td>h = 2 mm, d = 0.5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental wire</td>
			<td>Ormco</td>
			<td>266-1316</td>
			<td>d = 0.016 inches (0.406 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad</td>
			<td>GraphPad Software, La Jolla, California, USA</td>
			<td>version 6.00 for Windows</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motion control software for piezo motor</td>
			<td>Micronix USA</td>
			<td></td>
			<td>free download on manufacturer homepage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motion controller for piezo motor</td>
			<td>Micronix USA</td>
			<td>MMC-100-01000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical contractility analysis platform</td>
			<td>EHT technologies</td>
			<td>A0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piezoelectric linear motor</td>
			<td>Micronix USA</td>
			<td>PPS-20-15206</td>
			<td>fitted with linear optical encoder, incubator-environment compatible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Styrene Rod</td>
			<td>Plastruct</td>
			<td>MR-15</td>
			<td>d= 0.015 inches (0.381 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB camera</td>
			<td>Reichelt Elektronik</td>
			<td>REFLECTA 66142</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

magnetic adjustment of afterload in engineered heart tissues

Afterload est connu pour conduire le développement des états cardiaques physiologiques et pathologiques. En tant que tel, l’étude des résultats des états de chargement après modifié pourrait donner un aperçu important des mécanismes de contrôle de ces processus critiques. Cependant, une technique expérimentale pour affiner précisément le chargement de la charge cardiaque au fil du temps fait actuellement défaut. Ici, une technique nouvellement développée basée sur des magnétiques pour réaliser ce contrôle dans les tissus cardiaques machinés (EHT) est décrite. Afin de produire des EHT (MR-EHT) réactifs magnétiquement, les tissus sont montés sur des poteaux en silicone creux, dont certains contiennent de petits aimants permanents. Un deuxième ensemble d’aimants permanents est pressé dans une plaque acrylique de sorte qu’ils sont orientés avec la même polarité et sont axially-alignés avec les aimants de poteau. Pour ajuster après la charge, cette plaque d’aimants est traduite vers (après charge supérieure) ou loin (après charge inférieure) des aimants de poteau utilisant un stade piézoélectrique équipé d’un encoder. Le logiciel de contrôle de mouvement utilisé pour ajuster le positionnement en phase permet le développement de schémas de chargement d’après-dose définis par l’utilisateur, tandis que l’encoder s’assure que l’étape corrige toute incohérence dans son emplacement. Ce travail décrit la fabrication, l’étalonnage et la mise en œuvre de ce système pour permettre le développement de plates-formes similaires dans d’autres laboratoires à travers le monde. Les résultats représentatifs de deux expériences distinctes sont inclus pour illustrer la gamme de différentes études qui peuvent être effectuées à l’aide de ce système.

Quantification de raideur de poteau d’aimant Un poteau de silicone magnétiquement orienté horizontalement a été monté dans une position fixe, et un aimant d’étalonnage axially aligné a été placé à plusieurs distances définies (« espacements d’aimant ») de ce poteau. Les charges d’essai de poids connu ont été suspendues de l’extrémité du poteau de silicone, causant le poteau de plier. Cette déviation a été quantifiée optiquement. Une relation linéaire entre la force gra...

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Magnetic Adjustment of Afterload in Engineered Heart Tissues

Ce protocole fournit des méthodes détaillées décrivant la fabrication et la mise en œuvre d’une plate-forme d’accordage après la charge magnétique pour les tissus cardiaques conçus.

Ajustement magnétique de l’afterload dans les tissus cardiaques d’ingénierie

Afterload is known to drive the development of both physiological and pathological cardiac states. As such, studying the outcomes of altered afterload ...

Ce système peut être utilisé pour exposer les tissus cardiaques artificiels à différents régimes de charge après charge, afin d’étudier les effets de ces stimuli sur le développement de la force tissulaire, le remodelage et la maturation. Notre technique permet de soumettre avec précision les tissus battants à un large éventail de routines de recharge personnalisables sur de longues périodes de culture sans même avoir besoin d’ouvrir la plaque de culture cellulaire. Notre méthode pourrait être modifiée pour contrôler le afterload dans d’autres système de culture de tissu musculaire, tels que le muscle squelettique, le muscle lisse ou le muscle papillaire excisé.Étant donné que notre approche des systèmes est assez unique et comporte des aspects techniques que de nombreux scientifiques ne connaissent pas, la démonstration visuelle peut aider à recréer notre configuration. Pour fabriquer les supports en silicone sensibles magnétiquement, acquérir la plaque de puits 24 peut pagayer racks de poteaux de silicone décrits dans le protocole de texte. À l’aide d’une polarité fixe, lubrifier les aimants avec de l’eau et les insérer un à la fois dans les poteaux les plus externes des supports en silicone.Utilisez un morceau mélangé de fil dentaire en acier inoxydable pour les pousser soigneusement au fond de la cavité creuse du poteau. Jusqu’à cinq aimants peuvent être empilés dans chaque poteau. Utilisez des pinces nasales rondes pour plier le fil dentaire en acier inoxydable en broches de 11,25 millimètres de large et de 15 millimètres de long.Pour s’assurer que les dimensions correctes sont atteintes, on peut utiliser un gabarit auto-fait pour faciliter la flexion du fil, puis utiliser des coupe-fils pour couper les broches et le fichier pour lisser la surface de coupe. Lubrifier les broches ou les poteaux avec de l’eau et les insérer dans le support en silicone fixant le deuxième et le troisième au poteau le plus externe dans le processus. Commencez à préparer le dispositif de réglage après charge tel que décrit dans le protocole de texte, attachez-le au support d’aimant au stade piezoélectrique à l’aide d’un matériau non magnétique, ceci peut être réalisé à l’aide d’un morceau d’aluminium en forme de L.Pour permettre l’analyse visuelle des tissus, installez une source de lumière dans le dispositif de réglage après chargement. Ici, un éventail de LED a été utilisé pour éclairer l’ingénieur aux tissus cardiaques d’en bas. Pour calibrer le système de réglage après chargement, montez l’un des supports en silicone et utilisez verticalement des matériaux non magnétiques, de sorte que les poteaux de silicone sensibles magnétiquement soient orientés horizontalement.Maintenant monter l’un des aimants de plaque sur une scène linéaire voyageant horizontalement de telle sorte qu’il est axially aligné avec le poteau magnétiquement sensible. Placez l’aimant d’étalonnage à une distance définie du poteau de silicone sensible magnétiquement à l’aide de l’étape horizontale. Placez une caméra sur le côté de cette configuration afin d’être en mesure d’enregistrer optiquement la déflexion des poteaux sous l’influence des charges d’essai.Assurez-vous qu’il y a suffisamment d’espace sous le poteau pour que les charges attachées pendent librement. Prenez une photo du poste en l’absence de poids à utiliser comme référence pour la position neutre des poteaux. Sans changer la perspective de la caméra, attachez l’une des charges à l’extrémité du poteau de silicone, puis prenez une photo du poteau se penchant sous l’influence du poids.Maintenant, graphique de la déviation du poteau de silicone sur l’axe x contre la force gravitationnelle de chaque poids d’essai sur l’axe y. Cela devrait donner une relation linéaire entre la force et la déviation. Tracez une fonction de régression linéaire en passant par 00 et les données d’acquisition.La pente de cette fonction est la rigidité, k du poteau de silicone magnétiquement sensible à l’espacement d’aimant éprouvé. Répétez ces étapes à plusieurs espacements entre dmax et un dmin. Ici, des déviations à huit positions d’aimant différentes, allant d’environ 31 millimètres à environ cinq millimètres ont été analysées.Beaucoup de fonction de régression à travers ces valeurs. Par exemple, utilisez l’ajustement non ligneux, une fonction de désintégration de phase dans le logiciel d’analyse. Cette fonction de régression décrit la relation entre l’espacement de l’aimant et la charge après charge.Pour préparer le dispositif de réglage après charge pour les expériences, connectez le moteur de scène piezoélectrique au contrôleur de mouvement et connectez le contrôleur de mouvement à l’ordinateur. Assurez-vous que le contrôleur de mouvement est également connecté à une source d’énergie. Ensuite, démarrez le logiciel de plate-forme de contrôleur de mouvement, connectez le logiciel au moteur de scène piezo en sélectionnant le port désigné comme planche de scène lors de l’installation du logiciel de commande de mouvement, puis cliquez sur le bouton port ouvert.Allez sur le panneau système, sélectionnez boucle ouverte, dans le menu de drop down de boucle. Déplacez manuellement la plaque magnétique à sa position la plus élevée, le dmin d’espacement d’aimant le plus proche possible. La plaque magnétique doit entrer en contact avec la monture de plaque de culture.Maintenant, allez au motion panel, comme le bouton zéro pour réinitialiser la position actuelle de l’étape piezo à zéro millimètres. Déplacez manuellement la lame magnétique à sa position la plus basse possible, notez la position de l’encoder pour déterminer la plage de mouvement du moteur de scène piezoélectrique. Définissez les limites de déplacement dans le panneau système en valeurs dans la plage de mouvement déterminée dans l’étape précédente.Cela empêche la lame magnétique de heurter la lame de culture ou le bas du dispositif de réglage après chargement. Encore une fois, déplacez la lame magnétique à sa position la plus élevée et cliquez sur le bouton zéro. Allez sur le panneau système et changez le mode boucle de rétroaction en boucle fermée, ce qui garantit que l’étape corrigera toutes les erreurs dans son positionnement.Cliquez sur le bouton enregistrer dans la boîte de paramètres de magasin pour stocker ces paramètres dans le système. Placez maintenant la plaque de culture de puits 24 contenant des tissus cardiaques machinés sur des supports en silicone magnétiquement sensibles sur la monture de plaque de culture. Pour calculer l’espacement de l’aimant nécessaire pour atteindre un afterload désiré, résoudre la fonction de régression non lignear déterminée plus tôt pour d.Soustraire la dmin de l’espacement d’aimant calculé, d. Le résultat est la distance que la plaque magnétique doit parcourir à partir de sa position nulle pour atteindre l’arrière-charge désirée. Tapez cette valeur dans le champ d’entrée Target Position one dans le panneau Motion et cliquez sur Go pour ajuster le chargeur arrière du tissu cardiaque conçu à la valeur calculée.Le contrôle d’un MREHT produit à partir de cœurs de rat a été cultivé en l’absence de charge magnétique jusqu’à ce qu’un plateau de force contractile soit atteint. Ce jour-là, les MREHTs et les EHT contrôlés avaient des forces moyennes similaires. Au cours de la semaine suivante, la charge après charge exercée sur les TSMR a été progressivement augmentée, qui est passée du point neuf à six points huit cinq millinewtons par millimètre, tandis que la charge après charge pour le contrôle des EHT est demeurée constante.La force contractile moyenne a augmenté avec l’augmentation du chargeur jusqu’au point neuf cinq millinewton, ce qui marque plus d’une triple augmentation de la force par rapport à la valeur moyenne mesurée pour les EHT contrôlés. La déflexion de poteau d’autre part a diminué comparée aux tissus de contrôle. Le dernier jour de culture, la déviation principale mesurée pour les MREHTs n’était que d’un point d’un millimètre, comparativement au point quatre huit millimètres pour le contrôle de l’EHT.Rad EHTs sur les poteaux de silicone magnétiquement sensibles ont été cultivés à un afterload minimal de point neuf un millinewton par millimètre jusqu’à ce qu’un plateau et la force contractile ait été atteint. À partir de ce jour, mrehts a subi un régime de sept jours après charge qui exposent les EHTs à des cycles de afterload alternant entre le point neuf un et six points huit cinq millinewton par millimètre. L’après-chargement de l’EHT de contrôle a été maintenu constant au point six millinewton zéro par millimètre sur toute la durée de la culture.Les différences observées n’étaient pas statistiquement significatives. Combinée à l’analyse optique de la contractilité, cette méthode permet de mesurer en temps réel la réponse contractile à court terme aux magnitudes fluctuantes de la charge après charge, ce qui pourrait être utile pour étudier les propriétés physiologiques musculaires. Les aimants puissants peuvent soudainement s’accrocher les uns aux autres, causant potentiellement des dommages à l’utilisateur et endommageant les aimants eux-mêmes, pour éviter cela, garder l’aimant séparé à une distance sûre.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

Analyse du développement des cardiomyocytes par immunofluorescence dans le Coeur embryonnaires de souris

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Recherche

Biologie du développement

Improved Generation of Induced Cardiomyocytes Using a Polycistronic Construct Expressing Optimal Ratio of Gata4, Mef2c and Tbx5

Génération améliorée de cardiomyocytes induite en utilisant une construction polycistroniques Exprimant rapport optimal de Gata4, MEF2C et Tbx5

Direct conversion of cardiac fibroblasts (CFs) into induced cardiomyocytes (iCMs) holds great potential for regenerative medicine by offering alternative ...

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

Régulation épigénétique de Cardiac Différenciation des cellules et tissus souches embryonnaires

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

Maturation of Human Stem Cell-derived Cardiomyocytes in Biowires Using Electrical Stimulation

Maturation des cardiomyocytes dérivés de cellules souches humaines dans la stimulation électrique Biowires utilisant

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Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and ...

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In Vitro Generation of Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells

In Vitro Generation of Mouse Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells In Vitro Generation of Mouse Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells In Vitro Generation of Mouse Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells In Vitro

Pluripotent stem cells offer great potential for understanding heart development and disease and for regenerative medicine. While recent advances in ...

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Analyse des malformations cardiaques congénitales chez les embryons de souris à l’aide de méthodes histologiques qualitatives et quantitatives

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