Name: magnetic adjustment of afterload in engineered heart tissues
Uploaded: 2020-05-05T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Magnetic Adjustment of Afterload in Engineered Heart Tissues at JoVE.com

המחברים מודים Jutta Starbatty על התמיכה שלה בעבודת התרבות רקמה, אקסל קירשהוף לצילום, אליס Casagrande סקונטו לעריכת עבודה, ותודות מיוחדת בולנט Aksehirlioglu לתמיכה טכנית בפיתוח של התקן זה. בי בי היה נתמך על ידי DZHK (המרכז הגרמני למחקר לב וכלי דם) המלומד גרנט, M.L.R. על ידי ויטאקר הבינלאומי בתר דוקטורט גרנט ו M.N.H. על ידי קרנות מן DZHK.

1. הכנת פלטפורמת הכוונון של Afterload
הערה: השלבים המעורבים בחלק זה של הפרוטוקול אינם תלויי-זמן.
<ol><li>ייצור מתלים ממגנטים הקשובים לסיליקון הערה: ארונות תקשורת אלה משמשים כפלטפורמת התרבות של EHTs. כל EHT מושעה בין שני הודעות סיליקון, אשר מהקנות לטעון את הרקמה. דרג?...

<ol>
	<li>Zipes, D. P., Libby, P., Bonow, R. O., Mann, D. L., Tomaselli, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Braunwald's Heart Disease: A Textbook of Cardiovascular Medicine. 11th edn. , (2018).</li><li>McCain, M. L., Yuan, H., Pasqualini, F. S., Campbell, P. H., Parker, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+elasticity+regulates+the+optimal+cardiac+myocyte+shape+for+contractility.">Matrix elasticity regulates the optimal cardiac myocyte shape for contractility.</a> American Journal of Physiology- Heart and Circulatory Physiology. 306 (11), 1525-1539 (2014).</li><li>de Groot, P. C., van Dijk, A., Dijk, E., Hopman, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preserved+cardiac+function+after+chronic+spinal+cord+injury.">Preserved cardiac function after chronic spinal cord injury.</a> Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 87 (9), 1195-1200 (2006).</li><li>Perhonen, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+atrophy+after+bed+rest+and+spaceflight.">Cardiac atrophy after bed rest and spaceflight.</a> Journal of Applied Physiology. 91 (2), 645-653 (2001).</li><li>Levy, D., Larson, M. G., Vasan, R. S., Kannel, W. B., Ho, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+progression+from+hypertension+to+congestive+heart+failure.">The progression from hypertension to congestive heart failure.</a> Journal of the American Medical Association. 275 (20), 1557-1562 (1996).</li><li>Levy, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+trends+in+the+incidence+of+and+survival+with+heart+failure.">Long-term trends in the incidence of and survival with heart failure.</a> The New England Journal of Medicine. 347 (18), 1397-1402 (2002).</li><li>Maggioni, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EURObservational+Research+Programme:+regional+differences+and+1-year+follow-up+results+of+the+Heart+Failure+Pilot+Survey+(ESC-HF+Pilot).">EURObservational Research Programme: regional differences and 1-year follow-up results of the Heart Failure Pilot Survey (ESC-HF Pilot).</a> European Journal of Heart Failure. 15 (7), 808-817 (2013).</li><li>Mozaffarian, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+disease+and+stroke+statistics--2015+update:+a+report+from+the+American+Heart+Association.">Heart disease and stroke statistics--2015 update: a report from the American Heart Association.</a> Circulation. 131 (4), 29 (2015).</li><li>Klautz, R. J., Teitel, D. F., Steendijk, P., van Bel, F., Baan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+afterload+and+contractility+in+the+newborn+heart:+evidence+of+homeometric+autoregulation+in+the+intact+circulation.">Interaction between afterload and contractility in the newborn heart: evidence of homeometric autoregulation in the intact circulation.</a> Journal of the American College of Cardiology. 25 (6), 1428-1435 (1995).</li><li>Liedtke, A. J., Pasternac, A., Sonnenblick, E. H., Gorlin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+canine+ventricular+dimensions+with+acute+changes+in+preload+and+afterload.">Changes in canine ventricular dimensions with acute changes in preload and afterload.</a> The American Journal of Physiology. 223 (4), 820-827 (1972).</li><li>Toischer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+cardiac+remodeling+in+preload+versus+afterload.">Differential cardiac remodeling in preload versus afterload.</a> Circulation. 122 (10), 993-1003 (2010).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Hypertrophy+and+Increased+Susceptibility+to+Spontaneous+Calcium-Release+of+Rat+Left+Atrial+Myocytes+Due+to+Elevated+Afterload.">Cellular Hypertrophy and Increased Susceptibility to Spontaneous Calcium-Release of Rat Left Atrial Myocytes Due to Elevated Afterload.</a> PloS one. 10 (12), 0144309 (2015).</li><li>Hori, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loading+sequence+is+a+major+determinant+of+afterload-dependent+relaxation+in+intact+canine+heart.">Loading sequence is a major determinant of afterload-dependent relaxation in intact canine heart.</a> The American Journal of Physiology. 249, 747-754 (1985).</li><li>Schotola, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contractile+adaption+to+preload+depends+on+the+amount+of+afterload.">The contractile adaption to preload depends on the amount of afterload.</a> ESC Heart Failure. 4 (4), 468-478 (2017).</li><li>Sonnenblick, E. H., Downing, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Afterload+as+a+primary+determinat+of+ventricular+performance.">Afterload as a primary determinat of ventricular performance.</a> The American Journal of Physiology. 204, 604-610 (1963).</li><li>Hirt, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+afterload+induces+pathological+cardiac+hypertrophy:+a+new+in+vitro+model.">Increased afterload induces pathological cardiac hypertrophy: a new in vitro model.</a> Basic Research in Cardiology. 107 (6), 307 (2012).</li><li>Hirt, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+microRNA+signature+of+pathological+cardiac+hypertrophy+by+engineered+heart+tissue-+and+sequencing-technology.">Deciphering the microRNA signature of pathological cardiac hypertrophy by engineered heart tissue- and sequencing-technology.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 81, 1-9 (2015).</li><li>Dorn, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fuzzy+logic+of+physiological+cardiac+hypertrophy.">The fuzzy logic of physiological cardiac hypertrophy.</a> Hypertension. 49 (5), 962-970 (2007).</li><li>Hill, J. A., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+plasticity.">Cardiac plasticity.</a> The New England Journal of Medicine. 358 (13), 1370-1380 (2008).</li><li>Maillet, M., van Berlo, J. H., Molkentin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+physiological+heart+growth:+fundamental+concepts+and+new+players.">Molecular basis of physiological heart growth: fundamental concepts and new players.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (1), 38-48 (2013).</li><li>Stenzig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+in+an+engineered+heart+tissue+model+of+cardiac+hypertrophy:+common+signatures+and+effects+of+DNA+methylation+inhibitors.">DNA methylation in an engineered heart tissue model of cardiac hypertrophy: common signatures and effects of DNA methylation inhibitors.</a> Basic Research in Cardiology. 111 (1), 9 (2016).</li><li>Werner, T. R., Kunze, A. C., Stenzig, J., Eschenhagen, T., Hirt, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blockade+of+miR-140-3p+prevents+functional+deterioration+in+afterload-enhanced+engineered+heart+tissue.">Blockade of miR-140-3p prevents functional deterioration in afterload-enhanced engineered heart tissue.</a> Scientific Reports. 9 (1), 11494 (2019).</li><li>Leonard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Afterload+promotes+maturation+of+human+induced+pluripotent+stem+cell+derived+cardiomyocytes+in+engineered+heart+tissues.">Afterload promotes maturation of human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes in engineered heart tissues.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 118, 147-158 (2018).</li><li>Rodriguez, M. L., Werner, T. R., Becker, B., Eschenhagen, T., Hirt, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetics-Based+Approach+for+Fine-Tuning+Afterload+in+Engineered+Heart+Tissues.">Magnetics-Based Approach for Fine-Tuning Afterload in Engineered Heart Tissues.</a> ACS Biomaterials Science &amp; Engineering. 5 (7), 3663-3675 (2019).</li><li>Mannhardt, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Contraction+Analysis+of+Human+Engineered+Heart+Tissue+for+Cardiac+Drug+Safety+Screening.">Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (122), e55461 (2017).</li></ol>

הפרוטוקול המתואר להלן מתאר טכניקה חדשה לצורך שינוי מגנטית של העמסה ברקמות הלב. טכניקה זו מסתמכת על השימוש בשלב פיזואלקטריים כדי לתרגם צלחת של מגנטים חזקים כלפי והרחק מארונות מגנזיום תגובה של הודעות סיליקון. ככל ששני סטים של מגנטים, חזקה העומס שחוו על ידי EHTs תרבותי עליהם.
קי?...

Afterload הוא עומס סיסטולי על החדר אחרי זה התחיל להוציא דם1. במהלך התפתחות הלב, המטען המתאים הוא בחשיבות קריטית עבור התבגרות הקרדיוציט2. בבגרות, רמות נמוכות של העומס החדרית (למשל, בחולים למיטה עם פציעה ברמה גבוהה בחוט השדרה3 או במקרים מיוחדים מאוד כמו טיסה4) יכול לגרום היפופרס של הלב. לעומת זאת, העומס הגבוה יכול להוביל להיפרפרס5. בעוד היפרפרס לב בספורטאים סיבולת או נשים בהריון נחשב מועיל פיסיולוגי, יפרטרופיה הקשורים ביתר לחץ דם עורקים לטווח ארוך או היצרות חמורה של שסתום אבי העורקים הוא מזיק כפי שהוא מקדם אחד להפרעות בקצב הלב וספיקת לב6. למרות שיעור התמותה 5 שנים עבור חולים אי ספיקת לב הופחת מ ~ 70%בשנות ה-80 ל-40-50%7 כיום, יש עדיין צורך גדול אפשרויות טיפול רפואי חדש עבור מצב זה שכיח מאוד (כיום 2.2% האוכלוסייה בעולם המערבי)8.
כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים של היפרפרס הלב הפתולוגי ולבחון אסטרטגיות מונעות או טיפוליות לטיפול במחלה זו, בvivo מודלים של מטען אחרי פותחו9,10,11,12. בעוד מודלים אלה הציעו תובנות מועילות לתוך ההשפעות של העומס afterload ביצועים חדרית, הם אינם מאפשרים שליטה עדינה על בהירות העומס afterload לחילופין, במחקרים בלתי מתורבת של afterload שבוצעו על לבבות מוכי ההכנות שרירים לאפשר שליטה עדינה יותר על טעינת רקמות, אבל מודלים אלה אינם מסייעות למחקרים האורך13,14,15.
כדי להתגבר על בעיות אלה, פיתחנו מודל מבחנה של העומס האחורי ברקמות הלב מהונדסים (ehts)16,17. מודל זה הוא בפורמט תלת מימדי התרבות עבור תאי לב חולדה מוטבע מטריצה פיברוב מושעה בין הודעות סיליקון גמיש החלול. רקמות אלה היכו באופן ספונטני (נגד ההתנגדות של הודעות הסיליקון) ולבצע עבודה הקלה. יש לנו הגדלת afterload להחיל EHTs על ידי גורם של 12 בניסויים קודמים על ידי החדרת של מתכת נוקשה לתוך הודעות סיליקון חלול לשבוע אחד. זה הוביל להמון שינויים, מאפיין של לב פתולוגי היפרפרס18,19,20: היפראוטוציט היפר, נמק חלקי, ירידה בכוח כריתת העור, ליקוי של הרפיה רקמות, ההפעלה מראש של תוכנית הגן העובר, משמרת מטבולית של חמצון חומצות שומן כדי גליקולוליזיס אנאירובי, ועלייה פיברוזיס. למרות הליך זה הועסק בהצלחה במספר מחקרים17,21,22, יש לו כמה חסרונות. יש רק שתי מדינות, נמוך או גבוה מאוד (12 קיפול) afterload, ואת ההליך דורש טיפול ידני של EHTs, אשר מגביל את הגמישות הטמפורלית שלה מהווה את הסיכון לזיהום.
לאחרונה, ליאונרד ואח ' השתמשו בטכניקה דומה לווסת את העומס שאחרי ב EHTs תרבותי על הודעות סיליקון23. מסולסלים של אורכים שונים הוצבו סביב החלק החיצוני של ההודעות כדי להגביל את התנועה כיפוף שלהם. המחברים של מחקר זה דיווחו כי גידול יחיד קטן בינוני בעומס כוח משופר התפתחות והתבגרות של האדם הנגזר של ה-iPS, בעוד נטען גבוה יותר הביא למצב פתולוגי. עם זאת, בדומה למערכת שלנו, טכניקה זו מאפשרת רק להגברת היחיד בעומס האחר, בסדר הגודל שהוא מוכתב על-ידי אורך הגשר. ככזה, שינויים עדינים ב-afterload, שינויים ב-afterload לאורך זמן, משטרי טעינה מדויקת אינם אפשריים עם טכניקות אלה.
כאן, אנו מספקים את הפרוטוקול עבור מערכת שיכולה לשמש לווסת לאחר ההתנגדות, כלומר, אחרי העומס של EHTs מגנטוסטי24. פלטפורמה זו מקלה על הכיוונון העדין של afterload, מאפשר משטרי משתמש מוגדרים על ידי המשתמש, ומבטיח עקרות EHT.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cylindrical plate magnets</td>
			<td>HKCM</td>
			<td>9962-55184</td>
			<td>h = 14 mm, d = 13 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cylindrical post magnets</td>
			<td>HKCM</td>
			<td>9962-63571</td>
			<td>h = 2 mm, d = 0.5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental wire</td>
			<td>Ormco</td>
			<td>266-1316</td>
			<td>d = 0.016 inches (0.406 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad</td>
			<td>GraphPad Software, La Jolla, California, USA</td>
			<td>version 6.00 for Windows</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motion control software for piezo motor</td>
			<td>Micronix USA</td>
			<td></td>
			<td>free download on manufacturer homepage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motion controller for piezo motor</td>
			<td>Micronix USA</td>
			<td>MMC-100-01000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical contractility analysis platform</td>
			<td>EHT technologies</td>
			<td>A0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piezoelectric linear motor</td>
			<td>Micronix USA</td>
			<td>PPS-20-15206</td>
			<td>fitted with linear optical encoder, incubator-environment compatible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Styrene Rod</td>
			<td>Plastruct</td>
			<td>MR-15</td>
			<td>d= 0.015 inches (0.381 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB camera</td>
			<td>Reichelt Elektronik</td>
			<td>REFLECTA 66142</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

magnetic adjustment of afterload in engineered heart tissues

לאחר העומס ידוע לנהוג בהתפתחות של מצבי לב פיסיולוגיים ופתולוגיים. ככזה, לימוד התוצאות של מצבי העמסה שונה יכול להניב תובנות חשובות למנגנונים השולטים בתהליכים קריטיים אלה. עם זאת, טכניקה ניסיונית לכוונון מדויק של המטען ברקמת הלב לאורך זמן חסרה כעת. כאן, הטכניקה החדשה שפותחה מבוססי מגנטיקה להשגת שליטה זו ברקמות הלב (EHTs) מהונדסים. על מנת לייצר EHTs להגיב מגנטי (MR-EHTs), הרקמות הם רכוב על הודעות סיליקון חלול, כמה מהם מכילים מגנטים קבועים קטנים. קבוצה שנייה של מגנטים קבועים הוא ללחוץ על התאמה לתוך צלחת אקריליק כגון שהם מכוונים עם קוטביות זהה והם מיושרים עם מגנטים פוסט. כדי להתאים את העומס, צלחת זו של מגנטים מתורגמת לכיוון (מטען אחר גבוה יותר) או משם (afterload התחתון) מתוך הפוסט magnets באמצעות שלב פיזואלקטריים מצויד מקודד. תוכנת בקרת התנועה המשמשת להתאמת מיקום הבמה מאפשרת פיתוח של משטרי משתמש מוגדרים על ידי המשתמש בעוד המקודד מבטיח כי השלב מתקן עבור כל חוסר עקביות במיקומו. עבודה זו מתארת את הייצור, הכיול והיישום של מערכת זו כדי לאפשר פיתוח של פלטפורמות דומות במעבדות אחרות ברחבי העולם. תוצאות הנציגים משני ניסויים נפרדים נכללים כדי להדגים את מגוון המחקרים השונים שניתן לבצע באמצעות מערכת זו.

מגנט פוסט נוקשות לכמת מגנטי מונחה אופקית התגובה לפוסט סיליקון הותקן במצב קבוע, ו מגנט כיול מיושר axially הוצב בכמה מרחקים מוגדרים ("מגנט הרווחים") מתוך הודעה זו. העומס מבחן של משקל ידוע הושעו מסוף הפוסט סיליקון, גורם לעמוד לכופף. הטיה זו היתה מקוונטית. מערכת יחסים קווית בין כוח הכבידה...

Watch this Scientific Journal Video about Magnetic Adjustment of Afterload in Engineered Heart Tissues at JoVE.com

Magnetic Adjustment of Afterload in Engineered Heart Tissues

פרוטוקול זה מספק שיטות מפורטות המתארות את ייצור ויישום של פלטפורמת כוונון afterload מבוססי מגנטיקה עבור רקמות לב מהונדסים.

התאמה מגנטית של מטען אחרי ברקמות הלב מהונדסים

Afterload is known to drive the development of both physiological and pathological cardiac states. As such, studying the outcomes of altered afterload ...

מערכת זו יכולה לשמש כדי לחשוף רקמות לב מהונדסות משטרים שונים של א לאחר העומס, על מנת ללמוד את ההשפעות של גירויים אלה על פיתוח כוח רקמות, שיפוץ והתבגרות. הטכניקה שלנו מאפשרת להתוות במדויק רקמות מכות למגוון רחב של שגרות א-מטען הניתנות להתאמה אישית על פני תקופות ממושכות של תרבות מבלי אפילו לפתוח את צלחת תרבות התא. השיטה שלנו יכולה להיות מותאמת כדי לשלוט לאחר העומס במערכת אחרת של תרבות רקמת שריר, כגון שריר השלד, שריר חלק או שריר הפפילרי excised.מכיוון שגישת המערכות שלנו היא ייחודית למדי וכוללת היבטים טכניים שמדענים רבים אינם מכירים, הדגמה חזותית עשויה לסייע בשחזור ההתקנה שלנו. כדי לייצר את מתלי הסיליקון המגיבים מגנטית, לרכוש את 24 צלחת גם יכול לחתור מתלים של עמדות סיליקון המתוארים בפרוטוקול הטקסט. בעזרת קוטביות קבועה, שימון את המגנטים במים והכנס אותם בזה אחר זה לפוסטים החיצוניים ביותר של מתלי הסיליקון.השתמש חתיכה מעורבת של חוט שיניים נירוסטה כדי לדחוף אותם בזהירות לתחתית חלל פוסט חלול. ניתן לערום עד חמישה מגנטים בכל פוסט. השתמש צבת האף עגול לכופף חוטי שיניים נירוסטה לתוך גשר 11.25 מילימטרים רחב ו 15 מילימטרים ארוכים.כדי להבטיח את הממדים הנכונים מושגים, אפשר להשתמש jig תוצרת עצמית כדי לסייע כיפוף חוט, ולאחר מכן להשתמש חותכי תיל לחתוך את הפלטה ואת הקובץ כדי להחליק את משטח החיתוך. לשמן את הפלטה או הודעות עם מים ולהכניס אותם לתוך ארון התקשורת סיליקון תיקון השני והשלישי להודעה החיצונית ביותר בתהליך. התחל להכין את ההתקן לאחר הטעינה כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט, לצרף למחזיק המגנט לשלב piezoelectric באמצעות חומר לא מגנטי, זה יכול להיות מושגת באמצעות חתיכת אלומיניום בצורת L.כדי לאפשר ניתוח חזותי של הרקמות, התקן מקור אור בתוך התקן כוונון לאחר הטעינה. כאן מערך של LED הועסק כדי להאיר את המהנדס לרקמות לב מלמטה. כדי לכייל את מערכת הכוונון לאחר העומס, הר את אחד מתלי הסיליקון ולהשתמש אנכית בחומרים שאינם מגנטיים, כך שהודעות הסיליקון המגיבות מגנטית מכוונות אופקית.עכשיו לעלות אחד מגנטים צלחת על במה ליניארית נסיעה אופקית, כך שהוא מיושר באופן אקסיאלי עם פוסט מגיב מגנטית. מקם את מגנט הכיול במרחק מוגדר מעמדת סיליקון מגיבה מגנטית באמצעות השלב האופקי. מקם מצלמה בצד של התקנה זו כדי להיות מסוגל להקליט באופן אופטי את הסטת ההודעות תחת השפעת עומסי הבדיקה.ודא כי יש מספיק מקום מתחת להודעה עבור העומסים המצורפים לתלות בחופשיות. צלם תמונה של הפוסט בהיעדר משקולות שיש להשתמש בהן כהפניה למיקום הניטרלי של הפוסטים. מבלי לשנות את נקודת המבט של המצלמה, לצרף את אחד העומסים לקצה של פוסט סיליקון, ואז לצלם את הפוסט מתכופף תחת השפעת המשקל.עכשיו גרף את ההטיה של עמוד הסיליקון על ציר x נגד כוח הכבידה של כל משקל מבחן על ציר y. זה אמור להניב קשר ליניארי בין כוח להטיה. התווה פונקציית רגרסיה ליניארית העוברת דרך 00 והנתונים הנרכשים.השיפוע של פונקציה זו הוא הנוקשות, k של פוסט סיליקון מגיב מגנטית במרווח מגנט נבדק. חזור על שלבים אלה במספר מרווחים בין dmax ל- dmin. כאן נותחו הסטות בשמונה עמדות מגנט שונות, הנעות בין כ-31 מילימטרים לחמישה מילימטרים.הרבה רגרסיה מתפקדת דרך ערכים אלה. לדוגמה, השתמש בפונקציית ריקבון לא ליניארית, פונקציית ריקבון שלבית אחת בתוכנת הניתוח. פונקציית רגרסיה זו מתארת את הקשר בין מרווח מגנט לבין עומס לאחר מכן.כדי להכין את התקן הכוונון לאחר העומס לניסויים, חבר את מנוע הבמה הפיזואלקטרי לבקר התנועה וחבר את בקר התנועה למחשב. ודא שבקר התנועה מחובר גם למקור מתח. לאחר מכן הפעל את תוכנת פלטפורמת בקר התנועה, חבר את התוכנה למנוע הבמה piezo על-ידי בחירת היציאה המיועדת כלוח הבמה במהלך ההתקנה של תוכנת בקרת התנועה ולאחר מכן לחץ על לחצן היציאה הפתוחה.עבור אל לוח המערכת, בחר לולאה פתוחה, בתפריט הנפתח לולאה. הזיזו ידנית את לוחית המגנט למיקום הגבוה ביותר שלה, מרווח המגנט הקרוב ביותר האפשרי. צלחת המגנט צריכה ליצור קשר עם הר צלחת התרבות.עכשיו עבור אל לוח התנועה, כמו כפתור האפס כדי לאפס את המיקום הנוכחי של שלב הפיזו לאפס מילימטרים. הזז ידנית את להב המגנט למיקום הנמוך ביותר האפשרי, רשום את מיקום המקדם כדי לקבוע את טווח התנועה של מנוע הבמה הפיזואלקטרי. הגדר את מגבלות הנסיעה בחלונית המערכת לערכים בטווח התנועה שנקבע בשלב הקודם.פעולה זו מונעת מלהב המגנט להיתקל בלהב התרבות או בתחתית התקן הכוונון לאחר הטעינה. שוב, להזיז את להב המגנט למיקום הגבוה ביותר שלה ולחץ על כפתור אפס. עבור אל לוח המערכת ושנה את מצב לולאת המשוב ללולאה סגורה, פעולה זו מבטיחה שהבמה תתוקן עבור שגיאות במיקום שלה.לחץ על לחצן השמירה בתיבה פרמטרי מאגר כדי לאחסן הגדרות אלה במערכת. עכשיו למקם את צלחת תרבות 24 היטב המכיל רקמות לב מהונדסות על מתלי סיליקון מגיב מגנטית על הר צלחת התרבות. כדי לחשב את מרווח המגנט הדרוש כדי להשיג את העומס הרצוי, לפתור את פונקציית הרגרסיה הלא ליניארית שנקבעה קודם לכן עבור d.הפחת dmin ממרווח המגנט המחושב, ד. התוצאה היא המרחק שיש לצלחת המגנט לנסוע מעמדת האפס שלה כדי להשיג את העומס הרצוי. הקלבו ערך זה בשדה הקלט 'מיקום יעד' אחד בחלונית 'תנועה' ולחצו על 'עבור' להתאמת העומס של רקמת הלב המהונדסת לערך המחושב.שליטה MREHTs המיוצר לבבות חולדה היו מתורבתים בהיעדר עומס מגנטי עד מישור בכוח מתכווץ הושג. ביום זה, MREHTs ו EHTs נשלט היו כוחות ממוצעים דומים. במהלך השבוע שלאחר מכן, העומס שהופעל על MREHTs הוגדל בהדרגה מנקודה 9 אחת לשש נקודה שמונה חמש מילניטון למילימטר, בעוד העומס לשליטה EHTs נשאר קבוע.כוח התכווצות ממוצע גדל עם הגדלת לאחר עומס עד לנקודה תשע חמש מילינוטון, אשר מסמן יותר משלושה פי עלייה בכוח לעומת הערך הממוצע נמדד עבור EHTs מבוקר. הסטת פוסט מצד שני ירדה בהשוואה לרקמות בקרה. ביום האחרון של התרבות ההטיה העיקרית שנמדדה עבור MREHTs הייתה רק נקודה אחת מילימטר אחד, לעומת נקודה ארבעה שמונה מילימטרים עבור שליטה EHT של.Rad EHTs על עמדות סיליקון מגיב מגנטית היו מתורבתים בעומס מינימלי של נקודה תשע מיליניוטון אחד למילימטר עד מישור וכוח מתכווץ הושג. מיום זה ואילך, MREHTs עבר משטר של שבעה ימים לאחר העומס אשר חושף את EHTs למחזורים של א-מטען לסירוגין בין נקודה 9 אחת ושש נקודה שמונה חמישה מילינוטון למילימטר. העומס של שליטה EHT של נשמר קבוע בנקודה שש אפס מילניוטון למילימטר לאורך כל משך התרבות.ההבדלים שנצפו לא היו מובהקים סטטיסטית. בשילוב עם ניתוח התכווצות אופטית, שיטה זו מאפשרת מדידה בזמן אמת של תגובה מתכווצות לטווח קצר לתנודות בסדרי גודל של א לאחר העומס, אשר יכול להיות שימושי עבור חקירת תכונות שריר פיזיולוגי. מגנטים חזקים עלולים לפתע להיאחז זה בזה, דבר שעלול לגרום לפגיעה במשתמש ולפגיעה במגנטים עצמם, כדי למנוע זאת, לשמור על המגנט מופרד במרחק בטוח.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

ניתוח של Cardiomyocyte פיתוח באמצעות Immunofluorescence בלב העכבר עוברי

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Improved Generation of Induced Cardiomyocytes Using a Polycistronic Construct Expressing Optimal Ratio of Gata4, Mef2c and Tbx5

דור משופר של המושרה cardiomyocytes שימוש Construct Polycistronic הבעת יחס אופטימלי של Gata4, Mef2c וTbx5

Direct conversion of cardiac fibroblasts (CFs) into induced cardiomyocytes (iCMs) holds great potential for regenerative medicine by offering alternative ...

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

תקנה אפיגנטיים של לב בידול בתאי גזע עובריים ורקמות

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

Maturation of Human Stem Cell-derived Cardiomyocytes in Biowires Using Electrical Stimulation

התבגרות של האדם גזע גזע נגזר Cardiomyocytes ב ביאוירס באמצעות גירוי חשמלי

Human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hPSC-CMs) have been a promising cell source and have thus encouraged the investigation of their ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

שיטת Organotypic תרבות ללמוד על התפתחות עובריים עוף רקמות

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart

בתיווך Nanoparticle siRNA ג'ין להחרשת בלב דג זברה למבוגרים

Mammals have a very limited capacity to regenerate the heart after myocardial infarction. On the other hand, the adult zebrafish regenerates its heart ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone

הכנה לרקמה וכתמים של רקמות הגולגולת והעצמות הבלתי מתויטות

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Microinjection-מערכת מבוססת עבור-Vivo השרשת Cardiomyocytes עובריים בתוך העובר העופות

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

In Vitro Generation of Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells

בדור מחוץ לתחום של לב העכבר שדה מסוים בתאי לב

Pluripotent stem cells offer great potential for understanding heart development and disease and for regenerative medicine. While recent advances in ...

Analysis of Congenital Heart Defects in Mouse Embryos Using Qualitative and Quantitative Histological Methods

ניתוח של פגמים לב מולדים בעוברי עכבר באמצעות שיטות היסטולוגית איכותית וכמותית

Congenital heart defects (CHD) are the most common type of birth defect in humans, affecting up to 1% of all live births. However, the underlying causes ...