Name: magnetic adjustment of afterload in engineered heart tissues
Uploaded: 2020-05-05T13:30:00
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著者らは、組織培養作業におけるジュッタ・スターバティの支援、写真のためのアクセル・キルヒホフ、編集作業のためのアリス・カサグランデ・セスコネット、そしてこの装置の開発における技術支援のためのビュレント・アクセヒリリオグルへの特別な感謝に感謝する。B.B.は、DZHK(ドイツ心臓血管研究センター)スカラーグラント、M.L.R.によってウィテカー国際博士研究員グラントとM.N.H.によってDZHKからの資金によって支援されました。

1. アフターロードチューニングプラットフォームの準備
注:プロトコルのこの部分に関連する手順は時間を区別しません。
<ol><li>磁気応答性シリコーンラックの製造 注:これらのラックは、Ehts のカルチャ プラットフォームとして機能します。各EHTは、組織に後負荷を与える2つのシリコーンポストの間に懸濁される。後荷重の程度は、これら?...

<ol>
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N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetics-Based+Approach+for+Fine-Tuning+Afterload+in+Engineered+Heart+Tissues.">Magnetics-Based Approach for Fine-Tuning Afterload in Engineered Heart Tissues.</a> ACS Biomaterials Science &amp; Engineering. 5 (7), 3663-3675 (2019).</li><li>Mannhardt, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Contraction+Analysis+of+Human+Engineered+Heart+Tissue+for+Cardiac+Drug+Safety+Screening.">Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (122), e55461 (2017).</li></ol>

本明細書で概説されるプロトコルは、工学的心臓組織における後荷重を磁気的に変化させる新しい技術を説明する。この技術は、圧電ステージを使用して、シリコンポストの磁気応答性ラックに向かって、または離れた強力な磁石のプレートを翻訳することに依存しています。2組の磁石が近いほど、Ehtが培養した後荷が強くなります。
このシステムの正常な生産と使用?...

後負荷は、血液1を排出し始めた後の心室の収縮期負荷である。心臓の発達の間、適切な後負荷は心筋細胞成熟2にとって非常に重要である。成人期には、心室後負荷の低レベル(例えば、高レベル脊髄損傷3または宇宙飛行4のような非常に特別な症例の寝たきりの患者において)は、心臓の低萎縮をもたらす可能性がある。逆に、高い後負荷は、心肥大5につながることができます。持久力運動選手または妊婦における心臓肥大は有益かつ生理的であると考えられるが、長期動脈性高血圧または重度の大動脈弁狭窄症に関連する肥大は、心不整脈および心不全に1つを素因とするので有害である6。心不全患者の5年死亡率は現在、1980年代の6~40~50%に70%から減少しているが、この非常に流行している状態(現在、欧米の人口の2.2%)に対する新たな治療治療オプションが依然として大きく必要とされている。
病理学的心臓肥大の分子機構を調査し、この疾患を治療するための予防または治療戦略をテストするために、後負荷のインビボモデルが99、10、11、1210,11,12を開発した。これらのモデルは、後負荷が心室性能に及ぼす影響に関する有益な洞察を提供しているが、後負荷の大きさを細かく制御することはできません。あるいは、切除された心臓および筋肉製剤に対して行われた後荷重のインビトロ研究は、組織負荷を細かく制御することを可能にするが、これらのモデルは縦断研究13、14、15,14,15に役立たない。
これらの問題を克服するために、我々は、設計された心臓組織(EHT)16、17,17における上昇後負荷のインビトロモデルを開発した。このモデルは、柔軟な中空シリコーンポストの間に懸濁されたフィブリンマトリックスに埋め込まれたラット心臓細胞の3次元培養フォーマットである。これらの組織は自発的に(シリコーンポストの抵抗に対して)打ち、食べられない作業を行う。我々は、1週間中空シリコーンポストに硬質金属ブレースを挿入することによって、以前の実験で12倍のATに適用された後負荷を増加させた。これは、病理学的心臓肥大18、19、2019,20の特徴18である多くの変化につながり、心筋細胞肥大、部分的な根落、収縮力の低下、組織弛緩の障害、胎児遺伝子プログラムの再活性化、脂肪酸酸化から嫌気性解糖への代謝シフト、線維化の増加を引き起こした。この手順は、いくつかの研究で成功して採用されています17,,21,,22,それはいくつかの欠点があります.低または非常に高い(12倍)後負荷の2つの状態しかなく、手順は、その時間的な柔軟性を制限し、汚染のリスクをもたらすEhtsの手動処理を必要とします。
最近、Leonardら.はシリコーンポスト23上で培養されたEHTで後負荷を調節するために同様の技術を使用した。様々な長さのブレースは、曲げ運動を制限するために、ポストの外側の周りに配置されました。本研究の著者は、ヒトiPS由来EhTの増加力の発達と成熟を強化した負荷の特異な小中増加が病理学的状態をもたらしたと報告した。しかし、私たちのシステムと同様に、この技術は、後荷重の単数の増加のみを可能にし、その大きさはブレースの長さによって決まります。したがって、後読みによる微調整、時間の経過に伴う後荷重の変更、およびこれらの手法では正確なロードレジメンは不可能です。
ここでは、後抵抗、すなわち、Ehtsの後負荷を磁気的に24に変調するために使用できるシステムのプロトコルを提供する。このプラットフォームは、後負荷の微調整を容易にし、ユーザー定義の後負荷レジメンを可能にし、EHTの無菌性を保証します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cylindrical plate magnets</td>
			<td>HKCM</td>
			<td>9962-55184</td>
			<td>h = 14 mm, d = 13 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cylindrical post magnets</td>
			<td>HKCM</td>
			<td>9962-63571</td>
			<td>h = 2 mm, d = 0.5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental wire</td>
			<td>Ormco</td>
			<td>266-1316</td>
			<td>d = 0.016 inches (0.406 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad</td>
			<td>GraphPad Software, La Jolla, California, USA</td>
			<td>version 6.00 for Windows</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motion control software for piezo motor</td>
			<td>Micronix USA</td>
			<td></td>
			<td>free download on manufacturer homepage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motion controller for piezo motor</td>
			<td>Micronix USA</td>
			<td>MMC-100-01000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical contractility analysis platform</td>
			<td>EHT technologies</td>
			<td>A0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piezoelectric linear motor</td>
			<td>Micronix USA</td>
			<td>PPS-20-15206</td>
			<td>fitted with linear optical encoder, incubator-environment compatible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Styrene Rod</td>
			<td>Plastruct</td>
			<td>MR-15</td>
			<td>d= 0.015 inches (0.381 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB camera</td>
			<td>Reichelt Elektronik</td>
			<td>REFLECTA 66142</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

magnetic adjustment of afterload in engineered heart tissues

後負荷は、生理学的および病理学的心臓状態の両方の発達を促進することが知られている。したがって、変更された後負荷状態の結果を研究することは、これらの重要なプロセスを制御するメカニズムに関する重要な洞察をもたらす可能性があります。しかしながら、時間の経過とともに心臓組織の後負荷を正確に微調整する実験的手法は現在欠けている。ここでは、この制御を工学的な心臓組織(EHT)で実現するための新開発の磁気ベースの技術について説明する。磁気応答性のEHT(MR-EHT)を生成するために、組織は中空シリコーンポストに取り付けられ、その一部には小さな永久磁石が含まれています。永久磁石の第2セットは、同じ極性で配向され、ポスト磁石と軸方向に整列するようにアクリルプレートに押し込まれています。後ろ荷重を調整するために、この磁石板はエンコーダを取り付けた圧電ステージを用いてポスト磁石から(高い後荷重)または離れた(低い後荷重)に変換されます。ステージの位置を調整するために使用されるモーションコントロールソフトウェアは、ユーザー定義の後荷重レジメンの開発を可能にし、エンコーダーは、ステージがその場所の不整合を修正することを保証します。この研究では、世界中の他のラボで同様のプラットフォームを開発できるように、このシステムの製造、キャリブレーション、および実装について説明します。2つの別々の実験の代表的な結果は、このシステムを用いて行うことができる異なる研究の範囲を例示するために含まれる。

磁石ポスト剛性定量 水平指向の磁気応答性シリコーンポストを固定位置に取り付け、このポストからいくつかの定義された距離(「磁石間隔」)に軸方向に整列したキャリブレーションマグネットを配置しました。既知の重量のテスト負荷は、シリコーンポストの端から懸濁され、ポストが曲がった。このたわみは光学的に定量した。試験負荷の重力と結果として生じるポスト?...

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Magnetic Adjustment of Afterload in Engineered Heart Tissues

このプロトコルは、工学的心臓組織のための磁気ベースの後負荷調整プラットフォームの製造および実装を記述する詳細な方法を提供する。

設計された心臓組織における後負荷の磁気調整

Afterload is known to drive the development of both physiological and pathological cardiac states. As such, studying the outcomes of altered afterload ...

このシステムは、組織力の発達、リモデリングおよび成熟に対するこれらの刺激の影響を研究するために、後負荷の様々なレジメンに設計された心臓組織を暴露するために使用することができる。我々の技術は、細胞培養板を開く必要もなく、培養の長期間にわたってカスタマイズ可能なアフターロードルーチンの広い範囲に正確に鼓動組織を置くことを可能にする。私たちの方法は、骨格筋、平滑筋または切除された乳頭筋などの他の筋肉組織培養システムの後負荷を制御するように変更することができます。私たちのシステムアプローチはかなりユニークであり、多くの科学者が精通していない技術的側面を備えているため、視覚的なデモンストレーションは私たちのセットアップを再現する際に役立つかもしれません。磁気応答性のシリコーンラックを製造するために、テキストプロトコルに記載されているシリコーンポストの24ウェルプレート缶ラックを入手します。固定の極性を使用して、磁石を水で潤滑し、シリコンラックの最も外側の支柱に一度に1つずつ挿入します。ステンレススチール製の歯科用ワイヤーを使用して、慎重に中空のポストキャビティの底に押し込みます。各ポストに最大5個の磁石を積み重ねることができます。丸い鼻のペンチを使用して、幅11.25ミリメートル、長さ15ミリメートルのブレースにステンレススチール製の歯科用ワイヤーを曲げなさい。正しい寸法を確実に達成するために、自作の治具を使用してワイヤーの曲げを助け、ワイヤーカッターを使用してブレースとファイルを切断して切断面を滑らかにすることができます。ブレースまたは支柱を水で潤滑し、2番目と3番目をプロセスの最も外側のポストに固定してシリコーンラックに挿入します。テキストプロトコルに記載されているように後負荷調整装置の準備を開始し、非磁性材料を用いて圧電ステージに磁石ホルダーに取り付け、これはL字型のアルミニウムを用いて達成することができる。組織の視覚的な分析を可能にするには、後負荷調整装置内に光源を取り付けます。ここでは、LEDの配列は、下から心臓組織にエンジニアを照らすのに採用されました。アフターロードチューニングシステムを校正するには、磁気応答性のシリコーンポストが水平に向くように、非磁性材料を使用してシリコンラックの1つを垂直に取り付けます。今度は、磁気応答性ポストと軸方向に整列するように水平走行直線段階にプレート磁石の1つを取り付けます。水平ステージを使用して、磁気応答性シリコーンポストからの定義された距離をキャリブレーションマグネットに配置します。テスト負荷の影響下でポストの偏向を光学的に記録できるように、このセットアップの側面にカメラを配置します。アタッチされた荷重が自由にハングアップするのに十分なスペースがポストの下に十分あることを確認します。ポストニュートラルポジションの基準として使用する重みがない場合は、投稿の写真を撮ります。カメラの視点を変えずに、シリコーンポストの一番端に荷重の1つを取り付け、重量の影響を受けてポストベンドの写真を撮ります。今度は、y 軸上の各試験重量の重力に対する x 軸上のシリコーン ポストの偏向をグラフ化します。これは、力と偏向の間の線形関係をもたらすはずです。00 と取得データを渡す線形回帰関数をプロットします。この関数の傾きは、テストされた磁石間隔での磁気応答性シリコーンポストの剛性kである。dmax と dmin の間の複数の間隔で、これらの手順を繰り返します。ここでは、約31ミリメートルから約5ミリメートルまでの8つの異なる磁石位置での偏向を分析した。これらの値を通して多くの回帰関数。たとえば、解析ソフトウェアでは、非線形適合、1つの位相減衰関数を使用します。この回帰関数は、マグネット間隔と後荷重の関係を記述します。実験用の後負荷調整装置を準備するには、圧電ステージモーターをモーションコントローラに接続し、モーションコントローラをコンピュータに接続します。モーションコントローラが電源にも接続されていることを確認します。次に、モーションコントローラプラットフォームソフトウェアを起動し、モーションコントロールソフトウェアのインストール中にステージボードとして指定されたポートを選択して、piezoステージモーターにソフトウェアを接続し、開いているポートボタンをクリックします。システムパネルに移動し、ループドロップダウンメニューで開いたループを選択します。手動で磁石プレートを最も高い位置、最も近い磁石間隔のdminに移動します。マグネットプレートは、培養プレートマウントと接触する必要があります。ここで、ゼロボタンのようにモーションパネルに移動して、ピエゾステージの現在位置をゼロミリメートルにリセットします。手動で磁石ブレードを可能な限り低い位置に移動し、エンコーダ位置を書き留めて圧電ステージモータの動きの範囲を決定します。システムパネルの移動制限を、前のステップで決定した運動の範囲内の値に設定します。これにより、マグネットブレードが培養ブレードや後負荷調整装置の底面にぶつかるのを防ぎます。もう一度、磁石の刃を最高位置に移動し、ゼロボタンをクリックします。システム・パネルに移動し、フィードバック・ループ・モードをクローズド・ループに変更すると、ステージの位置決めのエラーが確実に修正されます。これらの設定をシステムに保存するには、ストア パラメータ ボックスの保存ボタンをクリックします。次に、操作された心臓組織を含む24のウェル培養プレートを、培養プレートマウント上に磁気応答性のシリコーンラックに置きます。所望の後荷重を達成するために必要な磁石間隔を計算するために、dについて以前に決定した非線形回帰関数を解く。計算された磁石の間隔からdminを差し引きます。結果は、磁石プレートが望ましい後荷重を達成するためにゼロ位置から移動する距離です。この値をモーションパネルのターゲット位置 1 入力フィールドに入力し、「Go」をクリックして、設計された心臓組織の後荷重を計算値に調整します。ラット心臓から産生されたMREHTを制御し、収縮力の高原に達するまで磁気後負荷がない状態で培養した。この日、MREHTと制御されたEHTは同様の平均力を持っていました。翌週、MREHTに対して行われた後負荷は、ポイント9 1から6ポイント8 5ミリニュートン/ミリメートルに徐々に増加し、Ehtを制御するための後負荷は一定のままでした。平均収縮力は、9つのミリニュートンをポイントまで後負荷の増加に伴って増加し、制御されたEhTのために測定された平均値と比較して3倍以上の力の増加を示した。一方、制御組織に比べてポスト偏向が減少した。培養の最終日に、MREHTのために測定された主な偏向は、コントロールEHTのポイント4 8ミリメートルに比べて、1ミリメートルのポイントに過ぎませんでした。磁気応答性シリコーンポスト上のRad Ehtsは、高原および収縮力に達するまで、1ミリメートルあたり1ミリニュートンのポイント9の最小後負荷で培養した。この日以降、MREHTは7日間の後荷重レジメンを受け、1ミリメートルあたりポイント9 1と6ポイント8の間で交互に後負荷のサイクルにEHTを公開しました。コントロールEHTの後負荷は、培養期間全体にわたって1ミリメートル当たり60ミリニュートンの時点で一定に保たれた。観察された差は統計的に有意ではなかった。光学収縮性分析と組み合わせることで、後負荷の変動する大きさに対する短期収縮応答のリアルタイム測定が可能であり、生理学的筋肉特性の調査に有用である可能性がある。強い磁石が突然互いにしがみつき、ユーザーに損傷を与え、磁石自体を損傷させる可能性があり、これを避けるために、磁石を安全な距離で分離しておいてください。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

胚性マウスの心臓に免疫蛍光を用いて、心筋細胞の開発の分析

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

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GATA4、MEF2C及びTBX5の最適な比率を表現ポリシストロン構築物を用いて誘導心筋細胞の改善された世代

Direct conversion of cardiac fibroblasts (CFs) into induced cardiomyocytes (iCMs) holds great potential for regenerative medicine by offering alternative ...

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Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone

マウス頭蓋組織および非除電骨の組織調製と免疫染色

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

鳥胚胚心筋細胞の生体内注入にマイクロインジェクション ベース システム

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

In Vitro Generation of Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells

マウス心臓分野特異的心臓前駆細胞のインビトロ生成

Pluripotent stem cells offer great potential for understanding heart development and disease and for regenerative medicine. While recent advances in ...

Analysis of Congenital Heart Defects in Mouse Embryos Using Qualitative and Quantitative Histological Methods

定性・定量的組織学的手法を用いたマウス胚における先天性心不全の解析

Congenital heart defects (CHD) are the most common type of birth defect in humans, affecting up to 1% of all live births. However, the underlying causes ...