Name: magnetic adjustment of afterload in engineered heart tissues
Uploaded: 2020-05-05T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Magnetic Adjustment of Afterload in Engineered Heart Tissues at JoVE.com

Forfatterne takker Jutta Starbatty for hennes støtte i vevkulturarbeid, Axel Kirchhof for fotografering, Alice Casagrande Cesconetto for redigering av arbeid, og en spesiell takk til Bülent Aksehirlioglu for teknisk støtte i utviklingen av denne enheten. B.B. ble støttet av en DZHK (German Centre for Cardiovascular Research) Scholar Grant, M.L.R. av en Whitaker International Postdoctoral Scholar Grant og M.N.H. av midler fra DZHK.

1. Utarbeidelse av Afterload Tuning Platform
MERK: Trinnene som er involvert i denne delen av protokollen, er ikke tidsfølsomme.
<ol><li>Produksjon av magnetisk responsive silikonstativer MERK: Disse stativene fungerer som kulturplattform for EHTs. Hver EHT er suspendert mellom to silikonstolper, som gir etterlast til vevet. Graden av etterlast er direkte relatert til stivheten i disse innleggene. For å aktivere magnetisk etterbelastningsjustering må n...

<ol>
	<li>Zipes, D. P., Libby, P., Bonow, R. O., Mann, D. L., Tomaselli, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Braunwald's Heart Disease: A Textbook of Cardiovascular Medicine. 11th edn. , (2018).</li><li>McCain, M. L., Yuan, H., Pasqualini, F. S., Campbell, P. H., Parker, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+elasticity+regulates+the+optimal+cardiac+myocyte+shape+for+contractility.">Matrix elasticity regulates the optimal cardiac myocyte shape for contractility.</a> American Journal of Physiology- Heart and Circulatory Physiology. 306 (11), 1525-1539 (2014).</li><li>de Groot, P. C., van Dijk, A., Dijk, E., Hopman, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preserved+cardiac+function+after+chronic+spinal+cord+injury.">Preserved cardiac function after chronic spinal cord injury.</a> Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 87 (9), 1195-1200 (2006).</li><li>Perhonen, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+atrophy+after+bed+rest+and+spaceflight.">Cardiac atrophy after bed rest and spaceflight.</a> Journal of Applied Physiology. 91 (2), 645-653 (2001).</li><li>Levy, D., Larson, M. G., Vasan, R. S., Kannel, W. B., Ho, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+progression+from+hypertension+to+congestive+heart+failure.">The progression from hypertension to congestive heart failure.</a> Journal of the American Medical Association. 275 (20), 1557-1562 (1996).</li><li>Levy, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+trends+in+the+incidence+of+and+survival+with+heart+failure.">Long-term trends in the incidence of and survival with heart failure.</a> The New England Journal of Medicine. 347 (18), 1397-1402 (2002).</li><li>Maggioni, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EURObservational+Research+Programme:+regional+differences+and+1-year+follow-up+results+of+the+Heart+Failure+Pilot+Survey+(ESC-HF+Pilot).">EURObservational Research Programme: regional differences and 1-year follow-up results of the Heart Failure Pilot Survey (ESC-HF Pilot).</a> European Journal of Heart Failure. 15 (7), 808-817 (2013).</li><li>Mozaffarian, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+disease+and+stroke+statistics--2015+update:+a+report+from+the+American+Heart+Association.">Heart disease and stroke statistics--2015 update: a report from the American Heart Association.</a> Circulation. 131 (4), 29 (2015).</li><li>Klautz, R. J., Teitel, D. F., Steendijk, P., van Bel, F., Baan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+afterload+and+contractility+in+the+newborn+heart:+evidence+of+homeometric+autoregulation+in+the+intact+circulation.">Interaction between afterload and contractility in the newborn heart: evidence of homeometric autoregulation in the intact circulation.</a> Journal of the American College of Cardiology. 25 (6), 1428-1435 (1995).</li><li>Liedtke, A. J., Pasternac, A., Sonnenblick, E. H., Gorlin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+canine+ventricular+dimensions+with+acute+changes+in+preload+and+afterload.">Changes in canine ventricular dimensions with acute changes in preload and afterload.</a> The American Journal of Physiology. 223 (4), 820-827 (1972).</li><li>Toischer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+cardiac+remodeling+in+preload+versus+afterload.">Differential cardiac remodeling in preload versus afterload.</a> Circulation. 122 (10), 993-1003 (2010).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Hypertrophy+and+Increased+Susceptibility+to+Spontaneous+Calcium-Release+of+Rat+Left+Atrial+Myocytes+Due+to+Elevated+Afterload.">Cellular Hypertrophy and Increased Susceptibility to Spontaneous Calcium-Release of Rat Left Atrial Myocytes Due to Elevated Afterload.</a> PloS one. 10 (12), 0144309 (2015).</li><li>Hori, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loading+sequence+is+a+major+determinant+of+afterload-dependent+relaxation+in+intact+canine+heart.">Loading sequence is a major determinant of afterload-dependent relaxation in intact canine heart.</a> The American Journal of Physiology. 249, 747-754 (1985).</li><li>Schotola, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contractile+adaption+to+preload+depends+on+the+amount+of+afterload.">The contractile adaption to preload depends on the amount of afterload.</a> ESC Heart Failure. 4 (4), 468-478 (2017).</li><li>Sonnenblick, E. H., Downing, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Afterload+as+a+primary+determinat+of+ventricular+performance.">Afterload as a primary determinat of ventricular performance.</a> The American Journal of Physiology. 204, 604-610 (1963).</li><li>Hirt, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+afterload+induces+pathological+cardiac+hypertrophy:+a+new+in+vitro+model.">Increased afterload induces pathological cardiac hypertrophy: a new in vitro model.</a> Basic Research in Cardiology. 107 (6), 307 (2012).</li><li>Hirt, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+microRNA+signature+of+pathological+cardiac+hypertrophy+by+engineered+heart+tissue-+and+sequencing-technology.">Deciphering the microRNA signature of pathological cardiac hypertrophy by engineered heart tissue- and sequencing-technology.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 81, 1-9 (2015).</li><li>Dorn, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fuzzy+logic+of+physiological+cardiac+hypertrophy.">The fuzzy logic of physiological cardiac hypertrophy.</a> Hypertension. 49 (5), 962-970 (2007).</li><li>Hill, J. A., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+plasticity.">Cardiac plasticity.</a> The New England Journal of Medicine. 358 (13), 1370-1380 (2008).</li><li>Maillet, M., van Berlo, J. H., Molkentin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+physiological+heart+growth:+fundamental+concepts+and+new+players.">Molecular basis of physiological heart growth: fundamental concepts and new players.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (1), 38-48 (2013).</li><li>Stenzig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+in+an+engineered+heart+tissue+model+of+cardiac+hypertrophy:+common+signatures+and+effects+of+DNA+methylation+inhibitors.">DNA methylation in an engineered heart tissue model of cardiac hypertrophy: common signatures and effects of DNA methylation inhibitors.</a> Basic Research in Cardiology. 111 (1), 9 (2016).</li><li>Werner, T. R., Kunze, A. C., Stenzig, J., Eschenhagen, T., Hirt, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blockade+of+miR-140-3p+prevents+functional+deterioration+in+afterload-enhanced+engineered+heart+tissue.">Blockade of miR-140-3p prevents functional deterioration in afterload-enhanced engineered heart tissue.</a> Scientific Reports. 9 (1), 11494 (2019).</li><li>Leonard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Afterload+promotes+maturation+of+human+induced+pluripotent+stem+cell+derived+cardiomyocytes+in+engineered+heart+tissues.">Afterload promotes maturation of human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes in engineered heart tissues.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 118, 147-158 (2018).</li><li>Rodriguez, M. L., Werner, T. R., Becker, B., Eschenhagen, T., Hirt, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetics-Based+Approach+for+Fine-Tuning+Afterload+in+Engineered+Heart+Tissues.">Magnetics-Based Approach for Fine-Tuning Afterload in Engineered Heart Tissues.</a> ACS Biomaterials Science &amp; Engineering. 5 (7), 3663-3675 (2019).</li><li>Mannhardt, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Contraction+Analysis+of+Human+Engineered+Heart+Tissue+for+Cardiac+Drug+Safety+Screening.">Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (122), e55461 (2017).</li></ol>

Protokollen som er skissert her beskriver en ny teknikk for magnetisk endring av etterlast i konstruert hjertevev. Denne teknikken er avhengig av bruk av et piezoelektrisk stadium for å oversette en tallerken med sterke magneter mot og bort fra magnetisk responsive stativer av silikonstolper. Jo nærmere de to settene med magneter, desto sterkere etterlast erter eHTs kultivert på dem.
Det er flere trinn som er avgjørende for vellykket produksjon og bruk av dette systemet. Selv om det er mag...

Etterlast er systolisk belastning på ventrikkelen etter at den har begynt å kaste ut blod1. Under hjerteutvikling er en passende etterlast av kritisk betydning for kardiomycyttmodning2. I voksen alder kan lave nivåer av ventrikulær etterlast (f.eks. hos sengeliggende pasienter med ryggmargsskade på høyt nivå3 eller i svært spesielle tilfeller som romferd4) føre til hypotrofi i hjertet. Omvendt kan høy etterlast føre til hjertehypertrofi5. Mens hjertehypertrofi hos utholdenhetidrettsutøvere eller gravide kvinner anses som gunstig og fysiologisk, hypertrofi forbundet med langsiktig arteriell hypertensjon eller alvorlig aortaklaffstenose er skadelig da det predisponerer en til hjertearytmier og hjertesvikt6. Selv om den 5-årige dødeligheten for hjertesviktpasienter har redusert fra ~ 70% på 1980-tallet6 til 40-50%7 i dag, er det fortsatt et stort behov for nye terapeutiske behandlingsalternativer for denne svært utbredte tilstanden (for tiden 2,2% av befolkningen i den vestlige verden)8.
For å undersøke de molekylære mekanismene til patologisk hjertehypertrofi og for å teste forebyggende eller terapeutiske strategier for behandling av denne sykdommen, har in vivo modeller av etterlast er utviklet9,10,11,12. Mens disse modellene har tilbudt gunstig innsikt i effekten av etterlast på ventrikulær ytelse, tillater de ikke fin kontroll over etterlaststørrelse. Alternativt, in vitro studier av etterlast utført på utskårne hjerter og muskelpreparater tillate finere kontroll over vev lasting, men disse modellene er ikke bidrar til langsgående studier13,14,15.
For å overvinne disse problemene utviklet vi en in vitro-modell av forhøyet etterlast i konstruert hjertevev (EHTs)16,17. Denne modellen er et 3-dimensjonalt kulturformat for rottehjerteceller innebygd i en fibrinmatrise suspendert mellom fleksible hule silikonstolper. Disse vevene slår spontant (mot motstanden til silikonstolpene) og utfører hjelpeotonisk arbeid. Vi har økt etterlasten påført EHTs med en faktor på 12 i tidligere eksperimenter ved innsetting av stive metallbukseseler i de hule silikonstolpene i en uke. Dette førte til en rekke endringer, karakteristisk for patologisk hjertehypertrofi18,19,20: kardiomycytt hypertrofi, delvis necroptose, en nedgang i kontraktile kraft, svekkelse av vev avslapning, reaktivering av fosterets genprogram, et metabolsk skifte fra fettsyreoksidasjon til anaerob glykolyse, og en økning i fibrose. Selv om denne prosedyren har vært vellykket ansatt i flere studier17,21,22, har det noen ulemper. Det er bare to tilstander, lav eller svært høy (12 ganger) etterlast, og prosedyren krever manuell håndtering av EHTs, som begrenser sin timelige fleksibilitet og utgjør risikoen for forurensning.
Nylig brukte Leonard et al. en lignende teknikk for å modulere etterlast i EHTs kultivert på silikoninnlegg23. Bukseseler av varierende lengder ble plassert rundt utsiden av innleggene for å begrense deres bøyebevegelse. Forfatterne av denne studien rapporterte at en enestående liten til middels økning i belastning forbedret kraftutvikling og modning av menneskelige iPS-avledede EHTs, mens høyere belastninger resulterte i en patologisk tilstand. Men i likhet med vårt eget system, tillater denne teknikken bare entall økninger i etterlast, hvis størrelse er diktert av lengden på bukseseler. Som sådan er fine endringer i etterlast, modifikasjoner i etterlast over tid, og presise lastingsregimer ikke mulig med disse teknikkene.
Her gir vi protokollen for et system som kan brukes til å modulere post-motstand, det vil si etterlast av EHTs magnetisk24. Denne plattformen forenkler finjustering av etterlast, muliggjør brukerdefinerte etterlastende regimer, og sikrer EHT sterilitet.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cylindrical plate magnets</td>
			<td>HKCM</td>
			<td>9962-55184</td>
			<td>h = 14 mm, d = 13 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cylindrical post magnets</td>
			<td>HKCM</td>
			<td>9962-63571</td>
			<td>h = 2 mm, d = 0.5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental wire</td>
			<td>Ormco</td>
			<td>266-1316</td>
			<td>d = 0.016 inches (0.406 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad</td>
			<td>GraphPad Software, La Jolla, California, USA</td>
			<td>version 6.00 for Windows</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motion control software for piezo motor</td>
			<td>Micronix USA</td>
			<td></td>
			<td>free download on manufacturer homepage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motion controller for piezo motor</td>
			<td>Micronix USA</td>
			<td>MMC-100-01000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical contractility analysis platform</td>
			<td>EHT technologies</td>
			<td>A0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piezoelectric linear motor</td>
			<td>Micronix USA</td>
			<td>PPS-20-15206</td>
			<td>fitted with linear optical encoder, incubator-environment compatible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Styrene Rod</td>
			<td>Plastruct</td>
			<td>MR-15</td>
			<td>d= 0.015 inches (0.381 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB camera</td>
			<td>Reichelt Elektronik</td>
			<td>REFLECTA 66142</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

magnetic adjustment of afterload in engineered heart tissues

Afterload er kjent for å drive utviklingen av både fysiologiske og patologiske hjertetilstander. Som sådan kan det å studere resultatene av endrede etterlastende tilstander gi viktig innsikt i mekanismene som kontrollerer disse kritiske prosessene. Imidlertid mangler en eksperimentell teknikk for nøyaktig finjustering av etterlast i hjertevev over tid. Her beskrives en nyutviklet magnetisk basert teknikk for å oppnå denne kontrollen i konstruert hjertevev (EHTs). For å produsere magnetisk responsive EHTs (MR-EHTs), er vevet montert på hule silikonstolper, hvorav noen inneholder små permanente magneter. Et annet sett med permanente magneter er trykk-fit inn i en akryl plate slik at de er orientert med samme polaritet og er aksialt justert med stolpemagneter. For å justere etterlast, er denne platen av magneter oversatt mot (høyere etterlast) eller bort (lavere etterlast) fra stolpemagnetene ved hjelp av en piezoelektrisk scene utstyrt med en koder. Bevegelseskontrollprogramvaren som brukes til å justere stadium posisjonering gjør det mulig for utvikling av brukerdefinerte etterlastregimer mens koderen sikrer at scenen korrigerer for eventuelle uoverensstemmelser på stedet. Dette arbeidet beskriver fabrikasjon, kalibrering og implementering av dette systemet for å muliggjøre utvikling av lignende plattformer i andre laboratorier rundt om i verden. Representative resultater fra to separate eksperimenter er inkludert for å eksemplifisere utvalget av ulike studier som kan utføres ved hjelp av dette systemet.

Magnet innlegg stivhet kvantifisering En horisontalt orientert magnetisk responsiv silikonpost ble montert i en fast posisjon, og en aksialt justert kalibreringsmagnet ble plassert på flere definerte avstander ("magnetavstand") fra dette innlegget. Testlaster av kjent vekt ble suspendert fra enden av silikonstolpen, noe som førte til at stolpen bøyde seg. Denne nedbøyningen ble kvantifisert optisk. En lineær sammenheng mellom gravitasjonskraften til testbelastningen og den resulterende postnedbø...

Watch this Scientific Journal Video about Magnetic Adjustment of Afterload in Engineered Heart Tissues at JoVE.com

Magnetic Adjustment of Afterload in Engineered Heart Tissues

Denne protokollen gir detaljerte metoder som beskriver fabrikasjon og implementering av en magnetisk basert etterlasttuningsplattform for konstruert hjertevev.

Magnetisk justering av etterlast i konstruert hjertevev

Afterload is known to drive the development of both physiological and pathological cardiac states. As such, studying the outcomes of altered afterload ...

Dette systemet kan brukes til å utsette konstruert hjertevev for varierende regimer av etterbelastning, for å studere effekten av disse stimuli på vev kraft utvikling, ombygging og modning. Vår teknikk gjør det mulig for en å nøyaktig utsette å slå vev til et bredt spekter av passelige etterbelastningsrutiner over lengre perioder med kultur uten engang å måtte åpne cellekulturplaten. Vår metode kan endres for å kontrollere etterbelastning i andre muskelvev kultursystem, som skjelettmuskulatur, glatt muskel eller utskåret papillær muskel.Siden vår systemtilnærming er ganske unik og har tekniske aspekter som mange forskere ikke er kjent med, kan visuell demonstrasjon hjelpe til med å gjenskape oppsettet vårt. For å produsere de magnetisk responsive silikonstativene, kan du skaffe seg 24 brønnplaten padlestativer med silikonstolper som er beskrevet i tekstprotokollen. Bruk en fast polaritet til å smøre magnetene med vann og sette dem inn i de ytterste stolpene på silikonstativene.Bruk et blandet stykke tanntråd i rustfritt stål til å forsiktig skyve dem til bunnen av det hule posthulen. Opptil fem magneter kan stables i hvert innlegg. Bruk rund nesetang til å bøye tanntråd i rustfritt stål i bukseseler 11,25 millimeter bred og 15 millimeter lang.For å sikre at de riktige dimensjonene oppnås, kan man bruke en selvlaget jigg for å hjelpe til med ledningsbøyingen, og deretter bruke trådkuttere til å kutte bukseseler og filen for å glatte skjæreflaten. Smør bukseseler eller stolper med vann og sett dem inn i silikonstativet feste den andre og tredje til den ytterste stolpe i prosessen. Begynn å forberede etterbelastningen tuning enheten som beskrevet i tekstprotokollen, fest til magnetholderen til piezoelektrisk stadium ved hjelp av et ikke magnetisk materiale, dette kan oppnås ved hjelp av en L formet stykke aluminium.For å aktivere visuell analyse av vevet, installer en lyskilde i etterbelastningsjusteringsenheten. Her ble en rekke lysdioder ansatt for å belyse ingeniøren til hjertevev nedenfra. For å kalibrere etterbelastningsjusteringssystemet monterer du et av silikonstativene og vertikalt bruker ikke-magnetiske materialer, slik at de magnetisk responsive silikonstolpene er orientert horisontalt.Monter nå en av platemagnetene på et horisontalt reise lineært stadium slik at det er aksialt justert med det magnetisk responsive innlegget. Plasser kalibreringsmagneten en definert avstand fra magnetisk responsiv silikonpost ved hjelp av det horisontale stadiet. Plasser et kamera på siden av dette oppsettet for å kunne registrere innleggene optisk under påvirkning av testbelastningene.Pass på at det er nok plass under innlegget for de vedlagte lastene til å henge fritt. Ta et bilde av innlegget i fravær av vekter som skal brukes som referanse for innleggene nøytral posisjon. Uten å endre kameraets perspektiv, fest en av belastningene til slutten av silikoninnlegget, og ta deretter et bilde av innlegget som bøyer seg under vektens påvirkning.Nå grafer nedbøyningen av silikoninnlegget på x-aksen mot gravitasjonskraften til hver testvekt på y-aksen. Dette bør gi en lineær sammenheng mellom kraft og nedbøyning. Plott en lineær regresjonsfunksjon som passerer gjennom 00 og henting av data.Hellingen av denne funksjonen er stivheten, k av den magnetisk responsive silikoninnlegget ved den testede magnetavstanden. Gjenta disse trinnene på flere avstand mellom dmax og en dmin. Her ble nedbøyninger ved åtte forskjellige magnetposisjoner, fra ca. 31 millimeter til omtrent fem millimeter analysert.Mye regresjonsfunksjon gjennom disse verdiene. Bruk for eksempel ikke-lineær passform, en faseforfallfunksjon i analyseprogramvaren. Denne regresjonsfunksjonen beskriver forholdet mellom magnetavstand og etterbelastning.For å klargjøre etterbelastningsjusteringsenheten for eksperimenter, koble piezoelektrisk stadiummotor til bevegelseskontrolleren og koble bevegelseskontrolleren til datamaskinen. Kontroller at bevegelseskontrolleren også er koblet til en strømkilde. Start deretter motion controller plattform programvare, koble programvaren til piezo scenen motor ved å velge porten utpekt som scenen styret under installasjon av bevegelseskontroll programvare og klikk deretter på den åpne portknappen.Gå til systempanelet, velg åpen sløyfe, i rullegardinmenyen for løkke. Flytt magnetplaten manuelt til sin høyeste posisjon, den nærmeste mulige magnetavstanden dmin. Magnetplaten skal komme i kontakt med kulturplatefestet.Gå nå til Motion Panel, som nullknappen for å tilbakestille den nåværende posisjonen til piezo-scenen til null millimeter. Flytt magnetbladet manuelt til lavest mulig posisjon, skriv ned koderposisjonen for å bestemme bevegelsesområdet for piezoelektrisk scenemotor. Sett reisegrensene i systempanelet til verdier innenfor bevegelsesområdet som er bestemt i forrige trinn.Dette hindrer magnetbladet i å støte inn i kulturbladet eller bunnen av etterbelastningsjusteringsenheten. Igjen flytter du magnetbladet til sin høyeste posisjon og klikker på nullknappen. Gå til systempanelet og endre tilbakemeldingssløyfemodusen til lukket sløyfe, og gjør dette sikrer at scenen vil korrigere for eventuelle feil i posisjoneringen.Klikk lagre -knappen i boksen Lagre parametere for å lagre disse innstillingene i systemet. Plasser nå 24 brønnkulturplaten som inneholder konstruert hjertevev på magnetisk responsive silikonstativer på kulturplatefestet. For å beregne magnetavstanden som er nødvendig for å oppnå en ønsket etterbelastning, løs den ikke-lineære regresjonsfunksjonen som ble bestemt tidligere for d.Trekk dmin fra den beregnede magnetavstanden, d. Resultatet er avstanden magnetplaten må reise fra nullposisjonen for å oppnå ønsket etterbelastning. Skriv inn denne verdien i feltet Målposisjon én inndata i Bevegelse-panelet, og klikk Gå for å justere det konstruerte hjertevevets etterbelastning til den beregnede verdien.Kontroll en MREHTs produsert fra rotte hjerter ble dyrket i fravær av magnetisk etterbelastning før et platå i kontraktil kraft ble nådd. På denne dagen hadde MREHTs og kontrollerte EHTs lignende gjennomsnittlige krefter. I løpet av den neste uken ble etterbelastningen som utøves på MREHTs gradvis økt fra punkt ni ett til seks punkt åtte fem millinewton per millimeter, mens etterbelastning for å kontrollere EHTs forble konstant.Gjennomsnittlig kontraktil kraft økte med økende etterbelastning opp til punkt ni fem millinewton, noe som markerer mer enn en tre ganger økning i kraft sammenlignet med den gjennomsnittlige verdien målt for kontrollerte EHTs. Post nedbøyning på den annen side redusert sammenlignet med kontroll vev. På den siste kulturdagen var hovednedbøyningen målt for MREHTs bare punkt en millimeter, sammenlignet med punkt fire åtte millimeter for kontroll av EHTs.Rad EHTs på magnetisk responsive silikoninnlegg ble dyrket ved en minimal etterbelastning på punkt ni en millinewton per millimeter til et platå og kontraktil kraft ble nådd. Fra og med i dag gjennomgikk MREHTs et syv dagers etterbelastningsregime som utsetter EHTs for sykluser av etterbelastning vekslende mellom punkt ni ett og seks punkt åtte fem millinewton per millimeter. Etterbelastningen av kontroll EHT's ble holdt konstant på punkt seks null millinewton per millimeter over hele varigheten av kulturen.De observerte forskjellene var ikke statistisk signifikante. Kombinert med optisk kontraktilitetsanalyse muliggjør denne metoden sanntidsmåling av kortsiktig kontraktil respons på varierende størrelser av etterbelastning, noe som kan være nyttig for å undersøke fysiologiske muskelegenskaper. Sterke magneter kan plutselig klamre seg til hverandre, potensielt forårsake skade på brukeren og skade magnetene selv, for å unngå dette, holde magneten atskilt på trygg avstand.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

Analyse av cardiomyocyte Development hjelp Immunfluorescens i Embryonic Mouse Hjerte

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Improved Generation of Induced Cardiomyocytes Using a Polycistronic Construct Expressing Optimal Ratio of Gata4, Mef2c and Tbx5

Forbedret generasjon av Induced kardiomyocytter Ved hjelp av en polycistronisk Construct Uttrykke optimale forholdet mellom Gata4, Mef2c og Tbx5

Direct conversion of cardiac fibroblasts (CFs) into induced cardiomyocytes (iCMs) holds great potential for regenerative medicine by offering alternative ...

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

Epigenetisk regulering av Cardiac Differensiering av embryonale stamceller og vev

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

Maturation of Human Stem Cell-derived Cardiomyocytes in Biowires Using Electrical Stimulation

Modning av human-stamcelle avledet kardiomyocytter i Biowires ved hjelp av elektrisk stimulering

Human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hPSC-CMs) have been a promising cell source and have thus encouraged the investigation of their ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

Organotypic kultur metoden å studere utviklingen av embryonale kylling vev

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart

Hydrogenion-mediert siRNA Gene-stanse i voksen sebrafisk hjerte

Mammals have a very limited capacity to regenerate the heart after myocardial infarction. On the other hand, the adult zebrafish regenerates its heart ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone

Vev forberedelse og Immunostaining av mus Kraniofacial vev og Undecalcified Bone

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Microinjection-basert System for i Vivo implantering av embryonale Cardiomyocytes i Avian Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

In Vitro Generation of Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells

In vitro generasjon av mus hjerte Field-spesifikke CARDIAC stamceller

Pluripotent stem cells offer great potential for understanding heart development and disease and for regenerative medicine. While recent advances in ...

Analysis of Congenital Heart Defects in Mouse Embryos Using Qualitative and Quantitative Histological Methods

Analyse av medfødte hjertefeil i museembryoer ved hjelp av kvalitative og kvantitative histologiske metoder

Congenital heart defects (CHD) are the most common type of birth defect in humans, affecting up to 1% of all live births. However, the underlying causes ...