Name: magnetic adjustment of afterload in engineered heart tissues
Uploaded: 2020-05-05T13:30:00
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Os autores agradecem a Jutta Starbatty pelo apoio no trabalho de cultura de tecidos, Axel Kirchhof pela fotografia, Alice Casagrande Cesconetto pelo trabalho de edição, e um agradecimento especial a Bülent Aksehirlioglu pelo apoio técnico no desenvolvimento deste dispositivo. B.B. foi apoiado por um DZHK (German Centre for Cardiovascular Research) Scholar Grant, M.L.R. por um Whitaker International Postdoctoral Scholar Grant e M.N.H. por fundos do DZHK.

1. Preparação da plataforma de ajuste pós-carga
NOTA: As etapas envolvidas nesta parte do protocolo não são sensíveis ao tempo.
<ol><li>Fabricação dos racks de silicone magneticamente responsivos NOTA: Esses racks servem como plataforma de cultura para EHTs. Cada EHT é suspenso entre dois postes de silicone, que transmitem pós-carga ao tecido. O grau de pós-carga está diretamente relacionado com a rigidez desses postos. Para permitir a sintoni...

<ol>
	<li>Zipes, D. P., Libby, P., Bonow, R. O., Mann, D. L., Tomaselli, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Braunwald's Heart Disease: A Textbook of Cardiovascular Medicine. 11th edn. , (2018).</li><li>McCain, M. L., Yuan, H., Pasqualini, F. S., Campbell, P. H., Parker, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+elasticity+regulates+the+optimal+cardiac+myocyte+shape+for+contractility.">Matrix elasticity regulates the optimal cardiac myocyte shape for contractility.</a> American Journal of Physiology- Heart and Circulatory Physiology. 306 (11), 1525-1539 (2014).</li><li>de Groot, P. C., van Dijk, A., Dijk, E., Hopman, M. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+physiological+heart+growth:+fundamental+concepts+and+new+players.">Molecular basis of physiological heart growth: fundamental concepts and new players.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (1), 38-48 (2013).</li><li>Stenzig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+in+an+engineered+heart+tissue+model+of+cardiac+hypertrophy:+common+signatures+and+effects+of+DNA+methylation+inhibitors.">DNA methylation in an engineered heart tissue model of cardiac hypertrophy: common signatures and effects of DNA methylation inhibitors.</a> Basic Research in Cardiology. 111 (1), 9 (2016).</li><li>Werner, T. R., Kunze, A. C., Stenzig, J., Eschenhagen, T., Hirt, M. 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N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetics-Based+Approach+for+Fine-Tuning+Afterload+in+Engineered+Heart+Tissues.">Magnetics-Based Approach for Fine-Tuning Afterload in Engineered Heart Tissues.</a> ACS Biomaterials Science &amp; Engineering. 5 (7), 3663-3675 (2019).</li><li>Mannhardt, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Contraction+Analysis+of+Human+Engineered+Heart+Tissue+for+Cardiac+Drug+Safety+Screening.">Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (122), e55461 (2017).</li></ol>

O protocolo aqui descrito descreve uma nova técnica para alterar magneticamente pós-carga em tecidos cardíacos projetados. Esta técnica se baseia no uso de um estágio piezoelétrico para traduzir uma placa de ímãs fortes para e longe de racks magneticamente responsivos de postes de silicone. Quanto mais próximos os dois conjuntos de ímãs, mais forte a pós-carga experimentada pelos EHTs cultivados sobre eles.
Existem várias etapas que são fundamentais para o sucesso da produção e...

Pós-carga é a carga sistólica no ventrículo depois de ter começado a ejetar sangue1. Durante o desenvolvimento cardíaco, uma pós-carga adequada é de importância crítica para a maturação de cardiomiócitos2. Na idade adulta, baixos níveis de pós-carga ventricular (por exemplo, em pacientes acamados com lesão medular de alto nível3 ou em casos muito especiais como o vôo espacial4) podem resultar em hipotrofia do coração. Por outro lado, a alta carga posterior pode levar à hipertrofia cardíaca5. Embora a hipertrofia cardíaca em atletas de resistência ou gestantes seja considerada benéfica e fisiológica, a hipertrofia associada à hipertensão arterial de longo prazo ou à estenose da válvula aórtica grave é prejudicial, pois predispõe uma a arritmias cardíacas e insuficiência cardíaca6. Embora a taxa de mortalidade de 5 anos para pacientes com insuficiência cardíaca tenha reduzido de ~70% na década de 19806 para 40-50%7 atualmente, ainda há uma grande necessidade de novas opções de tratamento terapêutico para esta condição altamente prevalente (atualmente 2,2% da população no mundo ocidental)8.
Para investigar os mecanismos moleculares da hipertrofia cardíaca patológica e testar estratégias preventivas ou terapêuticas para o tratamento dessa doença, foram desenvolvidos modelos in vivo de pós-carga9,,10,,11,12. Embora esses modelos tenham oferecido insights benéficos sobre os efeitos da pós-carga no desempenho ventricular, eles não permitem um controle fino sobre a magnitude pós-carga. Alternativamente, estudos in vitro de pós-carga realizados em corações excisados e preparações musculares permitem um controle mais fino sobre o carregamento de tecidos, mas estes modelos não são propícios a estudos longitudinares13,14,15.
Para superar essas questões, desenvolvemos um modelo in vitro de pós-carga elevada em tecidos cardíacos projetados (EHTs)16,17. Este modelo é um formato de cultura tridimensional para células cardíacas de ratos embutidas em uma matriz de fibrina suspensa entre postes flexíveis de silicone oco. Esses tecidos batem espontaneamente (contra a resistência dos postes de silicone) e realizam trabalhos auxotônicos. Aumentamos a pós-carga aplicada aos EHTs por um fator de 12 em experimentos anteriores pela inserção de aparelhos metálicos rígidos nos postes de silicone ocos por uma semana. Isso levou a uma infinidade de alterações, características da hipertrofia cardíaca patológica18,19,20: hipertrofia cardiomiocito, necroptose parcial, declínio da força contífica, o comprometimento do relaxamento tecidual, reativação do programa genético fetal, uma mudança metabólica da oxidação do ácido graxo para a glicólise anaeróbica, e um aumento da fibrose. Embora este procedimento tenha sido empregado com sucesso em vários estudos17,21,22, tem algumas desvantagens. Existem apenas dois estados, carga posterior baixa ou muito alta (12 vezes), e o procedimento requer o manuseio manual dos EHTs, o que limita sua flexibilidade temporal e representa o risco de contaminação.
Recentemente, Leonard et al. usaram uma técnica semelhante para modular a pós-carga em EHTs cultivados em postes de silicone23. Aparelhos de comprimentos variados foram colocados ao redor do lado de fora dos postes para restringir seu movimento de dobra. Os autores deste estudo relataram que um aumento singular de pequeno a médio aumento no desenvolvimento de força aumentada da carga e maturação de EHTs derivados do iPS humano, enquanto cargas mais altas resultaram em um estado patológico. No entanto, semelhante ao nosso próprio sistema, esta técnica só permite aumentos singulares na pós-carga, a magnitude da qual é ditada pelo comprimento das chaves. Como tal, alterações finas no pós-carga, modificações no pós-carregamento ao longo do tempo e regimes de carregamento precisos não são possíveis com essas técnicas.
Aqui, fornecemos o protocolo para um sistema que pode ser usado para modular a pós-resistência, ou seja, pós-carga de EHTs magneticamente24. Esta plataforma facilita o ajuste fino do pós-carga, permite regimes de pós-carga definidos pelo usuário e garante a esterilidade EHT.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cylindrical plate magnets</td>
			<td>HKCM</td>
			<td>9962-55184</td>
			<td>h = 14 mm, d = 13 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cylindrical post magnets</td>
			<td>HKCM</td>
			<td>9962-63571</td>
			<td>h = 2 mm, d = 0.5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental wire</td>
			<td>Ormco</td>
			<td>266-1316</td>
			<td>d = 0.016 inches (0.406 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad</td>
			<td>GraphPad Software, La Jolla, California, USA</td>
			<td>version 6.00 for Windows</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motion control software for piezo motor</td>
			<td>Micronix USA</td>
			<td></td>
			<td>free download on manufacturer homepage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motion controller for piezo motor</td>
			<td>Micronix USA</td>
			<td>MMC-100-01000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical contractility analysis platform</td>
			<td>EHT technologies</td>
			<td>A0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piezoelectric linear motor</td>
			<td>Micronix USA</td>
			<td>PPS-20-15206</td>
			<td>fitted with linear optical encoder, incubator-environment compatible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Styrene Rod</td>
			<td>Plastruct</td>
			<td>MR-15</td>
			<td>d= 0.015 inches (0.381 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB camera</td>
			<td>Reichelt Elektronik</td>
			<td>REFLECTA 66142</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

magnetic adjustment of afterload in engineered heart tissues

O pós-carga é conhecido por impulsionar o desenvolvimento de estados cardíacos fisiológicos e patológicos. Como tal, estudar os resultados de estados pós-carga alterados poderia produzir insights importantes sobre os mecanismos que controlam esses processos críticos. No entanto, uma técnica experimental para ajustar precisamente a pós-carga no tecido cardíaco ao longo do tempo está atualmente em falta. Aqui, uma técnica recém-desenvolvida baseada em magnéticos para alcançar esse controle em tecidos cardíacos projetados (EHTs) é descrita. Para produzir EHTs magneticamente responsivos (MR-EHTs), os tecidos são montados em postes de silicone oco, alguns dos quais contêm pequenos ímãs permanentes. Um segundo conjunto de ímãs permanentes é encaixe em uma placa de acrílico de tal forma que eles são orientados com a mesma polaridade e estão alinhados axialmente com os ímãs post. Para ajustar a pós-carga, esta placa de ímãs é traduzida para (pós-carga mais alta) ou para longe (pós-carga inferior) dos ímãs postais usando um estágio piezoelétrico equipado com um codificador. O software de controle de movimento usado para ajustar o posicionamento de palco permite o desenvolvimento de regimes de pós-carga definidos pelo usuário, enquanto o codificador garante que o estágio corrija qualquer inconsistência em sua localização. Este trabalho descreve a fabricação, calibração e implementação deste sistema para permitir o desenvolvimento de plataformas semelhantes em outros laboratórios ao redor do mundo. Resultados representativos de dois experimentos separados são incluídos para exemplificar a gama de diferentes estudos que podem ser realizados usando este sistema.

Quantificação de rigidez pós-ímã Um poste de silicone magneticamente responsivo orientado horizontalmente foi montado em uma posição fixa, e um ímã de calibração alinhado axialmente foi colocado a várias distâncias definidas ("espaçamentos de ímã") a partir deste poste. Cargas de teste de peso conhecido foram suspensas da extremidade do poste de silicone, fazendo com que o poste se dobrasse. Esta deflexão foi quantificada opticamente. Observou-se uma relação linear entre a força gr...

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Magnetic Adjustment of Afterload in Engineered Heart Tissues

Este protocolo fornece métodos detalhados descrevendo a fabricação e a implementação de uma plataforma de ajuste pós-carga baseada em magnéticos para tecidos cardíacos projetados.

Ajuste magnético da pós-carga em tecidos cardíacos projetados

Afterload is known to drive the development of both physiological and pathological cardiac states. As such, studying the outcomes of altered afterload ...

Este sistema pode ser usado para expor tecidos cardíacos projetados a regimes variados de pós-carga, a fim de estudar os efeitos desses estímulos no desenvolvimento da força tecidual, remodelação e maturação. Nossa técnica permite submeter precisamente tecidos batendo a uma ampla gama de rotinas personalizáveis de pós-carga ao longo de períodos prolongados de cultura sem sequer precisar abrir a placa de cultura celular. Nosso método poderia ser modificado para controlar a carga posterior em outro sistema de cultura de tecido muscular, como músculo esquelético, músculo liso ou músculo papilar excisado.Uma vez que nossa abordagem de sistemas é bastante única e apresenta aspectos técnicos que muitos cientistas não estão familiarizados, a demonstração visual pode ajudar na recriação de nossa configuração. Para fabricar os racks de silicone magneticamente responsivos, adquira a placa de 24 poços pode remar racks de postes de silicone descritos no protocolo de texto. Usando uma polaridade fixa, lubrifique os ímãs com água e insira-os um de cada vez nos postes mais externos dos racks de silicone.Use um pedaço misturado de fio dental de aço inoxidável para empurrá-los cuidadosamente para o fundo da cavidade pós oca. Até cinco ímãs podem ser empilhados em cada post. Use alicates de nariz redondo para dobrar o fio dentário de aço inoxidável em aparelhos de 11,25 milímetros de largura e 15 milímetros de comprimento.Para garantir que as dimensões corretas sejam alcançadas, pode-se usar um gabarito auto-fabricado para ajudar na dobra do fio, em seguida, usar cortadores de arame para cortar o aparelho e o arquivo para suavizar a superfície de corte. Lubrifique os aparelhos ou postes com água e insira-os no rack de silicone fixando o segundo e o terceiro ao poste mais externo no processo. Comece a preparar o dispositivo de afinação conforme descrito no protocolo de texto, conecte-se ao suporte do ímã ao estágio piezoelétrico usando um material não magnético, isso pode ser alcançado usando uma peça de alumínio em forma de L.Para habilitar a análise visual dos tecidos, instale uma fonte de luz dentro do dispositivo de ajuste de carga posterior. Aqui uma matriz de LEDs foi empregada para iluminar o engenheiro para tecidos cardíacos de baixo. Para calibrar o sistema de ajuste de pós-carga, monte um dos racks de silicone e use verticalmente materiais não magnéticos, de modo que os postes de silicone magneticamente responsivos sejam orientados horizontalmente.Agora monte um dos ímãs da placa em um estágio linear horizontalmente itinerante de tal forma que esteja axialmente alinhado com o poste magneticamente responsivo. Posicione o ímã de calibração a uma distância definida do poste de silicone magneticamente responsivo usando o estágio horizontal. Coloque uma câmera na lateral desta configuração para poder registrar opticamente a deflexão dos postes sob a influência das cargas de teste.Certifique-se de que há espaço suficiente abaixo do poste para que as cargas anexadas fiquem penduradas livremente. Tire uma foto do post na ausência de quaisquer pesos para usar como referência para a posição neutra dos posts. Sem mudar a perspectiva da câmera, anexe uma das cargas até a extremidade do poste de silicone, em seguida, tire uma foto do poste dobrando sob a influência do peso.Agora gráfico a deflexão do poste de silicone no eixo x contra a força gravitacional de cada peso de teste no eixo y. Isso deve produzir uma relação linear entre força e deflexão. Traçar uma função de regressão linear passando por 00 e os dados de aquisição.A inclinação desta função é a rigidez, k do poste de silicone magneticamente responsivo no espaçamento de ímã testado. Repita estes passos em vários espaçamentos entre dmax e um dmin. Aqui foram analisadas deflexões em oito diferentes posições de ímã, variando de cerca de 31 milímetros a cerca de cinco milímetros.Muita regressão funciona através desses valores. Por exemplo, use fit não linear, função de decadência de uma fase no software de análise. Esta função de regressão descreve a relação entre espaçamento de ímã e pós-carga.Para preparar o dispositivo de ajuste de pós-carga para experimentos, conecte o motor de estágio piezoelétrico ao controlador de movimento e conecte o controlador de movimento ao computador. Certifique-se de que o controlador de movimento também esteja conectado a uma fonte de energia. Em seguida, inicie o software da plataforma do controlador de movimento, conecte o software ao motor de estágio piezo selecionando a porta designada como placa de palco durante a instalação do software de controle de movimento e, em seguida, clique no botão de porta aberta.Vá para o painel do sistema, selecione loop aberto, no menu de desemarçado. Mova manualmente a placa de ímã para sua posição mais alta, o espaçamento de ímã mais próximo possível. A placa de ímã deve fazer contato com o suporte da placa de cultura.Agora vá para o Painel de Movimento, como o botão zero para redefinir a posição atual do estágio piezo para zero milímetros. Mova manualmente a lâmina do ímã para a posição mais baixa possível, anote a posição do codificador para determinar o alcance de movimento do motor do estágio piezoelétrico. Defina os limites de viagem no painel do sistema para valores dentro do intervalo de movimento determinado na etapa anterior.Isso impede que a lâmina do ímã esbarre na lâmina de cultura ou na parte inferior do dispositivo de ajuste de carga posterior. Mais uma vez, mova a lâmina do ímã para sua posição mais alta e clique no botão zero. Vá para o painel do sistema e altere o modo de loop de feedback para loop fechado, fazendo isso garante que o estágio corrigirá quaisquer erros em seu posicionamento.Clique no botão salvar na caixa de parâmetros da loja para armazenar essas configurações no sistema. Agora coloque a placa de cultura 24 bem contendo tecidos cardíacos projetados em racks de silicone magneticamente responsivos no suporte da placa de cultura. Para calcular o espaçamento do ímã necessário para alcançar uma carga posterior desejada, resolva a função de regressão não linear determinada anteriormente para d.Subtrair dmin do espaçamento calculado do ímã, d. O resultado é a distância que a placa de ímã tem de viajar de sua posição zero para alcançar a carga posterior desejada. Digite esse valor no campo de entrada Target Position one no painel Movimento e clique em Ir para ajustar a carga posterior do tecido cardíaco projetado ao valor calculado.Controle de um MREHTs produzidos a partir de corações de ratos foram cultivados na ausência de carga magnética até que um platô em força contratil foi alcançado. Neste dia, os MREHTs e os EHTs controlados tinham forças médias semelhantes. Durante a semana seguinte, a carga exercida sobre mrehts foi incrementalmente aumentada do ponto nove um para seis ponto oito cinco milinewton's por milímetro, enquanto a carga posterior para controlar EHTs permaneceu constante.A força contratual média aumentou com o aumento da carga pós-venda até o ponto nove cinco mililitros, o que marca mais de um aumento de três vezes em força em comparação com o valor médio medido para EHTs controlados. A deflexão pós-deflexão, por outro lado, diminuiu em comparação com os tecidos de controle. No último dia de cultura, a principal deflexão medida para os MREHTs foi apenas um milímetro, em comparação com o ponto quatro oito milímetros para controle de EHT's.EHTs rad em postes de silicone magneticamente responsivos foram cultivados a uma carga mínima de 9 pontos um mililitro por milímetro até que um platô e força contralética foram alcançados. A partir de hoje, os MREHTs foram submetidos a um regime de sete dias após a carga que expõe os EHTs a ciclos de pós-carga alternando entre o ponto nove um e seis ponto oito cinco milímetros por milímetro. A carga posterior de EHT's foi mantida constante no ponto seis zero milímetro por milímetro durante toda a duração da cultura.As diferenças observadas não foram estatisticamente significantes. Combinado com a análise de contratilidade óptica, este método permite a medição em tempo real da resposta contratil de curto prazo a magnitudes flutuantes de pós-carga, o que poderia ser útil para investigar propriedades musculares fisiológicas. Ímãs fortes podem de repente se apegar uns aos outros, potencialmente causando ferimentos ao usuário e danificando os próprios ímãs, para evitar isso, manter o ímã separado a uma distância segura.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

Análise do Cardiomyocyte Desenvolvimento utilizando imunofluorescência em Embryonic Coração do rato

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Biologia do Desenvolvimento

Improved Generation of Induced Cardiomyocytes Using a Polycistronic Construct Expressing Optimal Ratio of Gata4, Mef2c and Tbx5

Melhoria Geração de Induced Cardiomyocytes utilizando uma construção policistrónico Expressando proporção ideal de GATA4, MEF2C e Tbx5

Direct conversion of cardiac fibroblasts (CFs) into induced cardiomyocytes (iCMs) holds great potential for regenerative medicine by offering alternative ...

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

Regulação epigenética da Cardiac diferenciação de células estaminais embrionárias e Tecidos

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

Maturation of Human Stem Cell-derived Cardiomyocytes in Biowires Using Electrical Stimulation

Maturação de cardiomiócitos estaminais humanas derivadas de células em Biowires Usando Electrical Stimulation

Human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hPSC-CMs) have been a promising cell source and have thus encouraged the investigation of their ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

Cultura de organotypic método para estudar o desenvolvimento de tecidos embrionários de galinha

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart

SiRNA Nanoparticle-mediada-silenciamento no coração de Zebrafish adulto

Mammals have a very limited capacity to regenerate the heart after myocardial infarction. On the other hand, the adult zebrafish regenerates its heart ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone

Preparo tecidual e imunocoloração de tecidos craniofaciais do camundongo e osso não-descalcificado

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Sistema baseado em microinjeção para na implantação de Vivo do Cardiomyocytes embrionárias no embrião aviária

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

In Vitro Generation of Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells

In vitro geração de células progenitoras cardíacas específicas do coração do rato

Pluripotent stem cells offer great potential for understanding heart development and disease and for regenerative medicine. While recent advances in ...

Analysis of Congenital Heart Defects in Mouse Embryos Using Qualitative and Quantitative Histological Methods

Análise de defeitos cardíacos congênitos em embriões de camundongos usando métodos histológicos qualitativos e quantitativos

Congenital heart defects (CHD) are the most common type of birth defect in humans, affecting up to 1% of all live births. However, the underlying causes ...