Name: magnetic adjustment of afterload in engineered heart tissues
Uploaded: 2020-05-05T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Magnetic Adjustment of Afterload in Engineered Heart Tissues at JoVE.com

Författarna tackar Jutta Starbatty för hennes stöd i vävnadsodlingsarbete, Axel Kirchhof för fotografering, Alice Casagrande Cesconetto för redigeringsarbete, och ett särskilt tack till Bülent Aksehirlioglu för tekniskt stöd i utvecklingen av denna enhet. B.B. stöddes av en DZHK (German Centre for Cardiovascular Research) Scholar Grant, M.L.R. av en Whitaker International Postdoc Scholar Grant och M.N.H. med medel från DZHK.

1. Förberedelse av efterlastjusteringsplattformen
OBS: Stegen som ingår i den här delen av protokollet är inte tidskänsliga.
<ol><li>Tillverkning av magnetiskt responsiva silikonställ OBS: Dessa rack fungerar som kulturplattform för EHTs. Varje EHT är upphängd mellan två silikonstolpar, som ger efterbelastning till vävnaden. Graden av efterlast är direkt relaterad till styvheten i dessa tjänster. För att aktivera magnetisk efterbelastning tu...

<ol>
	<li>Zipes, D. P., Libby, P., Bonow, R. O., Mann, D. L., Tomaselli, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Braunwald's Heart Disease: A Textbook of Cardiovascular Medicine. 11th edn. , (2018).</li><li>McCain, M. L., Yuan, H., Pasqualini, F. S., Campbell, P. H., Parker, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+elasticity+regulates+the+optimal+cardiac+myocyte+shape+for+contractility.">Matrix elasticity regulates the optimal cardiac myocyte shape for contractility.</a> American Journal of Physiology- Heart and Circulatory Physiology. 306 (11), 1525-1539 (2014).</li><li>de Groot, P. C., van Dijk, A., Dijk, E., Hopman, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preserved+cardiac+function+after+chronic+spinal+cord+injury.">Preserved cardiac function after chronic spinal cord injury.</a> Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 87 (9), 1195-1200 (2006).</li><li>Perhonen, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+atrophy+after+bed+rest+and+spaceflight.">Cardiac atrophy after bed rest and spaceflight.</a> Journal of Applied Physiology. 91 (2), 645-653 (2001).</li><li>Levy, D., Larson, M. G., Vasan, R. S., Kannel, W. B., Ho, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+progression+from+hypertension+to+congestive+heart+failure.">The progression from hypertension to congestive heart failure.</a> Journal of the American Medical Association. 275 (20), 1557-1562 (1996).</li><li>Levy, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+trends+in+the+incidence+of+and+survival+with+heart+failure.">Long-term trends in the incidence of and survival with heart failure.</a> The New England Journal of Medicine. 347 (18), 1397-1402 (2002).</li><li>Maggioni, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EURObservational+Research+Programme:+regional+differences+and+1-year+follow-up+results+of+the+Heart+Failure+Pilot+Survey+(ESC-HF+Pilot).">EURObservational Research Programme: regional differences and 1-year follow-up results of the Heart Failure Pilot Survey (ESC-HF Pilot).</a> European Journal of Heart Failure. 15 (7), 808-817 (2013).</li><li>Mozaffarian, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+disease+and+stroke+statistics--2015+update:+a+report+from+the+American+Heart+Association.">Heart disease and stroke statistics--2015 update: a report from the American Heart Association.</a> Circulation. 131 (4), 29 (2015).</li><li>Klautz, R. J., Teitel, D. F., Steendijk, P., van Bel, F., Baan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+afterload+and+contractility+in+the+newborn+heart:+evidence+of+homeometric+autoregulation+in+the+intact+circulation.">Interaction between afterload and contractility in the newborn heart: evidence of homeometric autoregulation in the intact circulation.</a> Journal of the American College of Cardiology. 25 (6), 1428-1435 (1995).</li><li>Liedtke, A. J., Pasternac, A., Sonnenblick, E. H., Gorlin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+canine+ventricular+dimensions+with+acute+changes+in+preload+and+afterload.">Changes in canine ventricular dimensions with acute changes in preload and afterload.</a> The American Journal of Physiology. 223 (4), 820-827 (1972).</li><li>Toischer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+cardiac+remodeling+in+preload+versus+afterload.">Differential cardiac remodeling in preload versus afterload.</a> Circulation. 122 (10), 993-1003 (2010).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Hypertrophy+and+Increased+Susceptibility+to+Spontaneous+Calcium-Release+of+Rat+Left+Atrial+Myocytes+Due+to+Elevated+Afterload.">Cellular Hypertrophy and Increased Susceptibility to Spontaneous Calcium-Release of Rat Left Atrial Myocytes Due to Elevated Afterload.</a> PloS one. 10 (12), 0144309 (2015).</li><li>Hori, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loading+sequence+is+a+major+determinant+of+afterload-dependent+relaxation+in+intact+canine+heart.">Loading sequence is a major determinant of afterload-dependent relaxation in intact canine heart.</a> The American Journal of Physiology. 249, 747-754 (1985).</li><li>Schotola, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contractile+adaption+to+preload+depends+on+the+amount+of+afterload.">The contractile adaption to preload depends on the amount of afterload.</a> ESC Heart Failure. 4 (4), 468-478 (2017).</li><li>Sonnenblick, E. H., Downing, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Afterload+as+a+primary+determinat+of+ventricular+performance.">Afterload as a primary determinat of ventricular performance.</a> The American Journal of Physiology. 204, 604-610 (1963).</li><li>Hirt, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+afterload+induces+pathological+cardiac+hypertrophy:+a+new+in+vitro+model.">Increased afterload induces pathological cardiac hypertrophy: a new in vitro model.</a> Basic Research in Cardiology. 107 (6), 307 (2012).</li><li>Hirt, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+microRNA+signature+of+pathological+cardiac+hypertrophy+by+engineered+heart+tissue-+and+sequencing-technology.">Deciphering the microRNA signature of pathological cardiac hypertrophy by engineered heart tissue- and sequencing-technology.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 81, 1-9 (2015).</li><li>Dorn, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fuzzy+logic+of+physiological+cardiac+hypertrophy.">The fuzzy logic of physiological cardiac hypertrophy.</a> Hypertension. 49 (5), 962-970 (2007).</li><li>Hill, J. A., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+plasticity.">Cardiac plasticity.</a> The New England Journal of Medicine. 358 (13), 1370-1380 (2008).</li><li>Maillet, M., van Berlo, J. H., Molkentin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+physiological+heart+growth:+fundamental+concepts+and+new+players.">Molecular basis of physiological heart growth: fundamental concepts and new players.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (1), 38-48 (2013).</li><li>Stenzig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+in+an+engineered+heart+tissue+model+of+cardiac+hypertrophy:+common+signatures+and+effects+of+DNA+methylation+inhibitors.">DNA methylation in an engineered heart tissue model of cardiac hypertrophy: common signatures and effects of DNA methylation inhibitors.</a> Basic Research in Cardiology. 111 (1), 9 (2016).</li><li>Werner, T. R., Kunze, A. C., Stenzig, J., Eschenhagen, T., Hirt, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blockade+of+miR-140-3p+prevents+functional+deterioration+in+afterload-enhanced+engineered+heart+tissue.">Blockade of miR-140-3p prevents functional deterioration in afterload-enhanced engineered heart tissue.</a> Scientific Reports. 9 (1), 11494 (2019).</li><li>Leonard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Afterload+promotes+maturation+of+human+induced+pluripotent+stem+cell+derived+cardiomyocytes+in+engineered+heart+tissues.">Afterload promotes maturation of human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes in engineered heart tissues.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 118, 147-158 (2018).</li><li>Rodriguez, M. L., Werner, T. R., Becker, B., Eschenhagen, T., Hirt, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetics-Based+Approach+for+Fine-Tuning+Afterload+in+Engineered+Heart+Tissues.">Magnetics-Based Approach for Fine-Tuning Afterload in Engineered Heart Tissues.</a> ACS Biomaterials Science &amp; Engineering. 5 (7), 3663-3675 (2019).</li><li>Mannhardt, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Contraction+Analysis+of+Human+Engineered+Heart+Tissue+for+Cardiac+Drug+Safety+Screening.">Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (122), e55461 (2017).</li></ol>

Protokollet beskrivs häri beskriver en ny teknik för magnetiskt förändra efterlast i konstruerade hjärtvävnader. Denna teknik bygger på användningen av en piezoelektrisk scen för att översätta en platta av starka magneter mot och bort från magnetiskt lyhörda rack av silikonstolpar. Ju närmare de två uppsättningarna magneter, desto starkare efterlast upplevs av EHTs odlade på dem.
Det finns flera steg som är avgörande för en framgångsrik produktion och användning av detta ...

Afterload är den systoliska belastningen på ventrikeln efter att den har börjat mata ut blod1. Under hjärtutveckling är en lämplig efterbelastning av avgörande betydelse för kardiomyocytmognad2. I vuxen ålder kan låga nivåer av ventrikulär efterlast (t.ex. hos sängliggande patienter med ryggmärgsskada på hög nivå3 eller i mycket speciella fall somrymdfärder 4) resultera i hypotrofi i hjärtat. Omvänt kan hög efterladdning leda till hjärthypertrofi5. Medan hjärthypertrofi hos uthållighetsidrottare eller gravida kvinnor anses vara nyttig och fysiologisk, hypertrofi i samband med långvarig arteriell hypertoni eller svår aortaklaffstenos är skadligt eftersom det predisposes en till hjärtarytmier och hjärtsvikt6. Även om den 5-åriga dödligheten för hjärtsvikt patienter har minskat från ~ 70% på 1980-talet6 till 40-50%7 för närvarande, det finns fortfarande ett stort behov av nya terapeutiska behandlingsalternativ för detta mycket utbredda tillstånd (för närvarande 2,2% av befolkningen i västvärlden)8.
För att undersöka de molekylära mekanismerna för patologisk hjärthypertrofi och för att testa förebyggande eller terapeutiska strategier för behandling av denna sjukdom, in vivo modeller av efterlast har utvecklats9,10,11,12. Medan dessa modeller har erbjudit positiva insikter i effekterna av efterbelastning på Ventrikulärt prestanda, de tillåter inte fin kontroll över efterlast magnitud. Alternativt, in vitro-studier av efterlast utförs på strukna hjärtan och muskel preparat möjliggör finare kontroll över vävnadsbelastning, men dessa modeller är inte bidrar till longitudinella studier13,,14,15.
För att lösa dessa problem utvecklade vi en in vitro-modell av förhöjd efterlast i konstruerade hjärtvävnader (EHTs)16,17. Denna modell är en 3-dimensionell kultur format för råtta hjärtceller inbäddade i en fibrin matris upphängd mellan flexibla ihåliga silikon inlägg. Dessa vävnader slå spontant (mot motståndet av silikon inlägg) och utföra auxotonic arbete. Vi har ökat efterlast tillämpas på EHTs med en faktor 12 i tidigare experiment genom införandet av styva metall hängslen i ihåliga silikon inlägg för en vecka. Detta ledde till en mängd förändringar, kännetecknande för patologiska hjärt hypertrofi18,19,20: kardiomyocyt hypertrofi, partiell nekrotes, en nedgång i kontraktil kraft, försämring av vävnad avslappning, reaktivering av fetala genprogrammet, en metabolisk övergång från fettsyra oxidation till anaeroba glykolys och en ökning av fibros. Även om detta förfarande har framgångsrikt använts i flera studier17,21,22, det har vissa nackdelar. Det finns bara två stater, låg eller mycket hög (12-faldig) efterlast, och förfarandet kräver manuell hantering av EHTs, vilket begränsar dess tidsmässiga flexibilitet och utgör risken för kontaminering.
Nyligen använde Leonard et al. en liknande teknik för att modulera efterbelastning i EHTs odlade på silikon inlägg23. Hängslen av varierande längd placerades runt utsidan av stolparna för att begränsa deras böjning rörelse. Författarna till denna studie rapporterade att en singular liten till medium ökning av belastningen förbättrad kraft utveckling och mognad av mänskliga iPS-härledda EHTs, medan högre belastningar resulterade i ett patologiskt tillstånd. Men i likhet med vårt eget system, tillåter denna teknik endast för singular ökningar i efterlast, vars storlek dikteras av längden på hängslen. Som sådan, fina förändringar i efterlast, ändringar i efterbelastning över tiden, och exakt lastning regimer är inte möjligt med dessa tekniker.
Här tillhandahåller vi protokollet för ett system som kan användas för att modulera post-motstånd, dvs efterbelastning av EHTs magnetiskt24. Denna plattform underlättar finjustering av efterlast, möjliggör användardefinierade efterladdningsregimer och säkerställer EHT-sterilitet.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cylindrical plate magnets</td>
			<td>HKCM</td>
			<td>9962-55184</td>
			<td>h = 14 mm, d = 13 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cylindrical post magnets</td>
			<td>HKCM</td>
			<td>9962-63571</td>
			<td>h = 2 mm, d = 0.5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental wire</td>
			<td>Ormco</td>
			<td>266-1316</td>
			<td>d = 0.016 inches (0.406 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad</td>
			<td>GraphPad Software, La Jolla, California, USA</td>
			<td>version 6.00 for Windows</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motion control software for piezo motor</td>
			<td>Micronix USA</td>
			<td></td>
			<td>free download on manufacturer homepage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motion controller for piezo motor</td>
			<td>Micronix USA</td>
			<td>MMC-100-01000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical contractility analysis platform</td>
			<td>EHT technologies</td>
			<td>A0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piezoelectric linear motor</td>
			<td>Micronix USA</td>
			<td>PPS-20-15206</td>
			<td>fitted with linear optical encoder, incubator-environment compatible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Styrene Rod</td>
			<td>Plastruct</td>
			<td>MR-15</td>
			<td>d= 0.015 inches (0.381 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB camera</td>
			<td>Reichelt Elektronik</td>
			<td>REFLECTA 66142</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

magnetic adjustment of afterload in engineered heart tissues

Afterload är känt för att driva utvecklingen av både fysiologiska och patologiska hjärttillstånd. Som sådan, studera resultaten av förändrade afterload stater kan ge viktiga insikter i de mekanismer som styr dessa kritiska processer. Men en experimentell teknik för exakt finjustering efterlast i hjärtvävnad över tiden saknas för närvarande. Här beskrivs en nyutvecklad magnetbaserad teknik för att uppnå denna kontroll i konstruerade hjärtvävnader (EHTs). För att producera magnetiskt responsiva EHTs (MR-EHTs) monteras vävnaderna på ihåliga silikonstolpar, varav några innehåller små permanenta magneter. En andra uppsättning permanenta magneter är press-fit i en akrylplatta så att de är orienterade med samma polaritet och är axiellt i linje med postmagneterna. För att justera efterbelastningen översätts denna magnetplatta mot (högre efterlast) eller bort (lägre efterlast) från postmagneterna med hjälp av ett piezoelektriskt stadium försett med en kodare. Den rörelsekontroll programvara som används för att justera scenen positionering möjliggör utveckling av användardefinierade efterlastregimer medan kodaren säkerställer att scenen korrigerar för eventuella inkonsekvenser i dess plats. Detta arbete beskriver tillverkning, kalibrering och implementering av detta system för att möjliggöra utveckling av liknande plattformar i andra laboratorier runt om i världen. Representativa resultat från två separata experiment ingår för att exemplifiera de olika studier som kan utföras med hjälp av detta system.

Magnet post styvhet kvantifiering En horisontellt orienterad magnetiskt lyhörd silikon post monterades i ett fast läge, och en axiellt inriktad kalibrering magnet placerades på flera definierade avstånd ("magnet avstånd") från det här inlägget. Testbelastningar med känd vikt avbröts från slutet av silikonstolpen, vilket fick stolpen att böjas. Denna avböjning kvantifierades optiskt. Ett linjärt samband mellan provbelastningens gravitationskraft och den resulterande postdeformationen obse...

Watch this Scientific Journal Video about Magnetic Adjustment of Afterload in Engineered Heart Tissues at JoVE.com

Magnetic Adjustment of Afterload in Engineered Heart Tissues

Detta protokoll ger detaljerade metoder som beskriver tillverkning och genomförande av en magnetiska-baserade efterlast tuning plattform för konstruerade hjärtvävnader.

Magnetisk justering av efterlast i konstruerade hjärtvävnader

Afterload is known to drive the development of both physiological and pathological cardiac states. As such, studying the outcomes of altered afterload ...

Detta system kan användas för att exponera konstruerade hjärtvävnader till varierande regimer av afterload, för att studera effekterna av dessa stimuli på vävnad kraft utveckling, ombyggnad och mognad. Vår teknik gör det möjligt att exakt utsätta slå vävnader till ett brett spektrum av anpassningsbara afterload rutiner under långa perioder av kultur utan att ens behöva öppna cellodlingsplattan. Vår metod skulle kunna ändras för att kontrollera efterbelastning i andra muskel vävnad kultur system, såsom skelettmuskulatur, glatt muskulatur eller strukits papillär muskel.Eftersom våra system strategi är ganska unik och funktioner tekniska aspekter som många forskare inte är bekant med, visuell demonstration kan stöd i återskapa vår setup. För att tillverka de magnetiskt responsiva silikon rack, förvärva 24 väl plattan kan paddla rack av silikon inlägg som beskrivs i textprotokollet. Med hjälp av en fast polaritet smörjer du in magneterna med vatten och för in dem en i taget i silikonställenas yttersta stolpar.Använd en blandad bit av rostfritt stål dental tråd för att försiktigt driva dem till botten av den ihåliga post hålighet. Upp till fem magneter kan staplas i varje inlägg. Använd runda näsa tång för att böja rostfritt stål dental tråd i hängslen 11,25 millimeter bred och 15 millimeter lång.För att säkerställa att de rätta dimensionerna uppnås, kan man använda en egen gjord jigg till stöd i trådböjningen, använd sedan trådskärare för att skära av hängslen och filen för att jämna ut skärytan. Smörj hängslen eller stolpar med vatten och sätt in dem i silikonstället fastställande av andra och tredje till den yttersta stolpen i processen. Börja förbereda efterlasta trimanordningen som beskrivs i textprotokollet, fäst till magnethållaren till det piezoelektriska stadiet med hjälp av ett icke magnetiskt material, detta kan uppnås med hjälp av en L-formad bit aluminium.För att möjliggöra visuell analys av vävnaderna, installera en ljuskälla inom efterlastjusteringsanordningen. Här en rad lysdioder användes för att belysa ingenjören till hjärtvävnader underifrån. För att kalibrera efterlasttrimningssystemet monterar du ett av silikonracken och vertikalt med hjälp av icke magnetiska material, så att de magnetiskt responsiva silikonstolparna orienteras horisontellt.Montera nu en av plattan magneter på ett horisontellt resande linjärt stadium så att det är axiellt i linje med magnetiskt lyhörd post. Placera kalibreringsmagneten ett definierat avstånd från magnetiskt responsiv silikonpost med hjälp av det horisontella stadiet. Placera en kamera på sidan av denna inställning för att kunna optiskt registrera stolparnas avböjning under påverkan av provbelastningarna.Se till att det finns tillräckligt med utrymme under inlägget för de bifogade lasterna att hänga fritt. Ta en bild av inlägget i avsaknad av några vikter att använda som referens för inlägg neutral position. Utan att ändra kamerans perspektiv, fäst en av lasterna till själva änden av silikon post, sedan ta en bild av inlägget böjning under påverkan av vikten.Nu grafen av avböjning av silikon post på x-axeln mot gravitationskraften för varje test vikt på y-axeln. Detta bör ge ett linjärt förhållande mellan kraft och avböjning. Rita en linjär regressionsfunktion som passerar genom 00 och de förvärva data.Lutningen på denna funktion är styvheten, k av den magnetiskt responsiva silikonposten vid det testade magnetavståndet. Upprepa dessa steg med flera mellanrum mellan dmax och en dmin. Här analyserades deformationer vid åtta olika magnetpositioner, från cirka 31 millimeter till cirka fem millimeter.En hel del regressionsfunktion genom dessa värden. Använd till exempel ickelinjär passform, en fas sönderfallsfunktion i analysprogramvaran. Denna regressionsfunktion beskriver förhållandet mellan magnetavstånd och afterload.För att förbereda efterlastjusteringsanordningen för experiment, anslut den piezoelektriska stegmotorn till rörelsekänslig handkontroll och ansluta rörelsekänskontrollen till datorn. Kontrollera att rörelsekänskontrollen också är ansluten till en strömkälla. Starta sedan programvaran för rörelsestyrsplattformen, anslut programvaran till piezostegsmotorn genom att välja den port som betecknas som scentavla under installationen av rörelsekontrollprogramvaran och klicka sedan på knappen för öppna portar.Gå till systempanelen, välj öppen slinga, i loopens rullgardinsmeny. Flytta magnetplattan manuellt till sitt högsta läge, det närmaste möjliga magnetavståndet dmin. Magnetplattan ska ta kontakt med odlingsplattans fäste.Gå nu till Rörelsepanelen, som nollknappen för att återställa den aktuella positionen för piezostadiet till nollmillimeter. Flytta magnetbladet manuellt till sitt lägsta möjliga läge, skriv ner kodarpositionen för att bestämma rörelseomfånget för den piezoelektriska stegmotorn. Ställ in resegränserna i systempanelen till värden inom det rörelseområde som bestämts i föregående steg.Detta förhindrar magnetbladet från att stöta in i odlingsbladet eller botten av efterlastningsjusteringsanordningen. Flytta magnetbladet till sitt högsta läge igen igen och klicka på nollknappen. Gå till systempanelen och ändra återkopplingsslingan till sluten slinga, gör detta garanterar att scenen kommer att korrigera för eventuella fel i sin positionering.Klicka på sparknappen i rutan för butiksparametrar för att lagra dessa inställningar i systemet. Placera nu den 24 brunnskulturplattan som innehåller konstruerade hjärtvävnader på magnetiskt responsiva silikonställ på odlingsplattans fäste. För att beräkna magnetavståndet som är nödvändigt för att uppnå en önskad afterload, lös den ickelinjära regressionsfunktionen som bestämts tidigare för d.Subtrahera dmin från det beräknade magnetavståndet, d. Resultatet är det avstånd magnetplattan har att resa från sin nollposition för att uppnå önskad afterload. Skriv det här värdet i målposition ett inmatningsfält i rörelsepanelen och klicka på Gå för att justera den konstruerade hjärtvävnadens efterbelastning till det beräknade värdet.Kontroll en MREHTs produceras från råtta hjärtan var odlade i avsaknad av magnetiska afterload tills en platå i kontraktil kraft nåddes. På denna dag, MREHTs och kontrollerade EHTs hade liknande medelvärde krafter. Under nästa vecka, efterlast utövas på MREHTs stegvis ökat från punkt nio en till sex punkt åtta fem millinewton's per millimeter, medan afterload för att kontrollera EHTs förblev konstant.Medelkontraktil kraft ökade med ökande afterload upp till punkt nio fem millinewton, vilket markerar mer än en trefaldig ökning i kraft jämfört med det genomsnittliga värdet mätt för kontrollerade EHTs. Post avböjning å andra sidan minskade jämfört med kontroll vävnader. På den sist dagen av kultur var den huvudsakliga avböjningen som mättes för MREHTs, endast peka en en millimetrar, jämfört till pekar fyra åtta millimetrar för kontrollerar EHT's.Rad EHTs på magnetiskt lyhörd silikon inlägg var odlade på en minimal afterload av punkt nio en millinewton per millimeter tills en platå och kontraktil kraft nåddes. Från denna dag och framåt, genomgick MREHTs en sju dagar afterload regim som utsätter EHTs till cykler av afterload omväxlande mellan punkt nio en och sex punkt åtta fem millinewton per millimeter. Efterbelastningen av kontroll EHT: s hölls konstant på punkt sex noll millinewton per millimeter under hela varaktigheten av kultur.De observerade skillnaderna var inte statistiskt signifikanta. I kombination med optisk kontraktilitetsanalys möjliggör denna metod realtidsmätning av kortfristigt kontraktilt svar på fluktuerande magnituder av afterload, vilket kan vara användbart för att undersöka fysiologiska muskelegenskaper. Starka magneter kan plötsligt hålla fast vid varandra, potentiellt orsakar skada på användaren och skadar magneterna själva, för att undvika detta, hålla magneten separeras på ett säkert avstånd.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

Analys av cardiomyocyte Development använder Immunfluorescens i embryonal Mouse Heart

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Improved Generation of Induced Cardiomyocytes Using a Polycistronic Construct Expressing Optimal Ratio of Gata4, Mef2c and Tbx5

Förbättrad Generering av inducerade Cardiomyocytes Använda en polycistroniskt konstruktion som uttrycker optimala förhållandet mellan GATA4, Mef2c och Tbx5

Direct conversion of cardiac fibroblasts (CFs) into induced cardiomyocytes (iCMs) holds great potential for regenerative medicine by offering alternative ...

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

Epigenetisk reglering av hjärt Differentiering av embryonala stamceller och vävnader

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

Maturation of Human Stem Cell-derived Cardiomyocytes in Biowires Using Electrical Stimulation

Mognad av mänskliga stamceller som härrör Cardiomyocytes i Biowires Använda elektrisk stimulering

Human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hPSC-CMs) have been a promising cell source and have thus encouraged the investigation of their ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

Organotypic kultur metod att studera utvecklingen av embryonala kyckling vävnader

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart

Nanopartikel-medierad siRNA nedtystning i vuxen zebrafiskar hjärtat

Mammals have a very limited capacity to regenerate the heart after myocardial infarction. On the other hand, the adult zebrafish regenerates its heart ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone

Vävnads beredning och immunofärgning av mus kraniofaciala vävnader och Undecalcified Bone

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Mikroskop-baserat System för i Vivo Implantation av embryonala hjärtmuskelcellerna i aviär embryot

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

In Vitro Generation of Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells

In vitro generation av mus hjärta fält-specifika hjärt progenitor celler

Pluripotent stem cells offer great potential for understanding heart development and disease and for regenerative medicine. While recent advances in ...

Analysis of Congenital Heart Defects in Mouse Embryos Using Qualitative and Quantitative Histological Methods

Analys av medfödda hjärtfel i musembryon med hjälp av kvalitativa och kvantitativa histologiska metoder

Congenital heart defects (CHD) are the most common type of birth defect in humans, affecting up to 1% of all live births. However, the underlying causes ...