Name: effect of artificial tear formulations on the metabolic activity of human corneal epithelial cells after exposure to desiccation
Uploaded: 2020-05-02T13:00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Effect of Artificial Tear Formulations on the Metabolic Activity of Human Corneal Epithelial Cells after Exposure to Desiccation at JoVE.com

Les auteurs remercient Alcon d’avoir apporté un soutien financier à ces études.

1. Culture de cellules épithéliales cornéennes humaines
<ol><li>Cultiver hcec19 immortalisé dans des flacons de 75 cm2 enrobés de collagène avec 20 mL de milieu Eagle modifié de Dulbecco /mélange de nutriments F-12 (DMEM/F12) contenant 10% de sérum fœtal bovin (FBS) et 1% de pénicilline/streptomycine à 37 °C avec 5% de CO2. Remarque : la secousse n’est pas nécessaire.</li>
	<li>Changez le média tous les 2 à 3 jours.</li>
</ol>2. Préparation des cellules pour les tests
<ol><li>Une fois que les cellules sont presque confluentes, retirez les milieux de culture.</li>
	<li>Ajouter 4−6 mL de solution de dissociation cellulaire à chaque fiole de 75 cm2. Incuber les cellules à 37 °C jusqu’à ce qu’elles se détachent (environ 20−30 min), en vérifiant périodiquement au microscope.</li>
	<li>Ajouter 2−6 mL de DMEM/F12 contenant 10 % de FBS dans chaque fiole de 75 cm2.</li>
	<li>Transférer le contenu du ballon dans un tube à centrifuger de 50 mL.</li>
	<li>Centrifuger les cellules à 450−500 x g pendant 5 min. Pipetez le surnageant et ressuscitez les cellules dans des milieux préchauffés.</li>
	<li>Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Calculez le volume de média qui contient un total de 1 x 105 cellules.</li>
	<li>Ajouter 1 x 105 cellules à chaque puits d’une plaque de culture enrobée de collagène-1 de 48 puits. Ajoutez suffisamment de supports au puits pour que le volume final de média dans le puits soit de 0,5 mL de culture DMEM/F12 avec 10 % de FBS. REMARQUE: Une formulation de déchirure artificielle peut provoquer une cytotoxicité qui peut être mesurée par une diminution de l’activité métabolique de HCEC. La cohérence des données dépend de l’ajout du même nombre de HCEC à chaque puits lors de l’ensemencement. La concentration de culture recommandée pour 48 plaques de puits est de 1 x 105. Étant donné que les cellules de mammifères peuvent se déposer dans le tube de centrifugation après la remise en suspension, il est recommandé de remettre les cellules en suspension fréquemment par agitation lors de l’ensemencement des plaques avec des cellules afin que la suspension cellulaire ait le HCEC également distribué.</li>
	<li>Incuber les cellules à 37 °C et 5 % deCO2 pendant 24 h.</li>
</ol>3. Pas de protocole de dessiccation
<ol><li>Procédure de contrôle<ol>
<li>Après l’incubation de 24 h, retirez le milieu de culture de la plaque.</li>
		<li>Traiter immédiatement avec 150 μL d’une formulation d’essai et d’une solution de contrôle du support.</li>
		<li>Incuber les cellules à 37 °C et 5 % deCO2 pendant 30 min.</li>
		<li>Retirez les solutions de test des cellules.</li>
		<li>Ajouter 0,5 mL de solution de colorant métabolique à 10 % pour tester l’activité métabolique. Incuber les cellules pendant encore 4 h à 37 °C et 5 % deCO2.</li>
		<li>Après la période d’incubation de 4 h, retirer 100 μL de solution de colorant métabolique de chaque puits et placer chaque 100 μL dans un puits d’une plaque de 96 puits.</li>
		<li>Mesurer la fluorescence de chaque puits à l’aide d’un lecteur de plaques fluorescentes(Table des matériaux). Réglez la longueur d’onde d’excitation à 540 nm et la longueur d’onde d’émission à 590 nm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pas de protocole de dessiccation (procédure de récupération)<ol>
<li>Répéter les étapes 3.1.1 à 3.1.4.</li>
		<li>Ajouter 0,5 mL de support DMEM/F12 à chaque puits.</li>
		<li>Incuber une série de cultures pendant 18 h à 37 °C et 5 % deCO2.</li>
		<li>Retirer le support et ajouter 0,5 mL de solution de colorant métabolique à 10 %. Répétez les étapes 3.1.6 et 3.1.7.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Protocole de dessiccation
<ol><li>Procédure de contrôle<ol>
<li>Après l’incubation de 24 h (étape 2.8), retirer le milieu de culture de la plaque.</li>
		<li>Traiter immédiatement avec 150 μL d’une formulation d’essai et d’une solution de contrôle du support.</li>
		<li>Incuber les cellules à 37 °C et 5 % deCO2 pendant 30 min.</li>
		<li>Retirez les solutions de test des cellules.</li>
		<li>Placer les cellules dans une chambre à 37 °C et 45 % HR pendant 5 min pour les dessécher.</li>
		<li>Ajouter 0,5 mL de solution de colorant métabolique à 10 % pour tester l’activité métabolique. Incuber les cellules pendant encore 4 h à 37 °C et 5 % deCO2.</li>
		<li>Après la période d’incubation de 4 h, retirer 100 μL de solution de colorant métabolique de chaque puits et placer chaque 100 μL dans un puits d’une plaque de 96 puits.</li>
		<li>Mesurer la fluorescence de chaque puits à l’aide d’un lecteur de plaques fluorescentes. Réglez la longueur d’onde d’excitation à 540 nm et la longueur d’onde d’émission à 590 nm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Procédure de récupération<ol>
<li>Répéter les étapes 4.1.1 à 4.1.5.</li>
		<li>Ajouter 0,5 mL de support DMEM/F12 à chaque puits.</li>
		<li>Incuber une série de cultures pendant 18 h à 37 °C et 5 % deCO2.</li>
		<li>Retirer le support et ajouter 0,5 mL de solution de colorant métabolique à 10 %. Répétez les étapes 4.1.7 et 4.1.8.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Analyse des données
<ol><li>Calculer la fluorescence moyenne du contrôle du média. Calculez le pourcentage de viabilité de l’échantillon à l’aide de la formule suivante : Pourcentage de viabilité de l’échantillon = fluorescence de l’échantillon d’essai/fluorescence de contrôle des milieux x 100 REMARQUE: La moyenne de contrôle des médias est de 100% de viabilité. Le colorant métabolique en lui-même a une petite quantité de fluorescence qui lui est associée. La fluorescence du réactif métabolique du colorant peut être soustraite de la fluorescence de l’échantillon témoin et de l’échantillon d’essai avant de calculer le pourcentage de viabilité des échantillons d’essai au témoin du support.</li>
	<li>Effectuer un test de normalité et un test pour des variances égales sur les échantillons témoins et d’essai.</li>
	<li>Si le test de normalité réussit et que les variances sont égales, effectuez une ANOVA unidirectionnelle. Pour identifier les différences significatives entre des groupes spécifiques, effectuez un test post hoc de comparaisons par paires (c.-à-d. les tests de comparaisons multiples de Tukey ou de Dunnett).</li>
	<li>Si le test de normalité réussit et que les variances sont différentes, effectuez l’ANOVA de Welch. Pour identifier les différences significatives entre des groupes spécifiques, effectuez un test post hoc de comparaisons par paires (c.-à-d. les tests de comparaisons multiples de Dunnett ou de Games-Howell).</li>
	<li>Si le test de normalité échoue, utilisez un test non paramétrique (c.-à-d. test de Kruskal-Wallis). Pour identifier les différences significatives entre des groupes spécifiques, effectuez un test post hoc de comparaisons par paires (c.-à-d. le test de Dunn).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Xu, M., Sivak, J. G., McCanna, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+effects+of+ophthalmic+solutions+on+human+corneal+epithelial+cells+using+fluorescent+dyes.">Comparison of the effects of ophthalmic solutions on human corneal epithelial cells using fluorescent dyes.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 29 (9), 794-802 (2013).</li><li>Maurer, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+measurement+of+acute+corneal+injury+in+rabbits+with+surfactants+of+different+type+and+irritancy.">Quantitative measurement of acute corneal injury in rabbits with surfactants of different type and irritancy.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 158 (1), 61-70 (1999).</li><li>Xu, M. L., McCanna, D. J., Sivak, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+viability+reagent+PrestoBlue+in+comparison+with+alamarBlue+and+MTT+to+assess+the+viability+of+human+corneal+epithelial+cells.">Use of the viability reagent PrestoBlue in comparison with alamarBlue and MTT to assess the viability of human corneal epithelial cells.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 71, 1-7 (2015).</li><li>Slaughter, M. R., Bugelski, P. J., O'Brien, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+alamar+blue+reduction+for+the+in+vitro+assay+of+hepatocyte+toxicity.">Evaluation of alamar blue reduction for the in vitro assay of hepatocyte toxicity.</a> Toxicology in Vitro. 13 (4-5), 567-569 (1999).</li><li>Hakkarainen, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+cytotoxic+effects+of+marketed+ophthalmic+formulations+on+human+corneal+epithelial+cells.">Acute cytotoxic effects of marketed ophthalmic formulations on human corneal epithelial cells.</a> International Journal of Pharmaceutics. 511 (1), 73-78 (2016).</li><li>Paulsen, K., Maile, S., Giebel, J., Tost, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lubricating+agents+differ+in+their+protection+of+cultured+human+epithelial+cells+against+desiccation.">Lubricating agents differ in their protection of cultured human epithelial cells against desiccation.</a> Medical Science Monitor. 14 (6), 12-16 (2008).</li><li>Tost, F., Keiss, R., Grossjohann, R., Jurgens, C., Giebel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+different+artificial+tears+against+desiccation+in+cultured+human+epithelial+cells.">Effect of different artificial tears against desiccation in cultured human epithelial cells.</a> Medical Science Monitor. 18 (5), 188-192 (2012).</li><li>Ubels, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-clinical+investigation+of+the+efficacy+of+an+artificial+tear+solution+containing+hydroxypropyl-guar+as+a+gelling+agent.">Pre-clinical investigation of the efficacy of an artificial tear solution containing hydroxypropyl-guar as a gelling agent.</a> Current Eye Research. 28 (6), 437-444 (2004).</li><li>Hovakimyan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+protective+effects+of+trehalose+on+desiccation+of+epithelial+cells+in+three+dimensional+reconstructed+human+corneal+epithelium.">Evaluation of protective effects of trehalose on desiccation of epithelial cells in three dimensional reconstructed human corneal epithelium.</a> Current Eye Research. 37 (11), 982-989 (2012).</li><li>Zheng, X., Goto, T., Shiraishi, A., Ohashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+efficacy+of+ocular+surface+lubricants+against+dehydration.">In vitro efficacy of ocular surface lubricants against dehydration.</a> Cornea. 32 (9), 1260-1264 (2013).</li><li>Matsuo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trehalose+protects+corneal+epithelial+cells+from+death+by+drying.">Trehalose protects corneal epithelial cells from death by drying.</a> British Journal of Ophthalmology. 85 (5), 610-612 (2001).</li><li>Zheng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+activated+NLRP3+inflammasomes+initiate+inflammation+in+hyperosmolarity+stressed+human+corneal+epithelial+cells+and+environment-induced+dry+eye+patients.">Reactive oxygen species activated NLRP3 inflammasomes initiate inflammation in hyperosmolarity stressed human corneal epithelial cells and environment-induced dry eye patients.</a> Experimental Eye Research. 134, 133-140 (2015).</li><li>Hua, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+Effects+of+L-Carnitine+Against+Oxidative+Injury+by+Hyperosmolarity+in+Human+Corneal+Epithelial+Cells.">Protective Effects of L-Carnitine Against Oxidative Injury by Hyperosmolarity in Human Corneal Epithelial Cells.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 56 (9), 5503-5511 (2015).</li><li>Schulze, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trefoil+factor+family+peptide+3+(TFF3)+is+upregulated+under+experimental+conditions+similar+to+dry+eye+disease+and+supports+corneal+wound+healing+effects+in+vitro.">Trefoil factor family peptide 3 (TFF3) is upregulated under experimental conditions similar to dry eye disease and supports corneal wound healing effects in vitro.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 55 (5), 3037-3042 (2014).</li><li>Giaconia, C., Orioli, A., Di Gangi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Air+quality+and+relative+humidity+in+commercial+aircrafts:+An+experimental+investigation+on+short-haul+domestic+flights.">Air quality and relative humidity in commercial aircrafts: An experimental investigation on short-haul domestic flights.</a> Building and Environment. 67, 69-81 (2013).</li><li>van Setten, G., Labetoulle, M., Baudouin, C., Rolando, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+seasonality+and+effects+of+psychrometry+in+dry+eye+disease.">Evidence of seasonality and effects of psychrometry in dry eye disease.</a> Acta Ophthalmologica. 94 (5), 499-506 (2016).</li><li>Valtink, M., Donath, P., Engelmann, K., Knels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+different+culture+media+and+deswelling+agents+on+survival+of+human+corneal+endothelial+and+epithelial+cells+in+vitro.">Effect of different culture media and deswelling agents on survival of human corneal endothelial and epithelial cells in vitro.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 254 (2), 285-295 (2016).</li><li>Zachari, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+Alamarblue+Assay+for+Adherent+Cell+Irradiation+Experiments.">Evaluation of the Alamarblue Assay for Adherent Cell Irradiation Experiments.</a> Dose-Response. 12 (2), 246-258 (2014).</li><li>Griffith, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+human+corneal+equivalents+constructed+from+cell+lines.">Functional human corneal equivalents constructed from cell lines.</a> Science. 286 (5447), 2169-2172 (1999).</li><li>Benelli, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systane+lubricant+eye+drops+in+the+management+of+ocular+dryness.">Systane lubricant eye drops in the management of ocular dryness.</a> Clinical Ophthalmology. 5, 783-790 (2011).</li><li>Davis, R. E., McGregor, G. R., Enfield, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humidity:+A+review+and+primer+on+atmospheric+moisture+and+human+health.">Humidity: A review and primer on atmospheric moisture and human health.</a> Environmental Research. 144 (Pt A), 106-116 (2016).</li><li>Calonge, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+Adverse+Environment+Chambers+in+Dry+Eye+Research.">Controlled Adverse Environment Chambers in Dry Eye Research.</a> Current Eye Research. 43 (4), 445-450 (2018).</li><li>McCulley, J. P., Uchiyama, E., Aronowicz, J. D., Butovich, I. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+surface+temperature:+a+review.">Ocular surface temperature: a review.</a> Eye &amp; Contact Lens. 31 (3), 117-123 (2005).</li><li>Stepanenko, A. A., Dmitrenko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pitfalls+of+the+MTT+assay:+Direct+and+off-target+effects+of+inhibitors+can+result+in+over/underestimation+of+cell+viability.">Pitfalls of the MTT assay: Direct and off-target effects of inhibitors can result in over/underestimation of cell viability.</a> Gene. 574 (2), 193-203 (2015).</li><li>Stockert, J. C., Horobin, R. W., Colombo, L. L., Blazquez-Castro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetrazolium+salts+and+formazan+products+in+Cell+Biology:+Viability+assessment,+fluorescence+imaging,+and+labeling+perspectives.">Tetrazolium salts and formazan products in Cell Biology: Viability assessment, fluorescence imaging, and labeling perspectives.</a> Acta Histochemica. 120 (3), 159-167 (2018).</li><li>Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetrazolium+dyes+as+tools+in+cell+biology:+new+insights+into+their+cellular+reduction.">Tetrazolium dyes as tools in cell biology: new insights into their cellular reduction.</a> Biotechnology Annual Review. 11, 127-152 (2005).</li><li>Rampersad, S. 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R., Berger, T., Mak, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+functions+in+cell+death+and+disease.">Caspase functions in cell death and disease.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (4), a026716 (2015).</li><li>McCanna, D. J., Harrington, K. L., Driot, J. Y., Ward, K. W., Tchao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+human+corneal+epithelial+cell+line+for+screening+the+safety+of+contact+lens+care+solutions+in+vitro.">Use of a human corneal epithelial cell line for screening the safety of contact lens care solutions in vitro.</a> Eye &amp; Contact Lens. 34 (1), 6-12 (2008).</li><li>Puhlev, I., Guo, N., Brown, D. R., Levine, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Desiccation+tolerance+in+human+cells.">Desiccation tolerance in human cells.</a> Cryobiology. 42 (3), 207-217 (2001).</li><li>Garrigue, J. S., Amrane, M., Faure, M. O., Holopainen, J. M., Tong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relevance+of+Lipid-Based+Products+in+the+Management+of+Dry+Eye+Disease.">Relevance of Lipid-Based Products in the Management of Dry Eye Disease.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 33 (9), 647-661 (2017).</li><li>Lievens, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+an+enhanced+viscosity+artificial+tear+for+moderate+to+severe+dry+eye+disease:+A+multicenter,+double-masked,+randomized+30-day+study.">Evaluation of an enhanced viscosity artificial tear for moderate to severe dry eye disease: A multicenter, double-masked, randomized 30-day study.</a> Contact Lens &amp; Anterior Eye. 42 (4), 443-449 (2019).</li></ol>

Trois auteurs (Rekha Rangarajan, Howard A. Ketelson, Lakshman Subbaraman) sont employés d’Alcon. Alcon est la seule source de financement et de parrainage de ce projet. Lyndon W. Jones, au cours des 3 dernières années, a reçu un soutien à la recherche ou des honoraires de conférencier des sociétés suivantes: Alcon, Allergan, Contamac, CooperVision, GL Chemtec, Inflamax Research, J & J Vision, Menicon, Nature’s Way, Novartis, PS Therapy, Santen, Shire, SightGlass et Visioneering. Lyndon Jones est également consultant et/ou membre d’un conseil consultatif pour Alcon, CooperVision, J&J Vision, Novartis et Ophtecs. La liste suivante d’auteurs n’a rien à divulguer : Richard Do, David J. McCanna, Adeline Suko, Daryl Enstone, Jaya Dantam.

Ce protocole est conçu pour déterminer les effets protecteurs des solutions de déchirure artificielle contre la dessiccation cellulaire. Initialement, les cellules sont exposées aux gouttes sèches pour les yeux pour enrober les cellules. Ensuite, les cellules sont séchées et l’activité métabolique est surveillée pour évaluer si les formulations peuvent atténuer les effets néfastes du stress de dessiccation. Ces étapes sont essentielles pour comprendre l’impact global que les formulations de sécheresse oculaire pourraient avoir sur la viabilité globale des cellules épithéliales cornéennes.
Une fois que la plupart des formulations pour la sécheresse oculaire sont retirées des puits de culture, la chimie des molécules restantes qui sont en contact avec les cellules aura un impact sur la dessiccation cellulaire. Certains produits contiennent des micro-émulsions d’huiles qui minimisent l’évaporation cellulaire20. Une étude qui a évalué l’analyse de frottement après rinçage a montré le maintien d’un faible frottement pour certaines formulations d’yeux secs qui peuvent être un indicateur du temps de séjour amélioré des formulations d’yeux secs21. L’une des limites de ce test est que, bien que la protection contre la dessiccation puisse être évaluée par rapport à d’autres formulations de gouttes oculaires, la durée de cette protection ne peut pas être déterminée en raison du court temps de séchage évalué. Des temps de séchage plus longs dans cet essai in vitro peuvent nécessiter l’utilisation de cultures multicouches qui ont globalement plus d’humidité qu’une monocouche cellulaire.
Les temps d’incubation spécifiques pour les formulations sur les cellules et la durée du temps de séchage peuvent devoir être ajustés si les valeurs de température et d’humidité sont modifiées. Il peut être difficile de choisir une température, une HR et un flux d’air pour simuler des conditions de stress environnemental qui peuvent contribuer à la sécheresse oculaire, car les conditions environnementales saisonnières et locales sont assez variables21. Les chambres de l’environnement moderne pour les études humaines peuvent faire varier la température entre 5 ° C et 35 ° C, et l’HR entre 5% et 95%22. À l’aide d’un évaporimètre et de lunettes bien ajustées, il a été déterminé qu’à une HR de 40−45 %, le taux d’évaporation de la cornée était de 0,037 μL/cm2 /min et qu’à une HR de 20−25 %, le taux d’évaporation était de 0,065 μL/cm2/min23. Si le modèle in vitro examine l’effet protecteur des formulations dans des conditions d’HR extrêmement faibles, comme dans les avions15,les déserts ou les environnements intérieurs secs16,les temps d’incubation peuvent devoir être réduits pour s’adapter aux taux d’évaporation accrus des cellules. Dans le liquide lacrymal humain, une variété de lipides dérivés de meibomian et d’autres glandes sont présents qui protègent les larmes de l’évaporation. Ces lipides ont des points de fusion différents24. Les changements de température pourraient avoir une incidence sur la fluidité du liquide lacrymal, de sorte que les essais effectués à température ambiante pourraient avoir des taux d’évaporation sensiblement différents de ceux des essais effectués à 37 °C. Étant donné que la plage de température moyenne de surface oculaire est comprise entre 32,9 et 36 °C25,il est recommandé d’effectuer l’essai près de cette plage de températures.
En plus du colorant métabolique (alamarBlue) utilisé dans ce protocole, il existe d’autres réactifs chimiques qui peuvent être utilisés pour évaluer les effets des formulations de produits sur l’activité métabolique des cellules. Les sels de tétrazolium (MTT, XTT, MTS, WST) sont des produits chimiques de remplacement qui peuvent être utilisés. La différence dans les sels de tétrazolium est que MTT est une molécule chargée positivement de sorte qu’il peut entrer dans le cytoplasme des cellules vivantes26. MTT devient insoluble après sa réductionpar NAD(P)H27. Il doit être solubilisé avant de lire l’absorbance sur un lecteur de plaque. Les autres sels de tétrazolium sont chargés négativement28. Ils doivent être réduits par des molécules secondaires en dehors de la cellule vivante car ils ne peuvent pas pénétrer dans la cellule et interagir directement avec les molécules intracellulaires29. Pour les dosages XTT, MTS, et WST-1, l’ajout d’un agent de couplage électronique 1-méthoxy phénazine méthulfate (PMS) peut améliorer les performances des dosages30. Contrairement aux tests métaboliques qui utilisent des sels de tétrazolium, alamarBlue ne nécessite pas d’agents solubilisants ou de couplage électronique supplémentaires. En outre, contrairement à XTT, MTS ou WST-1, alamarBlue pénètre dans les membranes cellulaires et peut être réduit directement par les enzymes cellulaires27,29. La comparaison directe de l’alamarBlue aux sels de tétrazolium a montré que l’alamarBlue est plus sensible pour évaluer l’activité métabolique de diverses lignées cellulaires, y compris HCEC3,27,31,32.
D’autres paramètres biochimiques peuvent également être pris en compte pour évaluer la protection des cellules épithéliales cornéennes humaines par dessiccation. Les colorants fluorescents peuvent être utilisés pour détecter la perméabilité de la membrane cellulaire et l’activité de l’estérase cellulaire1. En outre, l’apoptose peut être détectée par coloration pour les marqueurs apoptotiques à la surface cellulaire ou par mesure de l’activité de la caspase1,33. D’autres dosages ont permis de déterminer les effets des produits ophtalmiques sur les jonctions étanches HCEC34. Ces essais pourraient être incorporés dans les évaluations futures utilisant les procédures de dessiccation décrites dans cet article.
Il existe de nombreuses causes de sécheresse oculaire. La sécheresse oculaire peut être causée par une diminution de la sécrétion de larmes, une inflammation accrue de la surface oculaire ou une déshydratation accrue à la surface oculaire. Pour les personnes qui ont l’œil sec évaporateur, l’utilisation d’une goutte oculaire sèche qui empêche leurs cellules de sécher pendant les conditions de dessiccation peut soulager les symptômes de la sécheresse oculaire. L’un des problèmes dans certaines formulations pour la sécheresse oculaire est la présence de conservateurs qui peuvent nuire à la surface oculaire. Blesser les cellules n’est pas utile pour les patients oculaires secs car il peut causer plus de cellules à mourir que les cellules blessées sont plus sensibles au stress de dessiccation35.
Un article de synthèse récent de Garrigue et coll.36 fournit une évaluation des connaissances actuelles sur la façon dont les produits à base de lipides agissent pour soulager la sécheresse oculaire par évaporation. L’ajout de lipides aux larmes déficientes en lipides peut empêcher l’évaporation, protégeant ainsi les cellules de la dessiccation. De plus, les humectants sont des molécules qui attirent et retiennent l’eau à la surface oculaire37. La glycérine en solution #1 et le propylène glycol en solution #3 sont des humectants. La solution #3 a montré un plus grand effet protecteur de la HCEC qui peut avoir été dû aux propriétés lipidiques et humectantes des ingrédients de la formulation.
Ce protocole est conçu pour évaluer l’activité métabolique de HCEC après exposition aux formulations d’oeil sec et au stress de dessiccation. En utilisant les méthodes décrites dans cet article, de nouvelles gouttes oculaires non irritantes et protectrices peuvent être développées pour les personnes qui souffrent de sécheresse oculaire évaporive.

De nombreux ingrédients différents dans les solutions ophtalmiques à doses multiples sont nécessaires pour maintenir la stabilité, le pH, l’osmolarité et l’efficacité. Cependant, certains produits chimiques tels que les conservateurs ou les tensioactifs dans des solutions oculaires peuvent causer des dommages à l’épithélium cornéen1,2. Des tests de viabilité cellulaire utilisant des cellules épithéliales cornéennes humaines (HCEC) peuvent être effectués pour évaluer les dommages potentiels causés par ces divers ingrédients dans les formulations ophtalmiques. L’un des tests in vitro qui est particulièrement utile pour évaluer les dommages cellulaires est le test alamarBlue3. Dans ce test, le colorant métabolique (c’est-à-dire alamarBlue) contient de la résazurine, qui fonctionne comme un indicateur de viabilité cellulaire. Lors de la respiration cellulaire, la résazurine est réduite en résorufine en acceptant les électrons4. La réduction de la résorufine provoque un passage d’une molécule non fluorescente à une molécule fluorescente qui peut être détectée à l’aide d’un spectrofluoromètre5.
Cette enquête utilise deux traitements différents des cellules épithéliales cornéennes pour déterminer comment les produits pour la sécheresse oculaire peuvent fonctionner dans un modèle in vitro. Dans la première évaluation, les cellules sont traitées avec ces produits pendant 30 min. Après le traitement, les cellules sont ensuite évaluées pour l’activité métabolique immédiatement après l’exposition aux produits de la sécheresse oculaire et après un intervalle de temps de récupération. Cette évaluation détermine l’effet de ces produits sur les cellules avant la dessiccation dans une chambre d’humidité. Les conservateurs en solution, les tensioactifs ou les tampons dans ces solutions peuvent avoir des effets cytotoxiques sur les cellules qui peuvent être détectés à l’aide du colorant métabolique.
La deuxième évaluation détermine l’activité métabolique des cellules après l’exposition aux produits de sécheresse oculaire et la dessiccation. Dans cette évaluation, si le traitement du produit offre une protection aux cellules contre les dommages causés par la dessiccation, l’activité métabolique des cellules sera maintenue. La protection cellulaire contre les effets nocifs de la dessiccation peut se produire si le produit pour la sécheresse oculaire peut recouvrir les cellules de lipides ou si le produit peut absorber le liquide de l’environnement en ajoutant de l’humidité aux cellules.
Ce protocole est conçu pour simuler des conditions sévères de stress environnemental sur les cellules. D’autres études ont utilisé divers modèles pour créer ce stress externe. Certaines études ont séché les cellules dans des hottes à flux laminaire6,7,8,tandis que d’autres ont utilisé la température ambiante et diverses valeurs d’humidité relative (HR)9,10,11. Un procédé de simulation des conditions oculaires sèches consiste à augmenter l’osmolarité de la solution d’incubation12,13. Une autre méthode in vitro pour simuler des conditions environnementales défavorables consiste à ajouter des cytokines au média cellulaire pour simuler le liquide lacrymal des patients oculaires secs14. Bien que ces tests soient des modèles intéressants qui peuvent évaluer comment les produits chimiques réduisent le stress osmotique ou stimulent le système immunitaire, ces modèles ne montrent pas directement comment les formulations chimiques peuvent protéger les cellules du stress de dessiccation.
Le modèle de dessiccation utilise une chambre température/humidité de 37 °C et 45 % HR. Il simule les conditions environnementales qui peuvent provoquer l’évaporation de la surface oculaire. Des simulations d’autres conditions environnementales extrêmes telles que la faible humidité constatée dans les cabines d’avion15 ou dans les environnements intérieurs pendant les mois d’hiver16 peuvent également être réalisées à l’aide de cette méthode.
La modélisation de culture cellulaire est utilisée pour simuler l’effet du stress de dessiccation sur la cornée humaine. Afin de détecter le stress cellulaire, des tests de viabilité cellulaire sont entrepris pour déterminer l’impact sur la santé cellulaire. Plusieurs tests physiologiques différents peuvent être effectués sur des cellules pour déterminer si elles sontstressées 17. L’analyse effectuée dans cette procédure d’essai utilise le colorant métabolique disponible dans le commerce(Table des matériaux). Il a l’avantage par rapport à de nombreux autres tests de stress cellulaire en ce qu’il est non toxique, soluble dans les milieux de croissance et peut évaluer les cellules sans fixation cellulaire18. Dans cette procédure, les cellules sont testées pour l’activité métabolique immédiatement après chaque traitement et un deuxième ensemble de cellules sont replacées dans des milieux de croissance et évaluées après une récupération de 18 h. La raison des tests immédiatement, puis après une période de récupération est d’identifier les dommages cellulaires qui provoquent des effets immédiats sur l’activité métabolique et les dommages cellulaires qui provoquent des effets retardés. En outre, il offre l’occasion d’évaluer l’impact de ces formulations sur les dommages à court terme par rapport aux dommages à long terme et la capacité des formulations à récupérer / ne pas récupérer de l’insulte initiale.
Cette enquête est employée pour comparer divers produits d’oeil sec lipide-contenants pour leur effet sur l’activité métabolique de HCEC avec et sans dessiccation. Les ingrédients des produits pour la sécheresse oculaire testés sont décrits dans la table des matériaux. Les ingrédients en solution #1 sont la carboxyméthylcellulose sodique (0,5%), la glycérine (1%), et le polysorbate 80 (0,5%), en solution #2 ce sont de l’huile minérale légère (1,0%) et l’huile minérale (4,5%), et en solution #3 le lipide est l’huile minérale et le propylène glycol est le démulcent. Ces lipides sont les composants de formulation qui devraient fournir une protection du HCEC contre la dessiccation.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>75 cm2 Vented Flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354485</td>
			<td>This is the BioCoat brand collagen coated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>costar</td>
			<td>3370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alamarBlue</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>dal 1025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 48 Well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354505</td>
			<td>This is the BioCoat brand collagen coated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 5</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>CYT5MPV</td>
			<td>Can read fluorescence from 280 - 700 nm (for assay 540/590)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 with L-glutamine and 15 mM HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11039-021</td>
			<td>There is No Phenol Red in this media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hycone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Corneal Epithelial Cells</td>
			<td>University of Ottawa</td>
			<td>N/A</td>
			<td>SV40-immortalized human corneal epithelial cells from Dr. M. Griffith (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Canada) and have been characterized Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 1999;286:2169&#8211;72.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity/Temperature Chamber</td>
			<td>Associated Environmental Systems</td>
			<td>LH-1.5</td>
			<td>Economy Line Humidity Chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>100X concentration so add 1ml to each 99ml of media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refresh Optive Advanced (solution #1)</td>
			<td>Allergan, Inc</td>
			<td></td>
			<td>Carboxymethylcellulose Sodium (0.5%),Glycerin (1%),polysorbate 80 (0.5%),-Lubricants- Inactive ingredients-boric acid; carbomer copolymer type A; castor oil; erythritol; levocarnitine; purified water; Purite (stablized oxychloro complex)and may contain sodium hydroxide to adjust pH.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soothe XP (solution #2)</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb</td>
			<td></td>
			<td>Light mineral oil (1.0%), Mineral Oil (4.5%)-emolients-Inactive ingredients-boric acid, edetate disodium, octoxynol-40, polyquaternium-1 (preservative), polysorbate 80, purified water, sodium borate decahydrate. May contain hydrochloric acid and/or sodium hydroxide (to adjust pH).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Systane Complete (solution #3)</td>
			<td>Alcon Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Propylene Glycol 0.6% Lubricant Inactive ingredients- boric acid, dimyristoyl phosphatidylglycerol, edatate disodium, hydroxypropyl guar, mineral oil, polyoxl 40 stearate, POLYQUAD&#174; (polyquaternium-1) 0.001% preservative, sorbitan tristearate, sorbitol and purified water. May contain hydrochloric acid and/or sodium hydroxide to adjust pH.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express (cell disassociation solution)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/12605036" target="_blank">12605036</a></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

effect of artificial tear formulations on the metabolic activity of human corneal epithelial cells after exposure to desiccation

Des formulations de déchirure contenant des lipides artificiels sont développées pour réduire l’évaporation de la déchirure par la restauration d’une couche lipidique lacrymogène déficiente. Les formulations de déchirure artificielle qui empêchent la dessiccation cellulaire se traduiront par une protection de surface oculaire et le maintien de l’activité métabolique cellulaire. Pendant la déshydratation, les cellules subissent le processus de perte d’activité métabolique et, par la suite, de mort cellulaire. Ce travail décrit une méthode d’évaluation de l’efficacité des formulations de déchirures artificielles. Le colorant métabolique (c.-à-d. alamarBlue) passe d’une molécule faiblement fluorescente resazurin à une molécule fluorescente resorufin dans les cellules viables. La performance biologique d’une formulation de déchirure artificielle est mesurée comme la capacité de la formulation à (a) maintenir la viabilité cellulaire et (b) fournir une protection cellulaire contre la dessiccation. Les milieux de croissance et les solution salines sont utilisés comme témoins pour les tests de viabilité cellulaire et de dessiccation. Les cellules sont incubées avec des solutions d’essai pendant 30 min, puis desséchées pendant 0 ou 5 min à 37 °C et 45 % d’humidité relative. L’activité métabolique cellulaire après l’exposition initiale et après la dessiccation cellulaire est ensuite déterminée. Les résultats montrent les effets comparatifs des formulations de gouttes oculaires sur l’activité métabolique des cellules et la protection contre la dessiccation. Cette méthode peut être utilisée pour tester des formulations pour la sécheresse oculaire conçues pour traiter les personnes atteintes d’une sécheresse oculaire par évaporation.

Les résultats d’une étude comparant trois formulations pour la sécheresse oculaire sont présentés à la figure 1. Cette figure montre qu’il existe des différences dans l’effet des trois produits, la solution #1, la solution #2 et la solution #3(table des matériaux)sur la viabilité de HCEC. La solution #1 et la solution #2 ont eu un effet significatif sur l’activité métabolique de HCEC avant dessiccation. Cela signifie qu’il y a des composants de formulation dans ces produits qui peuvent perturber l’activité métabolique de la HCEC. La baisse additionnelle de l’activité métabolique de cellules qui s’est produite après le rétablissement de 18 h des cellules exposées à la solution #1 prouve que HCEC ont été blessés au commencement et après 18 h la blessure n’a pas été réparée. En comparaison, la solution #3 n’a eu qu’un effet léger sur l’activité métabolique du HCEC.
La figure 2 montre l’effet de ces formulations de sécheresse oculaire contenant des lipides sur la protection cellulaire. Avec une activité métabolique de HCEC de près de 0% à l’intervalle de récupération de 18 h, la solution #1 et la solution #2 n’ont pas protégé des cellules contre le stress de dessiccation. La solution #3, cependant, offrait une certaine protection contre le stress de dessiccation.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60812/60812fig1.jpg"> Ill. 1 : Effet des produits hypolipidiques pour la sécheresse oculaire sur la viabilité cellulaire. Viabilité relative mesurée par l’activité métabolique de HCEC après traitement avec des produits lipide-contenants d’oeil sec. * = signification statistique (p < 0,05) par rapport à la solution #3, Δ = signification statistique (p < 0,05) par rapport au témoin du support pour la période de récupération appropriée. La hauteur de la barre représente la valeur moyenne et les barres d’erreur sont le SD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60812/60812fig1large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour afficher une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60812/60812fig2.jpg"> Ill. 2 : Effet des produits hypolipidés pour la sécheresse oculaire sur la protection contre la dessiccation. Effet des formulations d’oeil sec contenant des lipides sur la protection cellulaire. La solution #1 et la solution #2 n’ont pas protégé les cellules contre le stress de dessiccation, et elles n’ont pas récupéré des effets de dessiccation au fil du temps. En revanche, la solution #3 offrait une certaine protection contre le stress de dessiccation. * = p < 0,05 par rapport à la solution #3, et Δ = p < 0,05 par rapport aux milieux non traités (témoins) pendant le temps de récupération approprié. La hauteur de la barre représente la valeur moyenne et les barres d’erreur sont le SD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60812/60812fig2large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour afficher une version agrandie de cette figure.</a>

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Effect of Artificial Tear Formulations on the Metabolic Activity of Human Corneal Epithelial Cells after Exposure to Desiccation

Le but de ce protocole est d’évaluer si différentes formulations artificielles de larme peuvent protéger les cellules épithéliales cornéennes humaines contre la dessiccation utilisant un modèle in vitro. Après exposition aux formulations artificielles de larmes et à la dessiccation, les cellules épithéliales cornéennes humaines sont évaluées pour l’activité métabolique.

Effet des formulations de larmes artificielles sur l’activité métabolique des cellules épithéliales cornéennes humaines après exposition à la dessiccation

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