Name: effect of artificial tear formulations on the metabolic activity of human corneal epithelial cells after exposure to desiccation
Uploaded: 2020-05-02T13:00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Effect of Artificial Tear Formulations on the Metabolic Activity of Human Corneal Epithelial Cells after Exposure to Desiccation at JoVE.com

Los autores agradecen a Alcon por proporcionar apoyo financiero para estos estudios.

1. Cultivo celular epitelial corneal humano
<ol><li>Crecer inmortalizado HCEC19 en frascos recubiertos de colágeno de 75 cm2 con 20 mL de la mezcla modificada de medio/nutrientes Eagle de Dulbecco F-12 (DMEM/F12) que contiene un 10% de suero fetal bovino (FBS) y un 1% de penicilina/estreptomicina a 37 °C con un 5% de CO2. NOTA: No es necesario agitar.</li>
	<li>Cambie los medios cada 2-3 días.</li>
</ol>2. Preparación de células para pruebas
<ol><li>Después de que las células son casi confluentes eliminar los medios de cultivo.</li>
	<li>Añadir 4−6 mL de solución de disociación celular a cada 75 cm2 matraces. Incubar las células a 37 °C hasta que las células se desprencien (aproximadamente 20−30 min), comprobando bajo el microscopio periódicamente.</li>
	<li>Añadir 2−6 ml de DMEM/F12 que contengan un 10% de FBS a cada matraz de 75 cm2.</li>
	<li>Transfiera el contenido del matraz a un tubo centrífugo de 50 ml.</li>
	<li>Centrifugar las células a 450−500 x g durante 5 min. Pipetear el sobrenadante y resuspensar las células en medios precalentados.</li>
	<li>Cuente las células usando un hemocytometer. Calcular el volumen de medios que contiene un total de 1 x 105 celdas.</li>
	<li>Agregue 1 x 105 células a cada pocillo de una placa de cultivo recubierta de colágeno-1 de 48 pocillos. Agregue suficientes medios al pozo para que el volumen final de medios en el pozo sea de 0.5 mL de cultivo DMEM/ F12 con 10% de FBS. NOTA: Una formulación artificial del rasgón puede causar la citotoxicidad que se puede medir por una disminución de la actividad metabólica de HCEC. La consistencia de los datos depende de la adición del mismo número de HCEC a cada pozo al sembrar. La concentración de cultivo que se recomienda para placas de 48 pozos es de 1 x 105. Debido a que las células de mamíferos pueden asentarse en el tubo de la centrífuga después de reenviar, se recomienda resuspend las células por agitación con frecuencia mientras se siembran las placas con células para que la suspensión celular tenga el HCEC igualmente distribuido.</li>
	<li>Incubar las células a 37 °C y al 5% deCO2 durante 24 h.</li>
</ol>3. Sin protocolo de desecación
<ol><li>Procedimiento de control<ol>
<li>Después de la incubación de 24 h retire el medio de cultivo de la placa.</li>
		<li>Tratar inmediatamente con 150 μL de una formulación de ensayo y solución de control de medios.</li>
		<li>Incubar las células a 37 °C y 5% deCO2 durante 30 min.</li>
		<li>Retire las soluciones de prueba de las células.</li>
		<li>Añadir 0,5 mL de solución de colorante metabólico al 10% para comprobar la actividad metabólica. Incubar las células durante otras 4 h a 37 °C y 5% deCO2.</li>
		<li>Después del período de incubación de 4 h, retire 100 μL de solución de colorante metabólico de cada pozo y coloque cada 100 μL en un pozo de una placa de 96 pozos.</li>
		<li>Mida la fluorescencia de cada pozo utilizando un lector de placas fluorescentes(Tabla de Materiales). Establezca la longitud de onda de excitación en 540 nm y la longitud de onda de emisión en 590 nm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sin protocolo de desecación (procedimiento de recuperación)<ol>
<li>Repita los pasos 3.1.1−3.1.4.</li>
		<li>Agregue 0,5 mL de medios DMEM/F12 a cada pozo.</li>
		<li>Incubar un conjunto de cultivos durante 18 h a 37 °C y 5% deCO2.</li>
		<li>Retire el medio y agregue 0.5 mL de solución de tinte metabólico al 10%. Repita los pasos 3.1.6 y 3.1.7.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Protocolo de desecación
<ol><li>Procedimiento de control<ol>
<li>Después de la incubación de 24 h (paso 2.8), retire el medio de cultivo de la placa.</li>
		<li>Tratar inmediatamente con 150 μL de una formulación de ensayo y solución de control de medios.</li>
		<li>Incubar las células a 37 °C y 5% deCO2 durante 30 min.</li>
		<li>Retire las soluciones de prueba de las células.</li>
		<li>Coloque las células en una cámara de 37 °C y 45% HR durante 5 minutos para desecar las células.</li>
		<li>Añadir 0,5 mL de solución de colorante metabólico al 10% para probar la actividad metabólica. Incubar las células durante otras 4 h a 37 °C y 5% deCO2.</li>
		<li>Después del período de incubación de 4 h, retire 100 μL de solución de colorante metabólico de cada pozo y coloque cada 100 μL en un pozo de una placa de 96 pozos.</li>
		<li>Mida la fluorescencia de cada pozo utilizando un lector de placas fluorescentes. Establezca la longitud de onda de excitación en 540 nm y la longitud de onda de emisión en 590 nm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Procedimiento de recuperación<ol>
<li>Repita los pasos 4.1.1-4.1.5.</li>
		<li>Agregue 0,5 mL de medios DMEM/F12 a cada pozo.</li>
		<li>Incubar un conjunto de cultivos durante 18 h a 37 °C y 5% deCO2.</li>
		<li>Retire el medio y agregue 0.5 mL de solución de tinte metabólico al 10%. Repita los pasos 4.1.7 y 4.1.8.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Análisis de datos
<ol><li>Calcular la fluorescencia media del control de medios. Calcule el porcentaje de viabilidad de la muestra utilizando la siguiente fórmula: Porcentaje de viabilidad de la muestra = fluorescencia de la muestra de prueba/fluorescencia de control de medios x 100 NOTA: El promedio de control de medios es 100% de viabilidad. El tinte metabólico por sí mismo tiene una pequeña cantidad de fluorescencia asociada con él. La fluorescencia del reactivo de colorante metabólico se puede restar de la fluorescencia de la muestra de control y de prueba antes de calcular el % de viabilidad de las muestras de prueba para el control de medios.</li>
	<li>Realice una prueba de normalidad y una prueba para varianzas iguales en las muestras de control y prueba.</li>
	<li>Si la prueba de normalidad pasa y las varianzas son iguales, realice un ANOVA unidireccional. Para identificar diferencias significativas entre grupos específicos, realice una prueba post hoc de comparaciones por pares (es decir, pruebas de comparaciones múltiples de Tukey o Dunnett).</li>
	<li>Si la prueba de normalidad pasa y las varianzas son diferentes, realice el ANOVA de Welch. Para identificar diferencias significativas entre grupos específicos, realice una prueba post hoc de comparaciones por pares (es decir, pruebas de comparaciones múltiples de Dunnett o Games-Howell).</li>
	<li>Si la prueba de normalidad falla, utilice una prueba no paramétrica (es decir, la prueba de Kruskal-Wallis). Para identificar las diferencias significativas entre grupos específicos, realice una prueba post hoc de comparaciones por pares (es decir, la prueba de Dunn).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Xu, M., Sivak, J. G., McCanna, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+effects+of+ophthalmic+solutions+on+human+corneal+epithelial+cells+using+fluorescent+dyes.">Comparison of the effects of ophthalmic solutions on human corneal epithelial cells using fluorescent dyes.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 29 (9), 794-802 (2013).</li><li>Maurer, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+measurement+of+acute+corneal+injury+in+rabbits+with+surfactants+of+different+type+and+irritancy.">Quantitative measurement of acute corneal injury in rabbits with surfactants of different type and irritancy.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 158 (1), 61-70 (1999).</li><li>Xu, M. L., McCanna, D. J., Sivak, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+viability+reagent+PrestoBlue+in+comparison+with+alamarBlue+and+MTT+to+assess+the+viability+of+human+corneal+epithelial+cells.">Use of the viability reagent PrestoBlue in comparison with alamarBlue and MTT to assess the viability of human corneal epithelial cells.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 71, 1-7 (2015).</li><li>Slaughter, M. R., Bugelski, P. J., O'Brien, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+alamar+blue+reduction+for+the+in+vitro+assay+of+hepatocyte+toxicity.">Evaluation of alamar blue reduction for the in vitro assay of hepatocyte toxicity.</a> Toxicology in Vitro. 13 (4-5), 567-569 (1999).</li><li>Hakkarainen, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+cytotoxic+effects+of+marketed+ophthalmic+formulations+on+human+corneal+epithelial+cells.">Acute cytotoxic effects of marketed ophthalmic formulations on human corneal epithelial cells.</a> International Journal of Pharmaceutics. 511 (1), 73-78 (2016).</li><li>Paulsen, K., Maile, S., Giebel, J., Tost, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lubricating+agents+differ+in+their+protection+of+cultured+human+epithelial+cells+against+desiccation.">Lubricating agents differ in their protection of cultured human epithelial cells against desiccation.</a> Medical Science Monitor. 14 (6), 12-16 (2008).</li><li>Tost, F., Keiss, R., Grossjohann, R., Jurgens, C., Giebel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+different+artificial+tears+against+desiccation+in+cultured+human+epithelial+cells.">Effect of different artificial tears against desiccation in cultured human epithelial cells.</a> Medical Science Monitor. 18 (5), 188-192 (2012).</li><li>Ubels, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-clinical+investigation+of+the+efficacy+of+an+artificial+tear+solution+containing+hydroxypropyl-guar+as+a+gelling+agent.">Pre-clinical investigation of the efficacy of an artificial tear solution containing hydroxypropyl-guar as a gelling agent.</a> Current Eye Research. 28 (6), 437-444 (2004).</li><li>Hovakimyan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+protective+effects+of+trehalose+on+desiccation+of+epithelial+cells+in+three+dimensional+reconstructed+human+corneal+epithelium.">Evaluation of protective effects of trehalose on desiccation of epithelial cells in three dimensional reconstructed human corneal epithelium.</a> Current Eye Research. 37 (11), 982-989 (2012).</li><li>Zheng, X., Goto, T., Shiraishi, A., Ohashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+efficacy+of+ocular+surface+lubricants+against+dehydration.">In vitro efficacy of ocular surface lubricants against dehydration.</a> Cornea. 32 (9), 1260-1264 (2013).</li><li>Matsuo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trehalose+protects+corneal+epithelial+cells+from+death+by+drying.">Trehalose protects corneal epithelial cells from death by drying.</a> British Journal of Ophthalmology. 85 (5), 610-612 (2001).</li><li>Zheng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+activated+NLRP3+inflammasomes+initiate+inflammation+in+hyperosmolarity+stressed+human+corneal+epithelial+cells+and+environment-induced+dry+eye+patients.">Reactive oxygen species activated NLRP3 inflammasomes initiate inflammation in hyperosmolarity stressed human corneal epithelial cells and environment-induced dry eye patients.</a> Experimental Eye Research. 134, 133-140 (2015).</li><li>Hua, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+Effects+of+L-Carnitine+Against+Oxidative+Injury+by+Hyperosmolarity+in+Human+Corneal+Epithelial+Cells.">Protective Effects of L-Carnitine Against Oxidative Injury by Hyperosmolarity in Human Corneal Epithelial Cells.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 56 (9), 5503-5511 (2015).</li><li>Schulze, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trefoil+factor+family+peptide+3+(TFF3)+is+upregulated+under+experimental+conditions+similar+to+dry+eye+disease+and+supports+corneal+wound+healing+effects+in+vitro.">Trefoil factor family peptide 3 (TFF3) is upregulated under experimental conditions similar to dry eye disease and supports corneal wound healing effects in vitro.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 55 (5), 3037-3042 (2014).</li><li>Giaconia, C., Orioli, A., Di Gangi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Air+quality+and+relative+humidity+in+commercial+aircrafts:+An+experimental+investigation+on+short-haul+domestic+flights.">Air quality and relative humidity in commercial aircrafts: An experimental investigation on short-haul domestic flights.</a> Building and Environment. 67, 69-81 (2013).</li><li>van Setten, G., Labetoulle, M., Baudouin, C., Rolando, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+seasonality+and+effects+of+psychrometry+in+dry+eye+disease.">Evidence of seasonality and effects of psychrometry in dry eye disease.</a> Acta Ophthalmologica. 94 (5), 499-506 (2016).</li><li>Valtink, M., Donath, P., Engelmann, K., Knels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+different+culture+media+and+deswelling+agents+on+survival+of+human+corneal+endothelial+and+epithelial+cells+in+vitro.">Effect of different culture media and deswelling agents on survival of human corneal endothelial and epithelial cells in vitro.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 254 (2), 285-295 (2016).</li><li>Zachari, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+Alamarblue+Assay+for+Adherent+Cell+Irradiation+Experiments.">Evaluation of the Alamarblue Assay for Adherent Cell Irradiation Experiments.</a> Dose-Response. 12 (2), 246-258 (2014).</li><li>Griffith, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+human+corneal+equivalents+constructed+from+cell+lines.">Functional human corneal equivalents constructed from cell lines.</a> Science. 286 (5447), 2169-2172 (1999).</li><li>Benelli, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systane+lubricant+eye+drops+in+the+management+of+ocular+dryness.">Systane lubricant eye drops in the management of ocular dryness.</a> Clinical Ophthalmology. 5, 783-790 (2011).</li><li>Davis, R. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+surface+temperature:+a+review.">Ocular surface temperature: a review.</a> Eye &amp; Contact Lens. 31 (3), 117-123 (2005).</li><li>Stepanenko, A. A., Dmitrenko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pitfalls+of+the+MTT+assay:+Direct+and+off-target+effects+of+inhibitors+can+result+in+over/underestimation+of+cell+viability.">Pitfalls of the MTT assay: Direct and off-target effects of inhibitors can result in over/underestimation of cell viability.</a> Gene. 574 (2), 193-203 (2015).</li><li>Stockert, J. C., Horobin, R. W., Colombo, L. 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Tres autores (Rekha Rangarajan, Howard A. Ketelson, Lakshman Subbaraman) son empleados de Alcon. Alcon es la única fuente de financiación y patrocinador de este proyecto. Lyndon W. Jones, en los últimos 3 años, ha recibido apoyo de investigación o honorarios de cátedra de las siguientes compañías: Alcon, Allergan, Contamac, CooperVision, GL Chemtec, Inflamax Research, J&J Vision, Menicon, Nature's Way, Novartis, PS Therapy, Santen, Shire, SightGlass y Visioneering. Lyndon Jones también es consultor y/o forma parte de un consejo asesor de Alcon, CooperVision, J&J Vision, Novartis y Ophtecs. La siguiente lista de autores no tiene nada que revelar: Richard Do, David J. McCanna, Adeline Suko, Daryl Enstone, Jaya Dantam.

Este protocolo está diseñado para determinar los efectos protectores de las soluciones de lágrima artificiales contra la desecación celular. Inicialmente, las células se exponen a las gotas secas para los ojos para recubrir las células. A continuación, las células se secan y se controla la actividad metabólica para evaluar si las formulaciones pueden mitigar los efectos perjudiciales del estrés por desecación. Estos pasos son críticos para entender el impacto total que las formulaciones del ojo seco podrían tener en la viabilidad total de células epiteliales córneas.
Después de que la mayoría de las formulaciones de ojo seco se eliminan de los pozos de cultivo, la química de las moléculas restantes que están en contacto con las células afectará la desecación celular. Algunos productos contienen microemulsiones de aceites que minimizan la evaporación celular20. Un estudio que evaluó el análisis de fricción después del enjuague mostró mantenimiento de baja fricción para algunas formulaciones de ojo seco que pueden ser un indicador del tiempo de residencia mejorado de las formulaciones de ojo seco21. Una de las limitaciones de este ensayo es que aunque la protección contra la desecación se puede evaluar en comparación con otras formulaciones de gotas para los ojos, la duración de esta protección no se puede determinar debido al corto tiempo de secado evaluado. Los tiempos de secado más largos en este ensayo in vitro pueden requerir el uso de cultivos multicapa que tienen en general más contenido de humedad que una monocapa celular.
Los tiempos de incubación específicos para las formulaciones en las células y la duración del tiempo de secado pueden necesitar ser ajustados si se cambian los valores de temperatura y humedad. La selección de una temperatura, rh y flujo de aire para simular las condiciones de estrés ambiental que pueden contribuir al ojo seco puede ser difícil, ya que las condiciones ambientales estacionales y locales son bastante variables21. Las cámaras ambientales modernas para estudios en humanos pueden variar la temperatura entre 5 °C y 35 °C, y rh entre 5% y 95%22. Usando un evaporímetro y gafas bien ajustadas se determinó que a un RH de 40−45% la tasa de evaporación de la córnea era de 0,037 μL/cm2/miny a un RH de 20−25% la tasa de evaporación era de 0,065 μL/cm2/min23. Si el modelo in vitro está analizando el efecto protector de formulaciones en condiciones de RH extremadamente bajas, como en aviones15,desiertos o ambientes interiores secos16,los tiempos de incubación pueden necesitar ser reducidos para acomodar las tasas de evaporación mejoradas de las células. En el líquido lagrimal humano, una variedad de lípidos derivados de meibomio y otras glándulas están presentes que protegen las lágrimas de la evaporación. Estos lípidos tienen diferentes puntos de fusión24. Los cambios de temperatura podrían afectar la fluidez del líquido lagrimal, por lo que las pruebas realizadas a temperatura ambiente podrían tener tasas de evaporación significativamente diferentes a las realizadas a 37 °C. Dado que el rango de temperatura media de la superficie ocular es de 32,9 a 36 °C25,se recomienda realizar el ensayo cerca de este rango de temperatura.
Además del colorante metabólico (alamarBlue) utilizado en este protocolo, existen otros reactivos químicos que se pueden utilizar para evaluar los efectos de las formulaciones de productos sobre la actividad metabólica celular. Las sales de tetrazolio (MTT, XTT, MTS, WST) son productos químicos alternativos que se pueden utilizar. La diferencia en las sales de tetrazolio es que el MTT es una molécula cargada positivamente por lo que puede entrar en el citoplasma de las células vivas26. MTT llega a ser insoluble después de su reducción por NAD(P)H27. Debe solubilizarse antes de la absorbancia de lectura en un lector de placas. Las otras sales de tetrazolio tienen una carganegativa 28. Deben ser reducidas por moléculas secundarias fuera de la célula viva porque no pueden entrar en la célula e interactuar directamente con las moléculas intracelulares29. Para los ensayos XTT, MTS y WST-1, la adición de un agente de acoplamiento de electrones 1-metosulfato de metanostiazina (PMS) puede mejorar el rendimiento de los ensayos30. En contraste con los ensayos metabólicos que utilizan sales de tetrazolio, alamarBlue no requiere un solubilizante adicional o agentes de acoplamiento de electrones. Además, a diferencia de XTT, MTS o WST-1, alamarBlue penetra en las membranas celulares y puede ser reducido directamente por las enzimas celulares27,29. La comparación directa de alamarBlue con sales de tetrazolio ha demostrado que alamarBlue es más sensible para evaluar la actividad metabólica de varias líneas celulares, incluyendo HCEC3,27,31,32.
Otros puntos finales bioquímicos se pueden también considerar para evaluar la protección de células epiteliales córneas humanas por la desecación. Los tintes fluorescentes se pueden utilizar para detectar la permeabilidad de la membrana celular y la actividad de la esterasa celular1. También, el apoptosis se puede detectar manchando para los marcadores apoptotic en la superficie de la célula o midiendo para la actividad de la caspasa1,33. Otros ensayos han determinado los efectos de los productos oftálmicos sobre las uniones estrechas de HCEC34. Estos ensayos podrían incorporarse en futuras evaluaciones utilizando los procedimientos de desecación descritos en este artículo.
Hay muchas causas del ojo seco. El ojo seco puede ser causado por la disminución de la secreción de lágrimas, el aumento de la inflamación de la superficie ocular o el aumento de la deshidratación en la superficie ocular. Para los individuos que tienen ojo seco evaporativo, el uso de una gota para el ojo seco que impide que sus células se sequen durante las condiciones de desecación puede aliviar los síntomas del ojo seco. Uno de los problemas en algunas formulaciones de ojo seco es la presencia de conservantes que pueden dañar la superficie ocular. Lesionar las células no es útil para los pacientes con ojo seco, ya que puede causar que mueran más células, ya que las células lesionadas son más susceptibles al estrés por desecación35.
Un artículo de revisión reciente de Garrigue et al.36 proporciona una evaluación del conocimiento actual de cómo actúan los productos a base de lípidos para aliviar el ojo seco evaporativo. La adición de lípidos a los desgarros deficientes en lípidos puede prevenir la evaporación, protegiendo así las células de la desecación. Además, los humectantes son moléculas que atraen y retienen el agua en la superficie ocular37. Tanto la glicerina en solución #1 como el propilenglicol en solución #3 son humectantes. La solución #3 mostró un mayor efecto protector del HCEC que pudo haber sido debido a las propiedades lipídicas y humectantes de los ingredientes de la formulación.
Este protocolo está diseñado para evaluar la actividad metabólica de HCEC después de la exposición a las formulaciones de ojo seco y al estrés de desecación. Mediante el uso de los métodos descritos en este artículo, se pueden desarrollar nuevas gotas para los ojos no irritantes y protectoras para las personas que sufren de ojo seco evaporativo.

Se necesitan muchos ingredientes diferentes en soluciones oftálmicas de dosis múltiples para mantener la estabilidad, el pH, la osmolaridad y la eficacia. Sin embargo, algunos productos químicos como conservantes o tensioactivos en soluciones oculares pueden causar daño al epitelio corneal1,2. Las pruebas de viabilidad celular usando células epiteliales corneales humanas (HCEC) se pueden realizar para evaluar el daño potencial causado por estos diversos ingredientes en formulaciones oftálmicas. Uno de los ensayos in vitro que es particularmente útil para evaluar el daño celular es el ensayo alamarBlue3. En este ensayo, el colorante metabólico (es decir, alamarBlue) contiene resazurón, que funciona como un indicador de viabilidad celular. Durante la respiración celular, la resazurina se reduce a resorufina mediante la aceptación de electrones4. La reducción de la resorufina provoca un cambio de una molécula no fluorescente a una molécula fluorescente que puede ser detectada utilizando un espectrómetro5.
Esta investigación utiliza dos diversos tratamientos de las células epiteliales córneas para determinar cómo los productos secos del ojo pueden realizar en un modelo in vitro. En la primera evaluación, las células se tratan con estos productos durante 30 min. Después del tratamiento, las células se evalúan para la actividad metabólica inmediatamente después de la exposición a los productos del ojo seco y después de un intervalo de tiempo de recuperación. Esta evaluación determina el efecto de estos productos en las células antes de la desecación en una cámara de humedad. Los conservantes de la solución, los tensioactivos o los tampones en estas soluciones pueden tener algunos efectos citotóxicos en las células que se pueden detectar usando el tinte metabólico.
La segunda evaluación determina la actividad metabólica de las células después de la exposición a los productos del ojo seco y la desecación. En esta evaluación, si el tratamiento del producto ofrece protección a las células contra el daño por desecación, se mantendrá la actividad metabólica de las células. La protección celular contra los efectos dañinos de la desecación puede ocurrir si el producto del ojo seco puede recubrir las células con lípidos o el producto puede absorber líquido de los alrededores agregando humedad a las células.
Este protocolo está diseñado para simular condiciones severas de estrés ambiental en las células. Otros estudios han utilizado varios modelos para crear este estrés externo. Algunos estudios han secado las células en campanas de flujo laminar6,7,8,mientras que otros han utilizado la temperatura ambiente y diversos valores de humedad relativa (RH)9,10,11. Un método para simular condiciones de ojo seco es aumentar la osmolaridad de la solución de incubación12,13. Otro método in vitro para simular condiciones ambientales adversas es agregar citoquinas al medio celular para simular el líquido lagrimal de los pacientes con ojo seco14. Aunque estas pruebas son modelos interesantes que pueden evaluar cómo las sustancias químicas reducen el estrés osmótico o estimulan el sistema inmunológico, estos modelos no muestran directamente cómo las formulaciones químicas pueden proteger las células del estrés por desecación.
El modelo de desecación utiliza una cámara de temperatura/humedad de 37 °C y 45% de RH. Simula condiciones ambientales que pueden causar evaporación de la superficie ocular. También se pueden realizar simulaciones de otras condiciones ambientales extremas como la baja humedad encontrada en las cabinas de los aviones15 o en ambientes interiores durante los meses de invierno16.
El modelado de cultivos celulares se utiliza para simular el efecto del estrés de la desecación en la córnea humana. Con el fin de detectar el estrés celular, se realizan pruebas de viabilidad celular para determinar el impacto en la salud celular. Se pueden realizar varias pruebas fisiológicas diferentes en las células para determinar si están estresadas17. El análisis realizado en este procedimiento de ensayo utiliza el colorante metabólico disponible comercialmente(Tabla de Materiales). Tiene la ventaja sobre muchas otras pruebas de esfuerzo celular en el hecho de que no es tóxico, soluble en medios de crecimiento y puede evaluar las células sin fijación celular18. En este procedimiento las células se prueban para la actividad metabólica inmediatamente después de cada tratamiento y un segundo sistema de células se coloca de nuevo en medios de crecimiento y se evalúa después de la recuperación de 18 h. La razón para la prueba inmediatamente y después de un período de recuperación es identificar el daño celular que causa efectos inmediatos sobre la actividad metabólica y el daño celular que causa efectos retardados. Además, proporciona una oportunidad para evaluar el impacto de estas formulaciones en el daño a corto plazo frente a largo plazo y la capacidad de las formulaciones para recuperarse / no recuperarse del insulto inicial.
Esta investigación se utiliza para comparar varios productos lípido-que contienen del ojo seco para su efecto sobre actividad metabólica de HCEC con y sin la desecación. Los ingredientes de los productos de ojo seco probados se describen en la Tabla de materiales. Los ingredientes en solución #1 son carboximetilcelulosa sódica (0.5%), glicerina (1%), y polisorbato 80 (0.5%), en solución #2 son aceite mineral ligero (1.0%) y aceite mineral (4,5%), y en solución #3 el lípido es aceite mineral y propilenglicol es el demulcente. Estos lípidos son los componentes de la formulación que se espera que proporcionen la protección del HCEC contra la desecación.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>75 cm2 Vented Flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354485</td>
			<td>This is the BioCoat brand collagen coated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>costar</td>
			<td>3370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alamarBlue</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>dal 1025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 48 Well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354505</td>
			<td>This is the BioCoat brand collagen coated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 5</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>CYT5MPV</td>
			<td>Can read fluorescence from 280 - 700 nm (for assay 540/590)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 with L-glutamine and 15 mM HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11039-021</td>
			<td>There is No Phenol Red in this media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hycone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Corneal Epithelial Cells</td>
			<td>University of Ottawa</td>
			<td>N/A</td>
			<td>SV40-immortalized human corneal epithelial cells from Dr. M. Griffith (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Canada) and have been characterized Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 1999;286:2169&#8211;72.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity/Temperature Chamber</td>
			<td>Associated Environmental Systems</td>
			<td>LH-1.5</td>
			<td>Economy Line Humidity Chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>100X concentration so add 1ml to each 99ml of media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refresh Optive Advanced (solution #1)</td>
			<td>Allergan, Inc</td>
			<td></td>
			<td>Carboxymethylcellulose Sodium (0.5%),Glycerin (1%),polysorbate 80 (0.5%),-Lubricants- Inactive ingredients-boric acid; carbomer copolymer type A; castor oil; erythritol; levocarnitine; purified water; Purite (stablized oxychloro complex)and may contain sodium hydroxide to adjust pH.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soothe XP (solution #2)</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb</td>
			<td></td>
			<td>Light mineral oil (1.0%), Mineral Oil (4.5%)-emolients-Inactive ingredients-boric acid, edetate disodium, octoxynol-40, polyquaternium-1 (preservative), polysorbate 80, purified water, sodium borate decahydrate. May contain hydrochloric acid and/or sodium hydroxide (to adjust pH).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Systane Complete (solution #3)</td>
			<td>Alcon Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Propylene Glycol 0.6% Lubricant Inactive ingredients- boric acid, dimyristoyl phosphatidylglycerol, edatate disodium, hydroxypropyl guar, mineral oil, polyoxl 40 stearate, POLYQUAD&#174; (polyquaternium-1) 0.001% preservative, sorbitan tristearate, sorbitol and purified water. May contain hydrochloric acid and/or sodium hydroxide to adjust pH.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express (cell disassociation solution)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/12605036" target="_blank">12605036</a></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

effect of artificial tear formulations on the metabolic activity of human corneal epithelial cells after exposure to desiccation

Las formulaciones artificiales del rasgón lípido-que contienen son desarrolladas para reducir la evaporación del rasgón por la restauración de una capa deficiente del lípido del rasgón. Las formulaciones artificiales del rasgón que previenen la desecación de la célula darán lugar a la protección superficial ocular y al mantenimiento de la actividad metabólica de la célula. Durante la deshidratación, las células experimentan el proceso de pérdida de actividad metabólica y posteriormente la muerte celular. Este trabajo describe un método para evaluar la eficacia de las formulaciones artificiales del rasgón. El tinte metabólico (es decir, alamarBlue) cambia de una molécula fluorescente baja resazurina a una molécula fluorescente resorufina en células viables. El rendimiento biológico de una formulación de lágrima artificial se mide como la capacidad de la formulación para (a) mantener la viabilidad celular y (b) proporcionar protección celular contra la desecación. Los medios de crecimiento y solución salina se utilizan como controles para las pruebas de viabilidad/desecación celular. Las células se incuban con soluciones de ensayo durante 30 min y luego se desecan durante 0 o 5 min a 37 °C y 45% de humedad relativa. La actividad metabólica de la célula después de la exposición inicial y después de la desecación de la célula entonces se determina. Los resultados muestran los efectos comparativos de las formulaciones de gotas para los ojos sobre la actividad metabólica celular y la protección contra la desecación. Este método se puede utilizar para probar formulaciones de ojo seco que están diseñadas para tratar a individuos con ojo seco evaporativo.

Los resultados de un estudio que compara tres formulaciones de ojo seco se muestran en la Figura 1. Esta figura muestra que existen diferencias en el efecto que los tres productos, la solución #1, la solución #2 y la solución #3(Tabla de Materiales)tienen sobre la viabilidad de HCEC. La solución #1 y la solución #2 tuvieron un efecto significativo sobre la actividad metabólica de HCEC antes de la desecación. Esto significa que hay componentes de formulación en estos productos que pueden interrumpir la actividad metabólica del HCEC. La caída adicional en la actividad metabólica de la célula que ocurrió después de la recuperación de 18 h de las células expuestas a la solución #1 muestra que HCEC fue dañado inicialmente y después de 18 h lesión no fue reparada. En comparación, la solución #3 sólo tuvo un efecto leve sobre la actividad metabólica del HCEC.
La Figura 2 muestra el efecto de estas formulaciones de ojo seco que contienen lípidos sobre la protección celular. Con una actividad metabólica cercana al 0% de HCEC en el intervalo de recuperación de 18 h, la solución #1 y la solución #2 no protegieron las células contra el estrés por desecación. La solución #3, sin embargo, ofreció una cierta protección contra la tensión de la desecación.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60812/60812fig1.jpg"> Figura 1: Efecto de los productos mejorados con lípidos de ojo seco sobre la viabilidad celular. Viabilidad relativa medida por actividad metabólica de HCEC después del tratamiento con los productos lípido-que contienen del ojo seco. * = significación estadística (p < 0,05) relativa a la solución #3, Δ = significación estadística (p < 0,05) relativa al control de medios para el período de recuperación apropiado. La altura de la barra representa el valor medio, y las barras de error son la SD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60812/60812fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60812/60812fig2.jpg"> Figura 2: Efecto de los productos mejorados con lípidos de ojo seco sobre la protección contra la desecación. Efecto de las formulaciones lípido-que contienen del ojo seco sobre la protección de la célula. La solución #1 y la solución #2 no protegieron a las células contra el estrés por desecación, y no se recuperaron de los efectos de la desecación con el tiempo. En cambio, la solución #3 ofreció una cierta protección contra la tensión de la desecación. * = p < 0,05 en relación con la solución #3, y Δ = p < 0,05 en relación con los medios no tratados (control) para el tiempo de recuperación adecuado. La altura de la barra representa el valor medio, y las barras de error son la SD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60812/60812fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Effect of Artificial Tear Formulations on the Metabolic Activity of Human Corneal Epithelial Cells after Exposure to Desiccation

El propósito de este protocolo es evaluar si diversas formulaciones artificiales del rasgón pueden proteger las células epiteliales córneas humanas contra la desecación usando un modelo in vitro. Después de la exposición a formulaciones artificiales del rasgón y a la desecación, las células epiteliales córneas humanas se evalúan para la actividad metabólica.

Efecto De Las Formulaciones Artificiales De Lágrima En La Actividad Metabólica De Las Células Epiteliales Corneales Humanas Después De La Exposición A La Desecación

Artificial lipid-containing tear formulations are developed to reduce tear evaporation by the restoration of a deficient tear lipid layer. Artificial tear ...

Research

JoVE Journal

Medicine

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