Name: visualization of estrogen receptors in colons of mice with tnbs-induced crohn's disease using immunofluorescence
Uploaded: 2020-03-12T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Estrogen Receptors in Colons of Mice with TNBS-Induced Crohn's Disease using Immunofluorescence at JoVE.com

وقد نُشر العمل بفضل الدعم المالي الذي تقدمه سلطات جامعة لودز: نائب رئيس الجامعة للبحث العلمي، ونائب رئيس الجامعة للتعاون الوطني والدولي، وعميد كلية البيولوجيا وحماية البيئة. تم دعم داميان جاسينك بمنح (2017/24/T/NZ5/00045 و 2015/17/N/NZ5/NZ5/00336) من المركز الوطني للعلوم، بولندا.

أجريت الدراسات على الحيوانات بموافقة اللجنة الأخلاقية المحلية (28/ŁB29/2016) وفقًا للتوجيه 2010/63/EU الصادر عن البرلمان الأوروبي ومجلس 22 سبتمبر 2010 والتوصيات المؤسسية.
1. TNBS الناجمة عن نموذج مورين من مرض كرون
ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول ذكور BALB/ C الفئران وزنها 25-28 غرا?...

<ol>
	<li>Zhang, Y. Z., Li, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+bowel+disease:+pathogenesis.">Inflammatory bowel disease: pathogenesis.</a> World Journal of Gastroenterology. 20 (1), 91-99 (2014).</li><li>Morris, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hapten-induced+model+of+chronic+inflammation+and+ulceration+in+the+rat+colon.">Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon.</a> Gastroenterology. 96 (3), 795-803 (1989).</li><li>Okayasu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+in+the+induction+of+reliable+experimental+acute+and+chronic+ulcerative+colitis+in+mice.">A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice.</a> Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).</li><li>Boirivant, M., Fuss, I. J., Chu, A., Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxazolone+colitis:+a+murine+model+of+T+helper+cell+type+2+colitis+treatable+with+antibodies+to+interleukin+4.">Oxazolone colitis: a murine model of T helper cell type 2 colitis treatable with antibodies to interleukin 4.</a> Journal of Experimental Medicine. 188 (10), 1929-1939 (1998).</li><li>Morrissey, P. J., Charrier, K., Braddy, S., Liggitt, D., Watson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4++T+cells+that+express+high+levels+of+CD45RB+induce+wasting+disease+when+transferred+into+congenic+severe+combined+immunodeficient+mice.+Disease+development+is+prevented+by+cotransfer+of+purified+CD4++T+cells.">CD4+ T cells that express high levels of CD45RB induce wasting disease when transferred into congenic severe combined immunodeficient mice. Disease development is prevented by cotransfer of purified CD4+ T cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 178 (1), 237-244 (1993).</li><li>K&#252;hn, R., L&#246;hler, J., Rennick, D., Rajewsky, K., M&#252;ller, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-10-deficient+mice+develop+chronic+enterocolitis.">Interleukin-10-deficient mice develop chronic enterocolitis.</a> Cell. 75 (2), 263-274 (1993).</li><li>Sundberg, J. P., Elson, C. O., Bedigian, H., Birkenmeier, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous,+heritable+colitis+in+a+new+substrain+of+C3H/HeJ+mice.">Spontaneous, heritable colitis in a new substrain of C3H/HeJ mice.</a> Gastroenterology. 107 (6), 1726-1735 (1994).</li><li>Harnish, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beneficial+effects+of+estrogen+treatment+in+the+HLA-B27+transgenic+rat+model+of+inflammatory+bowel+disease.">Beneficial effects of estrogen treatment in the HLA-B27 transgenic rat model of inflammatory bowel disease.</a> American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 286 (1), 118-125 (2004).</li><li>Pierdominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+estrogen+receptor+&#946;+expression+with+inflammatory+bowel+disease+activity.">Linking estrogen receptor &#946; expression with inflammatory bowel disease activity.</a> Oncotarget. 6 (38), 40443-40451 (2015).</li><li>W&#322;odarczyk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-coupled+receptor+30+(GPR30)+expression+pattern+in+inflammatory+bowel+disease+patients+suggests+its+key+role+in+the+inflammatory+process.+A+preliminary+study.">G protein-coupled receptor 30 (GPR30) expression pattern in inflammatory bowel disease patients suggests its key role in the inflammatory process. A preliminary study.</a> Journal of Gastrointestinal and Liver Diseases. 26 (1), 29-35 (2017).</li><li>Mohammad, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+receptor+&#945;+contributes+to+T+cell-mediated+autoimmune+inflammation+by+promoting+T+cell+activation+and+proliferation.">Estrogen receptor &#945; contributes to T cell-mediated autoimmune inflammation by promoting T cell activation and proliferation.</a> Science Signaling. 11 (526), eaap9415 (2018).</li><li>Jacenik, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-coupled+estrogen+receptor+mediates+anti-inflammatory+action+in+Crohn's+disease.">G protein-coupled estrogen receptor mediates anti-inflammatory action in Crohn's disease.</a> Scientific Reports. 9 (1), 6749 (2019).</li><li>Prossnitz, E. R., Barton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+G+protein-coupled+estrogen+receptor+GPER+in+health+and+disease.">The G protein-coupled estrogen receptor GPER in health and disease.</a> Nature Review Endocrinology. 7 (12), 715-726 (2011).</li><li>Ya&#351;ar, P., Ayaz, G., User, S. D., G&#252;p&#252;r, G., Muyan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+estrogen-estrogen+receptor+signaling.">Molecular mechanisms of estrogen-estrogen receptor signaling.</a> Reproductive Medicine and Biology. 16 (1), 4-20 (2016).</li><li>Pizarro, T. T., Arseneau, K. O., Bamias, G., Cominelli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+the+study+of+Crohn's+disease.">Mouse models for the study of Crohn's disease.</a> Trends in Molecular Medicine. 9 (5), 218-222 (2003).</li><li>Neurath, M. F., Fuss, I., Kelsall, B. L., St&#252;ber, E., Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+interleukin+12+abrogate+established+experimental+colitis+in+mice.">Antibodies to interleukin 12 abrogate established experimental colitis in mice.</a> Journal of Experimental Medicine. 182 (5), 1281-1290 (1995).</li><li>Ikeda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simvastatin+attenuates+trinitrobenzene+sulfonic+acid-induced+colitis,+but+not+oxazalone-induced+colitis.">Simvastatin attenuates trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis, but not oxazalone-induced colitis.</a> Digestive Diseases and Sciences. 53 (7), 1869-1875 (2007).</li><li>Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Elizabeth, J., Rao, U. K., Ranganathan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+physical+basics+of+routine+formaldehyde+fixation.">Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation.</a> Journal of Oral Maxillofacial Pathology. 16 (3), 400-405 (2012).</li></ol>

هناك العديد من النماذج الحيوانية لفحص الفيزيولوجيا المرضية IBD ، بما في ذلك النماذج الوراثية أو المناعية أو العفوية ، وكذلك النماذج المستحثة كيميائيًا15. ومن بين عدة أنواع من النماذج الحيوانية من التهاب القولون، النماذج المستحثة كيميائيا مثل النموذج الناجم عن TNBS الموصوفة في ه...

مرض كرون (CD) هو مرض التهاب الأمعاء (IBD) يتجلى التهاب الأمعاء المزمن. لا يفهم مسببات CD بشكل جيد ، ولكن هناك عدد قليل من العوامل الرئيسية التي يبدو أنها مسؤولة عن تطوير CD ، بما في ذلك ميكروبيوتا الأمعاء ، والعوامل الوراثية والبيئية ، مثل النظام الغذائي أو الإجهاد1. من أجل فهم أفضل لإمراض مرض كرون ، تم استخدام عدة نماذج من التهاب الأمعاء2،3،4،5،66،7., في هذه المقالة، نقدم النتائج التي تم الحصول عليها من 2,4,6-trinitrobenzene حمض السلفوين (TNBS) الناجمة عن نموذج المورين من CD.
وقد تم توثيق أن هرمون الاستروجين قادرة على تحوير التهاب الأمعاء المزمن8،9،10،11،12. النشاط البيولوجي لهرمون الاستروجين بوساطة مستقبلات الكونات ، من بينها مستقبلات الإستروجين النووية (ERs) ، أي ERα (جين ESR1)و ERα (جين ESR2)، وكذلك مستقبلات الإستروجين المقترنة بالبروتين G ، أي GPER (جين GPER1)، يشار إليها باسم ER13،14. هناك عدة طرق لتحديد مستوى مستقبلات هرمون الاستروجين، ولكن يمكن استخدام عدد قليل فقط لتصور لهم في الأمعاء.
الكيمياء المناعية (IHC) هي طريقة تستخدم على نطاق واسع في الدراسات السريرية والأساسية للكشف عن بعض المستضدات في الخلايا أو الأنسجة مع الأجسام المضادة المترافقة الفلوروكروم. يبدو أن الـ IHC طريقة مهمة في تصور بنية الأنسجة ، وكذلك في تحديد وتوطين بروتينات محددة ، والتي قد تكون حاسمة لفهم تطور التهاب القولون. هنا ، نقدم بروتوكولًا كاملًا ومصدقًا عليه للتصور المناعي الكيميائي لمستقبلات هرمون الاستروجين في الأمعاء باستخدام الفلورسينس المناعي.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Animals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/C mice</td>
			<td>University of Lodz</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62379-531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardboard block</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope - TCS SP8</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fully automated rotary microtome - RM2255</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J1800BMNT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated Paraffin Embedding Module - EG1150 H</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histological box</td>
			<td>Marfour</td>
			<td>LN.138747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic pen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z377821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory balance</td>
			<td>Radwag</td>
			<td>WL-104-0048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X software</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal mold</td>
			<td>Marfour</td>
			<td>CP.5105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile gauze</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile scissor</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile tweezer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue processor - TP1020</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2, 4, 6-trinitrobenzene sulfonic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>92822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiOC6 (3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>318426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DyLight 650 secondary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab96886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ER&#945; primary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab75635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ER&#946; primary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab3576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>396480111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>432173111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GPER primary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab39742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>575283421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxidase</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>885193111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane (forane)</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>1001936040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16210064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>39602012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petrie dish</td>
			<td>Nest Scientific</td>
			<td>705001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Physiological saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin (antibiotic)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifage Mountant with DAPI (glycerol-based liquid with DAPI)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Chempur</td>
			<td>WE/231-598-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>795780429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>853470115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>BA0860119</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of estrogen receptors in colons of mice with tnbs-induced crohn's disease using immunofluorescence

مرض كرون هو النوع الأكثر تشخيصا من مرض التهاب الأمعاء. التهاب مزمن النامية في الأمعاء يؤدي إلى اضطراب التمعم وتلف الغشاء المخاطي المعوي ويبدو أن يرتبط مع زيادة خطر التحول النيوبلاستيك القولون. تشير الأدلة المتراكمة إلى أن هرمون الاستروجين ومستقبلات الإستروجين لا تؤثر فقط على الأنسجة الحساسة للهرمون ، ولكن أيضًا على الأنسجة الأخرى التي لا ترتبط مباشرة بهرمون الاستروجين ، مثل الرئتين أو القولون. هنا، ونحن نصف بروتوكول لتلطيخ الفلور المناعي الناجح لمستقبلات هرمون الاستروجين في القولون التي تم الحصول عليها من نموذج مورين من مرض كرون الناجم عن TNBS. يتم توفير بروتوكول مفصل لتحريض مرض كرون في إعداد الفئران والأمعاء بالإضافة إلى إجراء مناعي خطوة بخطوة باستخدام أقسام الأمعاء المضمنة بالبارافين الثابتة. الأساليب الموصوفة ليست مفيدة فقط للكشف عن مستقبلات هرمون الاستروجين والاستروجين إشارة التحقيق في الجسم الحي ولكن يمكن أيضا أن تطبق على للبروتينات الأخرى التي قد تشارك في تطوير التهاب القولون.

خصائص تنظير القولون في الفئران مع مرض كرون الناجم عن TNBS تظهر الصور التمثيلية للنقطتين المأخوذة من التحكم والفئران المعالجة من TNBS في الشكل 2. في الفئران التي لديها نموذج TNBS الناجم عن مرض كرون ، يتم تقليل طول القولون بينما يتم زيادة عرض القولون....

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Estrogen Receptors in Colons of Mice with TNBS-Induced Crohn's Disease using Immunofluorescence at JoVE.com

Visualization of Estrogen Receptors in Colons of Mice with TNBS-Induced Crohn's Disease using Immunofluorescence

يقدم البروتوكول نموذج ًا كاملًا من المورين الناجم عن TNBS من مرض كرون وطرق تصور مستقبلات الإستروجين بواسطة الكيمياء المناعية باستخدام الفلورات المناعية لأقسام القولون الثابتة من formalin المضمنة في البارافين.

تصور مستقبلات هرمون الاستروجين في كولونات الفئران مع مرض كرون TNBS الناجم ة باستخدام الفلورسينالمناعي

Crohn&#39;s disease is the most diagnosed type of inflammatory bowel disease. Chronic inflammation developing in the intestine leads to peristalsis ...

تشير الأدلة المتزايدة إلى تأثير إشارات الإستروجين على الجزء القولوني من علم وظائف الأعضاء ، والكيمياء المناعية هي تقنية واعدة لتحديد مستقبلات الإستروجين في القولون وتتطور إلى التهاب القولون. نقدم بروتوكول كامل ومصادق عليه للتصور المناعي الكيميائي لمستقبلات الإستروجين في القولون، وذلك باستخدام الفلوروسين المناعي. جنبا إلى جنب مع Dr.Sylwia Michlewska من مختبر التصوير المجهري من جامعة لودز، وسوف نثبت الإجراء.ضع القولون في طبق بتري. قطع القولون إلى شظايا سنتيمتر واحد إلى اثنين. ضع كل جزء على اسفنجة في كاسيت النسيجي المسمى بشكل مناسب.ضع كاسيت يحتوي على جزء من القولون في 4٪ شبه شكلي. احتضان لمدة 24 ساعة على الأقل في أربع درجات مئوية. إعداد وبرمجة معالج الأنسجة لمدة ساعة واحدة من الحضانة في 50٪70٪90٪95٪و100٪ الإيثانول, الزيلين 100٪الإيثانول, والزيلين فقط, وكذلك لمدة ثلاث ساعات على الأقل من الحضانة في البارافين السائل.نقل جزء القولون إلى مربع النسيج. ضع الصندوق في معالج الأنسجة المبرمج مسبقًا وادير المعالج. بعد الحضانة في معالج الأنسجة إزالة القولون من مربع الأنسجة ووضع جزء القولون في قالب معدني، بحيث طرفي القولون في وضع مستقيم.ملء ثلث القالب مع البارافين السائل. ضع القالب في منطقة التبريد عند ناقص خمس درجات مئوية لبضع ثوان ثم حرك القالب إلى منطقة الاحترار عند 70 درجة مئوية. ثم ضع القالب في الجزء السفلي من مربع النسيج وتغطية جزء القولون بأكمله مع البارافين السائل.ضع القالب المعدني الذي يحتوي على شظية القولون والبارافين في منطقة التبريد لبضع دقائق. ثم إزالة العفن المعدني من القولون وكتلة البارافين. احتضان القولون وكتلة البارافين لمدة 24 ساعة على الأقل في أربع درجات مئوية.بعد الحضانة، وإزالة البارافين الزائد من كتلة. إدراج القولون وكتلة البارافين في microtome الروتاري مؤتمتة بالكامل. قطع شظية القولون إلى خمسة أقسام ميكرومتر.نقل قسم القولون واحد إلى حمام مائي، محمّى إلى 40 درجة مئوية. استخدم الشريحة الزجاجية المسماة لإزالة قسم القولون من حمام الماء واحتضان الشريحة الزجاجية في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة. أولاً، أزل البارافين عن طريق احتضان الشريحة الزجاجية باللون الزيلين لمدة خمس دقائق.كرر هذه الخطوة ثلاث مرات. ثم ضع الشريحة الزجاجية في خليط واحد إلى واحد من الزيلين والإيثانول بنسبة 100٪لمدة خمس دقائق. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات.استخدم سلسلة من تركيزات الإيثانول المتناقصة لإعادة هيدرات قسم القولون. اغمر الشريحة في الإيثانول لمدة خمس دقائق. كرر ثلاث مرات في كل تركيز قبل الانتقال إلى التركيز التالي.شطف الشريحة الزجاجية تحت الماء الجاري لمدة خمس دقائق. إعادة تسخين العازلة استرجاع المستضد إلى 95 إلى 98 درجة مئوية. ثم سخني الشريحة الزجاجية في محلول استرجاع المستضد المغلي لمدة 10 دقائق.لمنع هدر الكواشف، استخدم قلمًا مُهدّبًا لرسم دائرة حول قسم القولون. ثم، احتضان الشريحة لمدة 10 دقائق في محلول 3٪ من بيروكسيديز الهيدروجين والماء. اغسل الشريحة في محلول الغسيل لمدة خمس دقائق.ثم احتضان الشريحة في منع الحل لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. إزالة حل حجب وإضافة 20 إلى 50 ميكرولترات من الأجسام المضادة الأولية ضد E-R ألفا، E-R بيتا، أو G-P-E-R المخفف. احتضان الأجسام المضادة الأولية بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية في الظلام.إزالة حل الأجسام المضادة. اغسل الشريحة ثلاث مرات في محلول الغسيل لمدة خمس دقائق في كل مرة. بعد ذلك، أضف الأجسام المضادة الثانوية المخففة.احتضان الشريحة مع الأجسام المضادة الثانوية المقترنة مع صبغ لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. إزالة حل الأجسام المضادة الثانوية من الشريحة. اغسل الشريحة ثلاث مرات في محلول الغسيل لمدة خمس دقائق في كل مرة.إضافة الفلوروكرروم المخفف للتصور غشاء واحتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام. إزالة الحل وغسل الشريحة ثلاث مرات في محلول الغسيل لمدة خمس دقائق في كل مرة. إضافة بضع قطرات من الجلسرين المستندة إلى DAPI السائل، وهو fluorochrome لتصور نواة الخلية، مباشرة على قسم القولون.غطّيها بعناية بشريحة الغلاف. احتضان قسم القولون لمدة 24 ساعة على الأقل عند أربع درجات مئوية. تحليل قسم القولون تحت مجهر confocal يضم أهداف 20x أو 63x والغمر النفط.تم التحقق من خصوصية الأجسام المضادة المستخدمة في الدراسة باستخدام خلايا MCF-7. تمكين الأجسام المضادة مستقبلات هرمون الاستروجين الكشف عن مستقبلات الإستروجين النووية E-R ألفا وE-R بيتا، فضلا عن مستقبلات هرمون الاستروجين المرتبطة بالغشاء G-P-E-R. كما تم تنفيذ سيطرة سلبية في الخلايا التي MCF-7 كانت ملطخة فقط مع الأجسام المضادة الثانوية مترافق مع fluorochrome وسائل القائم على الجلسرين مع DAPI.تم العثور على إشارة قوية من السيتوبلازمية من ألفا E-R في أقسام القولون التي تم الحصول عليها من الفئران التحكم ومن الفئران مع مرض كرون الناجم عن TNBS. ومع ذلك، كان القولون فقط التي تم الحصول عليها من الفئران التحكم E-R ألفا مترجمة في سيتوبلازم خلية القبل. كشف المجهر Confocal أيضا توطين السيتوبلاسميك من بيتا E-R في أقسام القولون من كل من السيطرة والفئران المعالجة TNBS.وبالمثل، تم توثيق توطين السيتوبلازمي لـ G-P-E-R في أقسام القولون التي تم الحصول عليها من فئران التحكم والفئران المعالجة TNBS. تحديد الموضع الصحيح للقولون في القالب ضروري لتوليد المقطع المقطع العرضية الصحيح. وينبغي اختيار الفلوروكروم من خلال الإثارة الخاصة به وطيف الانبعاثات.ويمكن أيضا تطبيق هذه الطريقة على البروتينات الأخرى التي قد تشارك في تطوير التهاب القولون. يمكن تمديد الكشف المناعي للكيمياء عن طريق الفلورس المناعة إلى وصمة عار البروتينات الأخرى في حالة اتجاه البروتين البروتين.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

الآلي الصوتية الاستغناء عن التخفيف المسلسل من الببتيد ناهضات في الفعالية تحديد فحوصات

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

الكشف والتصور من المجمعات البروتين الناجم عن الأضرار الحمض النووي في الثقافات خلية تعليق باستخدام التقريب ربط القرب

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Simple Elimination of Background Fluorescence in Formalin-Fixed Human Brain Tissue for Immunofluorescence Microscopy

القضاء بسيطة من الأسفار الخلفية في أنسجة المخ البشري الفورمالين--الثابتة للفحص المجهري الفلورة

Immunofluorescence is a common method used to visualize subcellular compartments and to determine the localization of specific proteins within a tissue ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

وصف جليكوبروتينس مع حظيرة الغلوبولين المناعي علم البلورات بالأشعة السينية والتقنيات الفيزيائية الحيوية

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Identification of Orexin and Endocannabinoid Receptors in Adult Zebrafish Using Immunoperoxidase and Immunofluorescence Methods

تحديد مستقبلات أوريكسين وإندوكانابينويد في أسماك حمار وحشي للبالغين باستخدام المناعية وطريقة الفلور المناعي

Immunohistochemistry (IHC) is a highly sensitive and specific technique involved in the detection of target antigens in tissue sections with labeled ...

An In Vivo Estrogen Deficiency Mouse Model for Screening Exogenous Estrogen Treatments of Cardiovascular Dysfunction After Menopause

A في فيفيفو نقص الإستروجين نموذج الماوس لفحص علاجات الإستروجين الخارجية من خلل القلب والأوعية الدموية بعد انقطاع الطمث

Postmenopausal women are at greater risk of developing cardiovascular diseases than premenopausal women. Female mice ovariectomized (OVX) at weaning ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

التفاعلات مع وغشاء التغلغل من الميتوكوندريا الدماغ بواسطة ألياف الليفية اميلويد

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  ÃƒÅ½Ã‚Â² Reporter Assay

فحص Phytoestrogens باستخدام مستقبلات الاستروجين القائم على الخلية β مراسل Assay

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...

Transplantation of Neonatal Mouse Cardiac Macrophages into Adult Mice

زرع الضامة القلبية للفأر الوليدي في الفئران البالغة

In an injured neonatal myocardium, macrophages facilitate cardiomyocyte proliferation and angiogenesis and promote heart regeneration. The present study ...