Name: visualization of estrogen receptors in colons of mice with tnbs-induced crohn's disease using immunofluorescence
Uploaded: 2020-03-12T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Estrogen Receptors in Colons of Mice with TNBS-Induced Crohn's Disease using Immunofluorescence at JoVE.com

Arbejdet blev offentliggjort takket være den finansielle støtte fra University of Lodz myndigheder: Vicerektor for videnskabelig forskning, vicerektor for nationalt og internationalt samarbejde og dekanen for Fakultetet for Biologi og Miljøbeskyttelse. Damian Jacenik blev støttet af tilskud (2017/24/T/NZ5/00045 og 2015/17/N/NZ5/00336) fra National Science Centre, Polen.

Dyreforsøg blev gennemført med samtykke fra det lokale etiske udvalg (28/łB29/2016) i overensstemmelse med Europa-Parlamentets og Rådets direktiv 2010/63/EU af 22.
1. TNBS-induceret murine model af Crohns sygdom
BEMÆRK: Denne protokol bruger han-BALB/C-mus, der vejer 25-28 g. Dyr anbringes ved en konstant temperatur (22-24 °C) og relativ luftfugtighed 55 ± 5%, og holdes i en 12 timers lys/mørk cyklus med fri adgang til standard chow-pellets og postevand ad...

<ol>
	<li>Zhang, Y. Z., Li, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+bowel+disease:+pathogenesis.">Inflammatory bowel disease: pathogenesis.</a> World Journal of Gastroenterology. 20 (1), 91-99 (2014).</li><li>Morris, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hapten-induced+model+of+chronic+inflammation+and+ulceration+in+the+rat+colon.">Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon.</a> Gastroenterology. 96 (3), 795-803 (1989).</li><li>Okayasu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+in+the+induction+of+reliable+experimental+acute+and+chronic+ulcerative+colitis+in+mice.">A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice.</a> Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).</li><li>Boirivant, M., Fuss, I. J., Chu, A., Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxazolone+colitis:+a+murine+model+of+T+helper+cell+type+2+colitis+treatable+with+antibodies+to+interleukin+4.">Oxazolone colitis: a murine model of T helper cell type 2 colitis treatable with antibodies to interleukin 4.</a> Journal of Experimental Medicine. 188 (10), 1929-1939 (1998).</li><li>Morrissey, P. J., Charrier, K., Braddy, S., Liggitt, D., Watson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4++T+cells+that+express+high+levels+of+CD45RB+induce+wasting+disease+when+transferred+into+congenic+severe+combined+immunodeficient+mice.+Disease+development+is+prevented+by+cotransfer+of+purified+CD4++T+cells.">CD4+ T cells that express high levels of CD45RB induce wasting disease when transferred into congenic severe combined immunodeficient mice. Disease development is prevented by cotransfer of purified CD4+ T cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 178 (1), 237-244 (1993).</li><li>K&#252;hn, R., L&#246;hler, J., Rennick, D., Rajewsky, K., M&#252;ller, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-10-deficient+mice+develop+chronic+enterocolitis.">Interleukin-10-deficient mice develop chronic enterocolitis.</a> Cell. 75 (2), 263-274 (1993).</li><li>Sundberg, J. P., Elson, C. O., Bedigian, H., Birkenmeier, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous,+heritable+colitis+in+a+new+substrain+of+C3H/HeJ+mice.">Spontaneous, heritable colitis in a new substrain of C3H/HeJ mice.</a> Gastroenterology. 107 (6), 1726-1735 (1994).</li><li>Harnish, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beneficial+effects+of+estrogen+treatment+in+the+HLA-B27+transgenic+rat+model+of+inflammatory+bowel+disease.">Beneficial effects of estrogen treatment in the HLA-B27 transgenic rat model of inflammatory bowel disease.</a> American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 286 (1), 118-125 (2004).</li><li>Pierdominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+estrogen+receptor+&#946;+expression+with+inflammatory+bowel+disease+activity.">Linking estrogen receptor &#946; expression with inflammatory bowel disease activity.</a> Oncotarget. 6 (38), 40443-40451 (2015).</li><li>W&#322;odarczyk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-coupled+receptor+30+(GPR30)+expression+pattern+in+inflammatory+bowel+disease+patients+suggests+its+key+role+in+the+inflammatory+process.+A+preliminary+study.">G protein-coupled receptor 30 (GPR30) expression pattern in inflammatory bowel disease patients suggests its key role in the inflammatory process. A preliminary study.</a> Journal of Gastrointestinal and Liver Diseases. 26 (1), 29-35 (2017).</li><li>Mohammad, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+receptor+&#945;+contributes+to+T+cell-mediated+autoimmune+inflammation+by+promoting+T+cell+activation+and+proliferation.">Estrogen receptor &#945; contributes to T cell-mediated autoimmune inflammation by promoting T cell activation and proliferation.</a> Science Signaling. 11 (526), eaap9415 (2018).</li><li>Jacenik, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-coupled+estrogen+receptor+mediates+anti-inflammatory+action+in+Crohn's+disease.">G protein-coupled estrogen receptor mediates anti-inflammatory action in Crohn's disease.</a> Scientific Reports. 9 (1), 6749 (2019).</li><li>Prossnitz, E. R., Barton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+G+protein-coupled+estrogen+receptor+GPER+in+health+and+disease.">The G protein-coupled estrogen receptor GPER in health and disease.</a> Nature Review Endocrinology. 7 (12), 715-726 (2011).</li><li>Ya&#351;ar, P., Ayaz, G., User, S. D., G&#252;p&#252;r, G., Muyan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+estrogen-estrogen+receptor+signaling.">Molecular mechanisms of estrogen-estrogen receptor signaling.</a> Reproductive Medicine and Biology. 16 (1), 4-20 (2016).</li><li>Pizarro, T. T., Arseneau, K. O., Bamias, G., Cominelli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+the+study+of+Crohn's+disease.">Mouse models for the study of Crohn's disease.</a> Trends in Molecular Medicine. 9 (5), 218-222 (2003).</li><li>Neurath, M. F., Fuss, I., Kelsall, B. L., St&#252;ber, E., Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+interleukin+12+abrogate+established+experimental+colitis+in+mice.">Antibodies to interleukin 12 abrogate established experimental colitis in mice.</a> Journal of Experimental Medicine. 182 (5), 1281-1290 (1995).</li><li>Ikeda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simvastatin+attenuates+trinitrobenzene+sulfonic+acid-induced+colitis,+but+not+oxazalone-induced+colitis.">Simvastatin attenuates trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis, but not oxazalone-induced colitis.</a> Digestive Diseases and Sciences. 53 (7), 1869-1875 (2007).</li><li>Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Elizabeth, J., Rao, U. K., Ranganathan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+physical+basics+of+routine+formaldehyde+fixation.">Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation.</a> Journal of Oral Maxillofacial Pathology. 16 (3), 400-405 (2012).</li></ol>

Der er mange dyremodeller til IBD-patologiundersøgelse, herunder genetiske, immunologiske eller spontane modeller samt kemisk inducerede modeller15. Blandt de mange typer af dyremodeller af colitis, kemisk inducerede modeller såsom TNBS-induceret model, der er beskrevet i denne protokol, er relativt billige og nemme at opnå. Den TNBS-inducerede murine model af colitis har flere kliniske symptomer relateret til den patologiske grundlag af CD. Dyr med induceret colitis er karakteriseret ved inkon...

Crohns sygdom (CD) er en inflammatorisk tarmsygdom (IBD) manifesteret som kronisk tarm betændelse. Ætiologien af CD er dårligt forstået, men der er et par vigtige faktorer, der synes at være ansvarlig for CD udvikling, herunder intestinal mikrobiota, og genetiske og miljømæssige faktorer, såsom kost eller stress1. For en bedre forståelse af patogenesen af Crohns sygdom, flere modeller af tarmbetændelse er blevet brugt2,3,4,5,6,7. I denne artikel præsenterer vi resultater opnået fra en 2,4,6-trinitrobenzen sulfonsyre (TNBS)-induceret murine model af CD.
Det er blevet dokumenteret, at østrogener er i stand til at modulere kronisk tarmbetændelse8,9,10,11,12. Den biologiske aktivitet af østrogener er medieret af cognate receptorer, blandt hvilke er nukleare østrogen receptorer (ERs), dvs ERα (gen ESR1) og ERβ (genESR2), samt G protein-koblet østrogen receptor, dvs GPER (gen GPER1), benævnt membran-bundet ER13,14. Der er flere metoder til bestemmelse af niveauet af østrogen receptorer, men kun få kan bruges til at visualisere dem i tarmen.
Immunhistokemi (IHC) er en udbredt metode i kliniske og grundlæggende undersøgelser til påvisning af visse antigener i celler eller væv med fluoromoni-konjugerede antistoffer. IHC synes at være en vigtig metode i vævsstruktur visualisering, samt i identifikation og lokalisering af specifikke proteiner, som kan være afgørende for at forstå udviklingen af colitis. Her præsenterer vi en komplet og valideret protokol for immunhistokemisk visualisering af østrogenreceptorer i tarmen ved hjælp af immunfluorescens.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Animals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/C mice</td>
			<td>University of Lodz</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62379-531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardboard block</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope - TCS SP8</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fully automated rotary microtome - RM2255</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J1800BMNT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated Paraffin Embedding Module - EG1150 H</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histological box</td>
			<td>Marfour</td>
			<td>LN.138747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic pen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z377821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory balance</td>
			<td>Radwag</td>
			<td>WL-104-0048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X software</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal mold</td>
			<td>Marfour</td>
			<td>CP.5105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile gauze</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile scissor</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile tweezer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue processor - TP1020</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2, 4, 6-trinitrobenzene sulfonic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>92822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiOC6 (3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>318426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DyLight 650 secondary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab96886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ER&#945; primary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab75635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ER&#946; primary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab3576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>396480111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>432173111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GPER primary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab39742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>575283421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxidase</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>885193111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane (forane)</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>1001936040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16210064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>39602012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petrie dish</td>
			<td>Nest Scientific</td>
			<td>705001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Physiological saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin (antibiotic)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifage Mountant with DAPI (glycerol-based liquid with DAPI)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Chempur</td>
			<td>WE/231-598-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>795780429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>853470115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>BA0860119</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of estrogen receptors in colons of mice with tnbs-induced crohn's disease using immunofluorescence

Crohns sygdom er den mest diagnosticerede form for inflammatorisk tarmsygdom. Kronisk betændelse udvikler sig i tarmen fører til peristalkse lidelse og skader på tarmslimhinden og synes at være forbundet med en øget risiko for kolon neoplastisk transformation. Akkumulerende beviser tyder på, at østrogener og østrogen receptorer påvirker ikke kun hormon-følsomme væv, men også andre væv ikke direkte relateret til østrogener, såsom lunger eller tyktarmen. Her beskriver vi protokollen for vellykket immunfluorescens farvning af østrogenreceptorer i tyktarmen fremstillet af en murinemodel af TNBS-induceret Crohns sygdom. En detaljeret protokol for induktion af Crohns sygdom i mus og tarm præparat er fastsat samt en trin-for-trin immunhistokemiske procedure ved hjælp af formalin-faste paraffin-indlejrede tarm sektioner. De beskrevne metoder er ikke kun nyttige for østrogen receptor afsløring og østrogen signalering undersøgelse in vivo, men kan også anvendes til for andre proteiner, som kan være involveret i udviklingen af colitis.

Makroskopisk karakter i koloner hos mus med TNBS-induceret Crohns sygdom Repræsentative billeder af koloner taget fra kontrol og TNBS-behandlede mus er vist i figur 2. I mus med en TNBS-induceret model af Crohns sygdom reduceres tyktarmens længde, mens tyktarmens bredde øges.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60813/60813fig2a.jpg"> Figur 2: ...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Estrogen Receptors in Colons of Mice with TNBS-Induced Crohn's Disease using Immunofluorescence at JoVE.com

Visualization of Estrogen Receptors in Colons of Mice with TNBS-Induced Crohn's Disease using Immunofluorescence

Protokollen præsenterer en komplet valideret TNBS-induceret murine model af Crohns sygdom og metoder til visualisering af østrogen receptorer ved immunhistokemi ved hjælp af immunofluorescens af formalin-faste kolon sektioner indlejret i paraffin.

Visualisering af østrogenreceptorer i koloner af mus med TNBS-induceret Crohns sygdom ved hjælp af immunofluorescens

Crohn&#39;s disease is the most diagnosed type of inflammatory bowel disease. Chronic inflammation developing in the intestine leads to peristalsis ...

Stigende beviser tyder på virkningen af østrogen signalering på den colone del af fysiologi, immunohistochemistry er en lovende teknik til at identificere østrogen receptorer i tyktarmen, og de udvikler sig til colitis. Vi præsenterer en komplet og valideret protokol for immunohistokemisk visualisering af østrogen receptorer i tyktarmen, ved hjælp af immunfluorescens. Sammen med Dr.Sylwia Michlewska fra Laboratory of Microscopic Imaging fra University of Lodz, vil vi demonstrere proceduren.Placer tyktarmen i en petriskål. Skær tyktarmen i en til to centimeter fragmenter. Placer hvert fragment på en svamp i en passende mærket histologisk kassette.Placer en kassette, der indeholder et kolon fragment i 4%paraformaldehyd. Inkuberes i mindst 24 timer ved fire grader celsius. Forbered og programmer vævsprocessoren i en times inkubation i 50%70%90%95% og 100% ethanol, xylen 100% ethanol, og xylen kun, samt for mindst tre timers inkubation i flydende paraffin.Overfør kolon fragment til en histologisk boks. Placer boksen i den forprogrammerede vævsprocessor, og kør processoren. Efter inkubation i væv processor fjerne tyktarmen fra histologisk boks og placere kolon fragment i en metalform, således at de to ender af tyktarmen er i en oprejst position.Fyld en tredjedel af formen med flydende paraffin. Placer formen i køleområdet på minus fem grader celsius i et par sekunder og derefter flytte formen til opvarmningsområdet ved 70 grader celsius. Derefter placeres formen i den nederste del af histologisk boks og dække hele kolon fragment med flydende paraffin.Placer metalform, der indeholder tyktarmsfragmentet og paraffin i køleområdet i et par minutter. Fjern derefter metalform fra tyktarmen og paraffinblokken. Inkuber tyktarmen og paraffinblokken i mindst 24 timer ved fire grader celsius.Efter inkubation fjernes overskydende paraffin fra blokken. Sæt tyktarmen og paraffinblokken i en fuldautomatisk roterende mikrotom. Skær kolon fragment i fem mikrometer sektioner.Overfør en kolon sektion til et vandbad, forvarmet til 40 grader celsius. Brug den mærkede glasrutsjebane til at fjerne kolonssektionen fra vandbadet og inkuber glasrutsjebanen ved stuetemperatur i 24 timer. Først skal du fjerne paraffin ved at inkubere glasdiaset i xylen i fem minutter.Gentag dette trin tre gange. Derefter placere glas dias i en en-til-en blanding af xylen og 100% ethanol i fem minutter. Gentag dette trin tre gange.Brug en række faldende ethanolkoncentrationer til at rehydrere kolonsektionen. Nedsænk rutsjebanen i ethanolen i fem minutter. Gentag tre gange ved hver koncentration, før du går videre til næste koncentration.Skyl glasrutsjebanen under rindende vand i fem minutter. Opvarm antigenudtagningsbufferen til 95 til 98 grader celsius. Varm derefter glasrutsjebanen i kogende antigenudtagningsopløsning i 10 minutter.For at forhindre spild af reagenser skal du bruge en hydrofob pen til at tegne en cirkel rundt om kolonsektionen. Derefter inkuberes diaset i 10 minutter i en 3% opløsning af hydrogenperoxidase og vand. Vask glide i vaskeopløsning i fem minutter.Derefter inkuberes diaset i blokerende opløsning i en time ved stuetemperatur. Fjern blokeringsopløsningen, og tilsæt 20 til 50 mikroliter primært antistof mod E-R alpha, E-R beta eller G-P-E-R fortyndet. Inkuber det primære antistof natten over ved fire grader celsius i mørke.Fjern antistofopløsningen. Vask sliden tre gange i vaskeopløsning i fem minutter hver gang. Dernæst tilsættes fortyndet sekundært antistof.Inkuber diaset med sekundært antistof konjugeret med farvestof i en time ved stuetemperatur i mørke. Fjern den sekundære antistofopløsning fra sliden. Vask sliden tre gange i vaskeopløsning i fem minutter hver gang.Tilsæt fortyndet fluorrom til membranvisualisering og inkuberes i 10 minutter ved stuetemperatur i mørke. Opløsningen fjernes ogglasset vaskes tre gange i vaskeopløsningen i fem minutter hver gang. Tilføj et par dråber glycerol-baserede flydende DAPI, en fluorromm for cellekerner visualisering, direkte på tyktarmen sektion.Dæk den forsigtigt med et dæksel. Inkuber kolonsektionen i mindst 24 timer ved fire grader celsius. Analysér kolonsektionen under et konfokalt mikroskop med 20x eller 63x mål og olienedsænkning.Specificiteten af de antistoffer, der blev anvendt i undersøgelsen, blev valideret ved hjælp af MCF-7-celler. Østrogen receptor antistoffer aktiveret påvisning af nukleare østrogen receptorer E-R alpha og E-R beta samt membran-bundet østrogen receptor G-P-E-R. Der blev også udført en negativ kontrol, hvor MCF-7 celler kun blev plettet med sekundært antistof konjugeret med fluorromrom og en glycerolbaseret væske med DAPI.Et stærkt cytoplasmatisk signal af E-R alpha blev fundet i kolon sektioner fra kontrol mus og fra mus med TNBS-induceret Crohns sygdom. Men kun kolonerne fra kontrolmus havde E-R alpha lokaliseret i bægercelle cytoplasma. Konfokal mikroskopi afslørede også cytoplasmatisk lokalisering af E-R beta i kolon dele af både kontrol og TNBS-behandlede mus.Tilsvarende cytoplasmatisk lokalisering af G-P-E-R blev dokumenteret i tyktarmen sektioner fra kontrol mus og TNBS-behandlede mus. Den korrekte placering af tyktarmen i formen er afgørende for at generere den korrekte tværsnit. Fluorromrom bør vælges efter eget excitations- og emissionsspektrum.Denne metode kan også anvendes på andre proteiner, der kan være involveret i udviklingen af colitis. Immunhistokæmi detektion ved immunfluorescens kan udvides til at plette andre proteiner i protein-protein retning status.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Automatiseret Akustisk Udlevering til seriel fortynding af peptid agonister i Potens Bestemmelse assays

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Påvisning og visualisering af DNA-skader-inducerede proteinkomplekser i suspensionscellekulturer ved anvendelse af Proximity Ligation Assay

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Simple Elimination of Background Fluorescence in Formalin-Fixed Human Brain Tissue for Immunofluorescence Microscopy

Simpel fjernelse af baggrunden fluorescens i Formalin-fast menneskelige hjernevæv til immunofluorescens mikroskopi

Immunofluorescence is a common method used to visualize subcellular compartments and to determine the localization of specific proteins within a tissue ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Karakterisering af glykoproteiner med immunglobulin Fold af røntgenkrystallografi og biofysiske metoder

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Identification of Orexin and Endocannabinoid Receptors in Adult Zebrafish Using Immunoperoxidase and Immunofluorescence Methods

Identifikation af orexin og Endocannabinoide receptorer hos voksne zebrafisk ved hjælp af Immunoperoxidase og immunofluorescens metoder

Immunohistochemistry (IHC) is a highly sensitive and specific technique involved in the detection of target antigens in tissue sections with labeled ...

An In Vivo Estrogen Deficiency Mouse Model for Screening Exogenous Estrogen Treatments of Cardiovascular Dysfunction After Menopause

En in vivo østrogenmangel muse model til screening eksogene østrogen behandlinger af hjerte-kar-dysfunktion efter overgangsalderen

Postmenopausal women are at greater risk of developing cardiovascular diseases than premenopausal women. Female mice ovariectomized (OVX) at weaning ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Interaktioner med og membran Permeabilisering af hjernen mitochondrier af amyloid Fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  ÃƒÅ½Ã‚Â² Reporter Assay

Screening for fytoøstrogener ved hjælp af en cellebaseret østrogenreceptor β Reporter Assay

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...

Transplantation of Neonatal Mouse Cardiac Macrophages into Adult Mice

Transplantation af neonatale mus hjertemakrofager i voksne mus

In an injured neonatal myocardium, macrophages facilitate cardiomyocyte proliferation and angiogenesis and promote heart regeneration. The present study ...