Name: visualization of estrogen receptors in colons of mice with tnbs-induced crohn's disease using immunofluorescence
Uploaded: 2020-03-12T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Estrogen Receptors in Colons of Mice with TNBS-Induced Crohn's Disease using Immunofluorescence at JoVE.com

Het werk werd gepubliceerd dankzij de financiële steun van de autoriteiten van de Universiteit van Lodz: vicerector wetenschappelijk onderzoek, vicerector nationale en internationale samenwerking en decaan van de faculteit Biologie en Milieubescherming. Damian Jacenik werd ondersteund door subsidies (2017/24/T/NZ5/00045 en 2015/17/N/NZ5/00336) van National Science Centre, Polen.

Dierstudies werden uitgevoerd met toestemming van het Lokaal Ethisch Comité (28/ŁB29/2016) overeenkomstig Richtlijn 2010/63/EU van het Europees Parlement en de Raad van 22 september 2010 en institutionele aanbevelingen.
1. TNBS-geïnduceerde murine model van de ziekte van Crohn
OPMERKING: Dit protocol maakt gebruik van mannelijke BALB/C muizen met een gewicht van 25-28 g. Dieren zijn gehuisvest bij een constante temperatuur (22-24 °C) en, relatieve vochtigheid 55 ?...

<ol>
	<li>Zhang, Y. Z., Li, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+bowel+disease:+pathogenesis.">Inflammatory bowel disease: pathogenesis.</a> World Journal of Gastroenterology. 20 (1), 91-99 (2014).</li><li>Morris, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hapten-induced+model+of+chronic+inflammation+and+ulceration+in+the+rat+colon.">Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon.</a> Gastroenterology. 96 (3), 795-803 (1989).</li><li>Okayasu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+in+the+induction+of+reliable+experimental+acute+and+chronic+ulcerative+colitis+in+mice.">A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice.</a> Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).</li><li>Boirivant, M., Fuss, I. J., Chu, A., Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxazolone+colitis:+a+murine+model+of+T+helper+cell+type+2+colitis+treatable+with+antibodies+to+interleukin+4.">Oxazolone colitis: a murine model of T helper cell type 2 colitis treatable with antibodies to interleukin 4.</a> Journal of Experimental Medicine. 188 (10), 1929-1939 (1998).</li><li>Morrissey, P. J., Charrier, K., Braddy, S., Liggitt, D., Watson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4++T+cells+that+express+high+levels+of+CD45RB+induce+wasting+disease+when+transferred+into+congenic+severe+combined+immunodeficient+mice.+Disease+development+is+prevented+by+cotransfer+of+purified+CD4++T+cells.">CD4+ T cells that express high levels of CD45RB induce wasting disease when transferred into congenic severe combined immunodeficient mice. Disease development is prevented by cotransfer of purified CD4+ T cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 178 (1), 237-244 (1993).</li><li>K&#252;hn, R., L&#246;hler, J., Rennick, D., Rajewsky, K., M&#252;ller, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-10-deficient+mice+develop+chronic+enterocolitis.">Interleukin-10-deficient mice develop chronic enterocolitis.</a> Cell. 75 (2), 263-274 (1993).</li><li>Sundberg, J. P., Elson, C. O., Bedigian, H., Birkenmeier, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous,+heritable+colitis+in+a+new+substrain+of+C3H/HeJ+mice.">Spontaneous, heritable colitis in a new substrain of C3H/HeJ mice.</a> Gastroenterology. 107 (6), 1726-1735 (1994).</li><li>Harnish, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beneficial+effects+of+estrogen+treatment+in+the+HLA-B27+transgenic+rat+model+of+inflammatory+bowel+disease.">Beneficial effects of estrogen treatment in the HLA-B27 transgenic rat model of inflammatory bowel disease.</a> American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 286 (1), 118-125 (2004).</li><li>Pierdominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+estrogen+receptor+&#946;+expression+with+inflammatory+bowel+disease+activity.">Linking estrogen receptor &#946; expression with inflammatory bowel disease activity.</a> Oncotarget. 6 (38), 40443-40451 (2015).</li><li>W&#322;odarczyk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-coupled+receptor+30+(GPR30)+expression+pattern+in+inflammatory+bowel+disease+patients+suggests+its+key+role+in+the+inflammatory+process.+A+preliminary+study.">G protein-coupled receptor 30 (GPR30) expression pattern in inflammatory bowel disease patients suggests its key role in the inflammatory process. A preliminary study.</a> Journal of Gastrointestinal and Liver Diseases. 26 (1), 29-35 (2017).</li><li>Mohammad, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+receptor+&#945;+contributes+to+T+cell-mediated+autoimmune+inflammation+by+promoting+T+cell+activation+and+proliferation.">Estrogen receptor &#945; contributes to T cell-mediated autoimmune inflammation by promoting T cell activation and proliferation.</a> Science Signaling. 11 (526), eaap9415 (2018).</li><li>Jacenik, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-coupled+estrogen+receptor+mediates+anti-inflammatory+action+in+Crohn's+disease.">G protein-coupled estrogen receptor mediates anti-inflammatory action in Crohn's disease.</a> Scientific Reports. 9 (1), 6749 (2019).</li><li>Prossnitz, E. R., Barton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+G+protein-coupled+estrogen+receptor+GPER+in+health+and+disease.">The G protein-coupled estrogen receptor GPER in health and disease.</a> Nature Review Endocrinology. 7 (12), 715-726 (2011).</li><li>Ya&#351;ar, P., Ayaz, G., User, S. D., G&#252;p&#252;r, G., Muyan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+estrogen-estrogen+receptor+signaling.">Molecular mechanisms of estrogen-estrogen receptor signaling.</a> Reproductive Medicine and Biology. 16 (1), 4-20 (2016).</li><li>Pizarro, T. T., Arseneau, K. O., Bamias, G., Cominelli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+the+study+of+Crohn's+disease.">Mouse models for the study of Crohn's disease.</a> Trends in Molecular Medicine. 9 (5), 218-222 (2003).</li><li>Neurath, M. F., Fuss, I., Kelsall, B. L., St&#252;ber, E., Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+interleukin+12+abrogate+established+experimental+colitis+in+mice.">Antibodies to interleukin 12 abrogate established experimental colitis in mice.</a> Journal of Experimental Medicine. 182 (5), 1281-1290 (1995).</li><li>Ikeda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simvastatin+attenuates+trinitrobenzene+sulfonic+acid-induced+colitis,+but+not+oxazalone-induced+colitis.">Simvastatin attenuates trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis, but not oxazalone-induced colitis.</a> Digestive Diseases and Sciences. 53 (7), 1869-1875 (2007).</li><li>Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Elizabeth, J., Rao, U. K., Ranganathan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+physical+basics+of+routine+formaldehyde+fixation.">Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation.</a> Journal of Oral Maxillofacial Pathology. 16 (3), 400-405 (2012).</li></ol>

Er zijn tal van diermodellen voor IBD pathofysiologie onderzoek, met inbegrip van genetische, immunologische of spontane modellen, evenals chemisch geïnduceerde modellen15. Onder de verschillende soorten diermodellen van colitis, chemisch geïnduceerde modellen zoals de TNBS-geïnduceerde model beschreven in dit protocol, zijn relatief goedkoop en gemakkelijk te verkrijgen. Het tnbs-geïnduceerde murinemodel van colitis heeft verschillende klinische symptomen gerelateerd aan de pathologische basi...

De ziekte van Crohn (CD) is een inflammatoire darmziekte (IBD) die zich manifesteert als chronische darmontsteking. De etiologie van CD is slecht begrepen, maar er zijn een paar belangrijke factoren die verantwoordelijk lijken te zijn voor de ontwikkeling van cd's, waaronder darmmicrobiota, en genetische en omgevingsfactoren, zoals dieet of stress1. Voor een beter begrip van de pathogenese van de ziekte van Crohn zijn verschillende modellen van darmontsteking gebruikt2,3,4,5,6,7. In dit artikel presenteren we resultaten verkregen uit een 2,4,6-trinitrobenzeensulfoonzuur (TNBS)-geïnduceerde murinemodel van CD.
Het is gedocumenteerd dat oestrogenen in staat zijn om chronische darmontsteking te moduleren8,,9,10,11,12. De biologische activiteit van oestrogenen wordt bemiddeld door cognate receptoren, waaronder nucleaire oestrogeenreceptoren (ERs), d.w.z. ERα (gen ESR1) en ERβ (gen ESR2), evenals G-eiwit-gekoppeldoestrogeenreceptor, d.w.z. GPER (gen GPER1),aangeduid als membraangebonden ER13,14. Er zijn verschillende methoden voor het bepalen van het niveau van oestrogeen receptoren, maar slechts een paar kunnen worden gebruikt om ze te visualiseren in de darm.
Immunohistochemie (IHC) is een veelgebruikte methode in klinische en basisstudies voor de detectie van bepaalde antigenen in cellen of weefsels met fluorchroom-geconjugeerde antilichamen. IHC lijkt een belangrijke methode in weefselstructuur visualisatie, evenals in de identificatie en lokalisatie van specifieke eiwitten, die van cruciaal belang kunnen zijn voor het begrijpen van de ontwikkeling van colitis. Hier presenteren we een compleet en gevalideerd protocol voor immunohistochemische visualisatie van oestrogeenreceptoren in de darm met behulp van immunofluorescentie.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Animals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/C mice</td>
			<td>University of Lodz</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62379-531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardboard block</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope - TCS SP8</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fully automated rotary microtome - RM2255</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J1800BMNT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated Paraffin Embedding Module - EG1150 H</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histological box</td>
			<td>Marfour</td>
			<td>LN.138747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic pen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z377821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory balance</td>
			<td>Radwag</td>
			<td>WL-104-0048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X software</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal mold</td>
			<td>Marfour</td>
			<td>CP.5105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile gauze</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile scissor</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile tweezer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue processor - TP1020</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2, 4, 6-trinitrobenzene sulfonic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>92822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiOC6 (3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>318426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DyLight 650 secondary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab96886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ER&#945; primary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab75635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ER&#946; primary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab3576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>396480111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>432173111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GPER primary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab39742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>575283421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxidase</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>885193111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane (forane)</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>1001936040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16210064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>39602012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petrie dish</td>
			<td>Nest Scientific</td>
			<td>705001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Physiological saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin (antibiotic)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifage Mountant with DAPI (glycerol-based liquid with DAPI)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Chempur</td>
			<td>WE/231-598-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>795780429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>853470115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>BA0860119</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of estrogen receptors in colons of mice with tnbs-induced crohn's disease using immunofluorescence

De ziekte van Crohn is het meest gediagnosticeerde type inflammatoire darmziekte. Chronische ontsteking zich ontwikkelt in de darm leidt tot peristtiek stoornis en schade van intestinale slijmvlies en lijkt te worden geassocieerd met een verhoogd risico op darmneoplastische transformatie. Accumuleren bewijs geeft aan dat oestrogenen en oestrogeen receptoren invloed hebben op niet alleen hormoon-gevoelige weefsels, maar ook andere weefsels niet direct gerelateerd aan oestrogenen, zoals de longen of dikke darm. Hier beschrijven we het protocol voor de succesvolle immunofluorescentie kleuring van oestrogeenreceptoren in de dikke darm verkregen uit een murinemodel van de ziekte van TNBS-geïnduceerde ziekte van Crohn. Een gedetailleerd protocol voor de inductie van de ziekte van Crohn bij muizen en darmpreparaat wordt verstrekt, evenals een stapsgewijze immunohistochemische procedure met behulp van formaline-vaste paraffine-ingebedde darmsecties. De beschreven methoden zijn niet alleen nuttig voor oestrogeen receptor detectie en oestrogeen signalering onderzoek in vivo, maar kan ook worden toegepast op voor andere eiwitten die betrokken kunnen zijn bij de ontwikkeling van colitis.

Macroscopische kenmerken van dikke darmen bij muizen met tnbs-geïnduceerde ziekte van Crohn Representatieve beelden van de uit de controle genomen dikke darmen en met TNBS behandelde muizen worden weergegeven in figuur 2. Bij muizen met een TNBS-geïnduceerd model van de ziekte van Crohn wordt de lengte van de dikke darm verminderd terwijl de breedte van de dikke darm wordt verhoogd.
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-pag...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Estrogen Receptors in Colons of Mice with TNBS-Induced Crohn's Disease using Immunofluorescence at JoVE.com

Visualization of Estrogen Receptors in Colons of Mice with TNBS-Induced Crohn's Disease using Immunofluorescence

Het protocol presenteert een volledig gevalideerd TNBS-geïnduceerde murine model van de ziekte van Crohn en methoden voor visualisatie van oestrogeenreceptoren door immunohistochemie met behulp van immunofluorescentie van formaline-vaste darm secties ingebed in paraffine.

Visualisatie van oestrogeenreceptoren in colons van muizen met tnbs-geïnduceerde ziekte van Crohn met behulp van immunofluorescentie

Crohn&#39;s disease is the most diagnosed type of inflammatory bowel disease. Chronic inflammation developing in the intestine leads to peristalsis ...

Toenemende bewijs suggereert de impact van oestrogeen signalering op het colonische deel van de fysiologie, immunohistochemie is een veelbelovende techniek voor het identificeren van oestrogeenreceptoren in de dikke darm en ze evolueren in colitis. We presenteren een compleet en gevalideerd protocol voor immunohistochemische visualisatie van oestrogeenreceptoren in de dikke darm, met behulp van immunofluorescentie. Samen met Dr.Sylwia Michlewska van Laboratory of Microscopische Beeldvorming van de Universiteit van Lodz, zullen we de procedure demonstreren.Plaats de dikke darm in een petrischaaltje. Snijd de dikke darm in een tot twee centimeter fragmenten. Plaats elk fragment op een spons in een op de juiste wijze gelabelde histologische cassette.Plaats een cassette met een dikke darmfragment in 4%paraformaldehyde. Incubeer voor ten minste 24 uur op vier graden Celsius. Bereid en programmeer de weefselprocessor voor een uur incubatie in 50%70%90%95% en 100% ethanol, xyleen 100% ethanol en xyleen alleen, evenals gedurende ten minste drie uur incubatie in vloeibare paraffine.Breng het dikke darmfragment over naar een histologische doos. Plaats de doos in de voorgeprogrammeerde weefselprocessor en voer de processor uit. Na incubatie in de weefselprocessor verwijder de dikke darm uit de histologische doos en plaats het dikke darmfragment in een metalen mal, zodanig dat de twee uiteinden van de dikke darm rechtop staan.Vul een derde van de mal met vloeibare paraffine. Plaats de mal in het koelgebied op min vijf graden Celsius voor een paar seconden en dan verplaatsen van de mal naar de opwarming gebied op 70 graden Celsius. Plaats vervolgens de mal in het onderste deel van de histologische doos en bedek het hele colonfragment met vloeibare paraffine.Plaats de metalen mal met de dikke darm fragment en paraffine in het koelgebied voor een paar minuten. Verwijder vervolgens de metalen mal uit de dikke darm en paraffine blok. Incubeer de dikke darm en paraffine blok voor ten minste 24 uur op vier graden Celsius.Na incubatie, verwijder overtollige paraffine uit het blok. Plaats de dikke darm en paraffine blok in een volledig geautomatiseerde roterende microtome. Snijd de dikke darm fragment in vijf micrometer secties.Breng een dikke darm sectie naar een waterbad, voorverwarmd tot 40 graden Celsius. Gebruik de gelabelde glazen schuif om de dikke darm sectie te verwijderen uit het waterbad en de glazen glijbaan in te broeden op kamertemperatuur gedurende 24 uur. Verwijder eerst de paraffine door de glazen schuif in xyleen gedurende vijf minuten uit te broeden.Herhaal deze stap drie keer. Plaats vervolgens de glazen schuif in een een-op-een mengsel van xyleen en 100% ethanol gedurende vijf minuten. Herhaal deze stap drie keer.Gebruik een reeks van afnemende ethanol concentraties om de dikke darm sectie rehydrateren. Dompel de glijbaan gedurende vijf minuten onder in de ethanol. Herhaal dit drie keer bij elke concentratie voordat u doorgaat naar de volgende concentratie.Spoel de glazen glijbaan onder stromend water gedurende vijf minuten. Verwarm de antigeen retrieval buffer op tot 95 tot 98 graden Celsius. Verwarm vervolgens de glazen schuif in kokende antigeenophaaloplossing gedurende 10 minuten.Om verspilling van reagentia te voorkomen, gebruikt u een hydrofobe pen om een cirkel rond de dikke darmsectie te tekenen. Vervolgens, incubeer de glijbaan gedurende 10 minuten in een 3%-oplossing van waterstofperoxidase en water. Was de glijbaan vijf minuten in wasoplossing.Vervolgens de glijbaan in het blokkeren van oplossing voor een uur bij kamertemperatuur. Verwijder de blokkeringsoplossing en voeg 20 tot 50 microliter primair antilichaam toe tegen E-R alpha, E-R bèta of G-P-E-R verdund. Incubeer het primaire antilichaam 's nachts bij vier graden celsius in het donker.Verwijder de antilichaamoplossing. Was de glijbaan drie keer in wasoplossing gedurende vijf minuten per keer. Voeg vervolgens verdund secundair antilichaam toe.Broed de glijbaan met secundaire antilichaam geconjugeerd met kleurstof gedurende een uur bij kamertemperatuur in het donker. Verwijder de secundaire antilichaamoplossing van de dia. Was de glijbaan drie keer in wasoplossing gedurende vijf minuten per keer.Voeg verdund fluorchroom toe voor membraanvisualisatie en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Verwijder de oplossing en was de glijbaan drie keer in wasoplossing gedurende vijf minuten per keer. Voeg een paar druppels glycerol-gebaseerde vloeibare DAPI, een fluorchrome voor celkernen visualisatie, direct op de dubbele punt sectie.Bedek het voorzichtig met een afdekplaat. Incubeer de dikke darm sectie voor ten minste 24 uur op vier graden Celsius. Analyseer de dikke darm sectie onder een confocale microscoop met 20x of 63x doelstellingen en olie onderdompeling.De specificiteit van de antilichamen die in de studie werden gebruikt, werd gevalideerd met mcf-7-cellen. De oestrogeen receptor antilichamen ingeschakeld detectie van nucleaire oestrogeen receptoren E-R alpha en E-R beta evenals het membraan gebonden oestrogeen receptor G-P-E-R. Er werd ook een negatieve controle uitgevoerd waarbij MCF-7 cellen alleen werden bevlekt met secundair antilichaam geconjugeerd met fluorchrome en een vloeistof op basis van glycerol met DAPI.Een sterk cytoplasmatisch signaal van E-R alpha werd gevonden in de dikke darmsecties verkregen van controlemuizen en van muizen met de ziekte van TNBS-geïnduceerde Crohn. Echter, alleen de dikke darmen verkregen van controle muizen had E-R alpha gelokaliseerd in de bekercel cytoplasma. Confocale microscopie onthulde ook cytoplasmatische lokalisatie van E-R beta in de dikke darm secties van zowel de controle en de TNBS-behandelde muizen.Op dezelfde manier werd cytoplasmalokalisatie van G-P-E-R gedocumenteerd in de dikke darmsecties verkregen van controlemuizen en de met TNBS behandelde muizen. De juiste positionering van de dikke darm in de mal is essentieel om de juiste dwarsdoorsnede te genereren. Fluorchroom moet worden gekozen door zijn eigen excitatie- en emissiespectrum.Deze methode kan ook worden toegepast op andere eiwitten die betrokken kunnen zijn bij de ontwikkeling van colitis. Immunohistochemie detectie door immunofluorescentie kan worden uitgebreid tot vlekken andere eiwitten in eiwit-eiwit richting status.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Geautomatiseerde Acoustic Afgifte voor de seriële verdunning van Peptide agonisten in potentie Bepaling Testen

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Detectie en visualisatie van DNA-schade-geïnduceerde eiwitcomplexen in suspensiecellenculturen met behulp van de proximity-liggingsassay

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Simple Elimination of Background Fluorescence in Formalin-Fixed Human Brain Tissue for Immunofluorescence Microscopy

Eenvoudige verwijdering van achtergrond fluorescentie in formaline-vaste menselijk hersenweefsel voor immunofluorescentie microscopie

Immunofluorescence is a common method used to visualize subcellular compartments and to determine the localization of specific proteins within a tissue ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Karakterisering van glycoproteïnen met de vouw van de immunoglobuline door middel van röntgendiffractie en biofysische technieken

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Identification of Orexin and Endocannabinoid Receptors in Adult Zebrafish Using Immunoperoxidase and Immunofluorescence Methods

Identificatie van Orexin en endocannabinoïde receptoren bij volwassen zebravis met behulp van immunoperoxidasekleuring en immunofluorescentie methoden

Immunohistochemistry (IHC) is a highly sensitive and specific technique involved in the detection of target antigens in tissue sections with labeled ...

An In Vivo Estrogen Deficiency Mouse Model for Screening Exogenous Estrogen Treatments of Cardiovascular Dysfunction After Menopause

Een in vivo oestrogeen deficiëntie muis model voor het screenen van exogene oestrogeen behandelingen van cardiovasculaire disfunctie na de menopauze

Postmenopausal women are at greater risk of developing cardiovascular diseases than premenopausal women. Female mice ovariectomized (OVX) at weaning ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Interacties met en membraan Permeabilization van de mitochondriën van de hersenen door amyloid fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  ÃƒÅ½Ã‚Â² Reporter Assay

Screening op fyto-oestrogenen met behulp van een celgebaseerde oestrogeenreceptor β Reporter Assay

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...

Transplantation of Neonatal Mouse Cardiac Macrophages into Adult Mice

Transplantatie van neonatale muizen cardiale macrofagen in volwassen muizen

In an injured neonatal myocardium, macrophages facilitate cardiomyocyte proliferation and angiogenesis and promote heart regeneration. The present study ...