Name: visualization of estrogen receptors in colons of mice with tnbs-induced crohn's disease using immunofluorescence
Uploaded: 2020-03-12T12:30:00
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Les travaux ont été publiés grâce au soutien financier des autorités de l’Université de Lodz : vice-recteur à la recherche scientifique, vice-recteur à la coopération nationale et internationale et doyen de la Faculté de biologie et de protection de l’environnement. Damian Jacenik a été soutenu par des subventions (2017/24/T/NZ5/00045 et 2015/17/N/NZ5/00336) du Centre national des sciences, en Pologne.

Des études sur les animaux ont été menées avec le consentement du Comité local d’éthique (28/29/2016) conformément à la directive 2010/63/UE du Parlement européen et du Conseil du 22 septembre 2010, ainsi que des recommandations institutionnelles.
1. Modèle murin induit par TNBS de la maladie de Crohn
REMARQUE : Ce protocole utilise des souris BALB/C mâles pesant 25-28 g. Les animaux sont logés à une température constante (22-24 oC) et, humidité relat...

<ol>
	<li>Zhang, Y. Z., Li, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+bowel+disease:+pathogenesis.">Inflammatory bowel disease: pathogenesis.</a> World Journal of Gastroenterology. 20 (1), 91-99 (2014).</li><li>Morris, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hapten-induced+model+of+chronic+inflammation+and+ulceration+in+the+rat+colon.">Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon.</a> Gastroenterology. 96 (3), 795-803 (1989).</li><li>Okayasu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+in+the+induction+of+reliable+experimental+acute+and+chronic+ulcerative+colitis+in+mice.">A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice.</a> Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).</li><li>Boirivant, M., Fuss, I. J., Chu, A., Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxazolone+colitis:+a+murine+model+of+T+helper+cell+type+2+colitis+treatable+with+antibodies+to+interleukin+4.">Oxazolone colitis: a murine model of T helper cell type 2 colitis treatable with antibodies to interleukin 4.</a> Journal of Experimental Medicine. 188 (10), 1929-1939 (1998).</li><li>Morrissey, P. J., Charrier, K., Braddy, S., Liggitt, D., Watson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4++T+cells+that+express+high+levels+of+CD45RB+induce+wasting+disease+when+transferred+into+congenic+severe+combined+immunodeficient+mice.+Disease+development+is+prevented+by+cotransfer+of+purified+CD4++T+cells.">CD4+ T cells that express high levels of CD45RB induce wasting disease when transferred into congenic severe combined immunodeficient mice. Disease development is prevented by cotransfer of purified CD4+ T cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 178 (1), 237-244 (1993).</li><li>K&#252;hn, R., L&#246;hler, J., Rennick, D., Rajewsky, K., M&#252;ller, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-10-deficient+mice+develop+chronic+enterocolitis.">Interleukin-10-deficient mice develop chronic enterocolitis.</a> Cell. 75 (2), 263-274 (1993).</li><li>Sundberg, J. P., Elson, C. O., Bedigian, H., Birkenmeier, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous,+heritable+colitis+in+a+new+substrain+of+C3H/HeJ+mice.">Spontaneous, heritable colitis in a new substrain of C3H/HeJ mice.</a> Gastroenterology. 107 (6), 1726-1735 (1994).</li><li>Harnish, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beneficial+effects+of+estrogen+treatment+in+the+HLA-B27+transgenic+rat+model+of+inflammatory+bowel+disease.">Beneficial effects of estrogen treatment in the HLA-B27 transgenic rat model of inflammatory bowel disease.</a> American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 286 (1), 118-125 (2004).</li><li>Pierdominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+estrogen+receptor+&#946;+expression+with+inflammatory+bowel+disease+activity.">Linking estrogen receptor &#946; expression with inflammatory bowel disease activity.</a> Oncotarget. 6 (38), 40443-40451 (2015).</li><li>W&#322;odarczyk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-coupled+receptor+30+(GPR30)+expression+pattern+in+inflammatory+bowel+disease+patients+suggests+its+key+role+in+the+inflammatory+process.+A+preliminary+study.">G protein-coupled receptor 30 (GPR30) expression pattern in inflammatory bowel disease patients suggests its key role in the inflammatory process. A preliminary study.</a> Journal of Gastrointestinal and Liver Diseases. 26 (1), 29-35 (2017).</li><li>Mohammad, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+receptor+&#945;+contributes+to+T+cell-mediated+autoimmune+inflammation+by+promoting+T+cell+activation+and+proliferation.">Estrogen receptor &#945; contributes to T cell-mediated autoimmune inflammation by promoting T cell activation and proliferation.</a> Science Signaling. 11 (526), eaap9415 (2018).</li><li>Jacenik, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-coupled+estrogen+receptor+mediates+anti-inflammatory+action+in+Crohn's+disease.">G protein-coupled estrogen receptor mediates anti-inflammatory action in Crohn's disease.</a> Scientific Reports. 9 (1), 6749 (2019).</li><li>Prossnitz, E. R., Barton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+G+protein-coupled+estrogen+receptor+GPER+in+health+and+disease.">The G protein-coupled estrogen receptor GPER in health and disease.</a> Nature Review Endocrinology. 7 (12), 715-726 (2011).</li><li>Ya&#351;ar, P., Ayaz, G., User, S. D., G&#252;p&#252;r, G., Muyan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+estrogen-estrogen+receptor+signaling.">Molecular mechanisms of estrogen-estrogen receptor signaling.</a> Reproductive Medicine and Biology. 16 (1), 4-20 (2016).</li><li>Pizarro, T. T., Arseneau, K. O., Bamias, G., Cominelli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+the+study+of+Crohn's+disease.">Mouse models for the study of Crohn's disease.</a> Trends in Molecular Medicine. 9 (5), 218-222 (2003).</li><li>Neurath, M. F., Fuss, I., Kelsall, B. L., St&#252;ber, E., Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+interleukin+12+abrogate+established+experimental+colitis+in+mice.">Antibodies to interleukin 12 abrogate established experimental colitis in mice.</a> Journal of Experimental Medicine. 182 (5), 1281-1290 (1995).</li><li>Ikeda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simvastatin+attenuates+trinitrobenzene+sulfonic+acid-induced+colitis,+but+not+oxazalone-induced+colitis.">Simvastatin attenuates trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis, but not oxazalone-induced colitis.</a> Digestive Diseases and Sciences. 53 (7), 1869-1875 (2007).</li><li>Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Elizabeth, J., Rao, U. K., Ranganathan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+physical+basics+of+routine+formaldehyde+fixation.">Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation.</a> Journal of Oral Maxillofacial Pathology. 16 (3), 400-405 (2012).</li></ol>

Il existe de nombreux modèles animaux pour l’examen de pathophysiologie des MII, y compris les modèles génétiques, immunologiques ou spontanés, ainsi que les modèles chimiquement induits15. Parmi les plusieurs types de modèles animaux de colite, les modèles induits chimiquement tels que le modèle induit par TNBS décrit dans ce protocole, sont relativement peu coûteux et faciles à obtenir. Le modèle murine TNBS-induit de la colite a plusieurs symptômes cliniques liés à la base pat...

Crohn' la maladie de s (CD) est une maladie inflammatoire d’entrailles (IBD) manifestée comme inflammation chronique d’intestin. L’étiologie du CD est mal comprise, mais il ya quelques facteurs majeurs qui semblent être responsables du développement de CD, y compris le microbiote intestinal, et des facteurs génétiques et environnementaux, tels que l’alimentation ou le stress1. Pour une meilleure compréhension de la pathogénie de la maladie de Crohn, plusieurs modèles d’inflammation intestinale ont été utilisés2,3,4,5,6,7. Dans cet article, nous présentons des résultats obtenus à partir d’un modèle de sulfonique de 2,4,6 trinitrobenzene (TNBS) induit de CD.
Il a été documenté que les oestrogènes sont capables de moduler l’inflammation intestinale chronique8,9,10,11,12. L’activité biologique des oestrogènes est médiatisée par les récepteurs cognate, parmi lesquels les récepteurs d’oestrogène nucléaire (ER), c’est-à-dire ERMD (gène ESR1) et ERMD (gène ESR2), ainsi que le récepteur d’oestrogène couplé à la protéine G, c’est-à-dire GPER (gène GPER1), appelé ERER 13,14. Il existe plusieurs méthodes pour déterminer le niveau des récepteurs d’oestrogène, mais seulement quelques-uns peuvent être utilisés pour les visualiser dans l’intestin.
L’immunohistochimie (IHC) est une méthode largement utilisée dans les études cliniques et fondamentales pour la détection de certains antigènes dans les cellules ou les tissus avec des anticorps fluorochrome-conjugués. IHC semble être une méthode importante dans la visualisation de la structure tissulaire, ainsi que dans l’identification et la localisation de protéines spécifiques, qui peuvent être cruciales pour comprendre le développement de la colite. Ici, nous présentons un protocole complet et validé pour la visualisation immunohistochimique des récepteurs d’oestrogène dans l’intestin utilisant l’immunofluorescence.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Animals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/C mice</td>
			<td>University of Lodz</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62379-531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardboard block</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope - TCS SP8</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fully automated rotary microtome - RM2255</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J1800BMNT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated Paraffin Embedding Module - EG1150 H</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histological box</td>
			<td>Marfour</td>
			<td>LN.138747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic pen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z377821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory balance</td>
			<td>Radwag</td>
			<td>WL-104-0048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X software</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal mold</td>
			<td>Marfour</td>
			<td>CP.5105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile gauze</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile scissor</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile tweezer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue processor - TP1020</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2, 4, 6-trinitrobenzene sulfonic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>92822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiOC6 (3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>318426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DyLight 650 secondary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab96886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ER&#945; primary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab75635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ER&#946; primary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab3576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>396480111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>432173111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GPER primary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab39742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>575283421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxidase</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>885193111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane (forane)</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>1001936040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16210064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>39602012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petrie dish</td>
			<td>Nest Scientific</td>
			<td>705001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Physiological saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin (antibiotic)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifage Mountant with DAPI (glycerol-based liquid with DAPI)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Chempur</td>
			<td>WE/231-598-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>795780429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>853470115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>BA0860119</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of estrogen receptors in colons of mice with tnbs-induced crohn's disease using immunofluorescence

La maladie de Crohn est le type le plus diagnostiqué de maladie inflammatoire de l’intestin. L’inflammation chronique se développant dans l’intestin mène au désordre de périsphyse et aux dommages de la muqueuse intestinale et semble être associée à un risque accru de transformation néoplastique du côlon. L’accumulation de preuves indique que les œstrogènes et les récepteurs d’oestrogène affectent non seulement les tissus hormono-sensibles, mais aussi d’autres tissus non directement liés aux oestrogènes, tels que les poumons ou les colons. Ici, nous décrivons le protocole pour la coloration réussie d’immunofluorescence des récepteurs d’oestrogène dans le côlon obtenu d’un modèle murin de Crohn-induit de TNBS' la maladie de s. Un protocole détaillé pour l’induction de crohn' la maladie de s chez la souris et la préparation d’intestin est fourni aussi bien qu’une procédure immunohistochimique étape par étape utilisant des sections formelles-définies d’intestin paraffin-embedded. Les méthodes décrites sont non seulement utiles pour la détection des récepteurs d’oestrogène et l’étude de signalisation d’oestrogène in vivo mais peuvent également être appliquées pour d’autres protéines qui peuvent être impliquées dans le développement de la colite.

Caractéristiques macroscopiques des colons chez les souris atteintes de la maladie de Crohn induite par TNBS Des images représentatives des colons prélevés sur le contrôle et des souris traitées par TNBS sont montrées dans la figure 2. Chez les souris avec un modèle TNBS-induit de la maladie de Crohn, la longueur du côlon est réduite tandis que la largeur du côlon est augmentée.
<p class="jove_content" fo:keep-together.with...

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Visualization of Estrogen Receptors in Colons of Mice with TNBS-Induced Crohn's Disease using Immunofluorescence

Le protocole présente un modèle murine TNBS-induit complet de Crohn' la maladie de s et des méthodes pour visualiser des récepteurs d’oestrogène par immunohistochemistry utilisant l’immunofluorescence des sections formelles-fixes de colon incorporées dans la paraffine.

Visualisation des récepteurs d’oestrogène dans les colons des souris atteints de la maladie de Crohn induite par le TNBS à l’aide de l’immunofluorescence

Crohn&#39;s disease is the most diagnosed type of inflammatory bowel disease. Chronic inflammation developing in the intestine leads to peristalsis ...

L’évidence croissante suggère l’impact de la signalisation d’oestrogène sur la partie colonique de la physiologie, l’immunohistochimie est une technique prometteuse pour identifier des récepteurs d’oestrogène dans le côlon et ils évoluent dans la colite. Nous présentons un protocole complet et validé pour la visualisation immunohistochimique des récepteurs d’oestrogène dans le côlon, utilisant l’immunofluorescence. En collaboration avec le Dr Sylwia Michlewska du Laboratoire d’imagerie microscopique de l’Université de Lodz, nous démontrerons la procédure.Placer le côlon dans une boîte de Pétri. Couper le côlon en fragments d’un à deux centimètres. Placez chaque fragment sur une éponge dans une cassette histologique dûment étiquetée.Placer une cassette contenant un fragment de côlon dans 4% de paraformaldéhyde. Incuber pendant au moins 24 heures à quatre degrés Celsius. Préparer et programmer le traitement tissulaire pour une heure d’incubation dans 50%70%90%95%et 100% éthanol, xylène 100% éthanol, et xylène seulement, ainsi que pour au moins trois heures d’incubation dans la paraffine liquide.Transférer le fragment du côlon dans une boîte histologique. Placez la boîte dans le processeur de tissu préprogrammé et exécutez le processeur. Après incubation dans le processeur de tissu enlever le côlon de la boîte histologique et placer le fragment du côlon dans un moule métallique, de sorte que les deux extrémités du côlon sont en position verticale.Remplir un tiers du moule de paraffine liquide. Placez le moule dans la zone de refroidissement à moins cinq degrés Celsius pendant quelques secondes, puis déplacez le moule vers la zone de réchauffement à 70 degrés Celsius. Ensuite, placez le moule dans la partie inférieure de la boîte histologique et couvrez le fragment entier du côlon avec de la paraffine liquide.Placez le moule métallique contenant le fragment du côlon et la paraffine dans la zone de refroidissement pendant quelques minutes. Retirez ensuite le moule métallique du côlon et du bloc de paraffine. Incuber le bloc du côlon et de la paraffine pendant au moins 24 heures à quatre degrés Celsius.Après l’incubation, retirer l’excès de paraffine du bloc. Insérez le bloc du côlon et de la paraffine dans une microtome rotative entièrement automatisée. Couper le fragment du côlon en cinq sections de micromètres.Transférer une section du côlon dans un bain d’eau, préchauffé à 40 degrés Celsius. Utilisez la lame de verre étiquetée pour retirer la section du côlon du bain d’eau et incuber la glissade de verre à température ambiante pendant 24 heures. Tout d’abord, retirer la paraffine en incubant la lame de verre en xylène pendant cinq minutes.Répétez cette étape trois fois. Ensuite, placez la glissade en verre dans un mélange de xylène et 100% d’éthanol pendant cinq minutes. Répétez cette étape trois fois.Utilisez une série de concentrations décroissantes d’éthanol pour réhydrater la section du côlon. Plonger la glissade dans l’éthanol pendant cinq minutes. Répéter trois fois à chaque concentration avant de passer à la concentration suivante.Rincer la glissade de verre sous l’eau courante pendant cinq minutes. Réchauffer le tampon de récupération de l’antigène à 95 à 98 degrés Celsius. Chauffer ensuite la glissade de verre dans la solution de récupération d’antigène bouillante pendant 10 minutes.Pour éviter le gaspillage de rééconts, utilisez un stylo hydrophobe pour dessiner un cercle autour de la section du côlon. Ensuite, incubez la lame pendant 10 minutes dans une solution de 3% de peroxyde d’hydrogène et d’eau. Lavez la lame dans la solution de lavage pendant cinq minutes.Puis incuber la glissière dans la solution de blocage pendant une heure à température ambiante. Retirez la solution de blocage et ajoutez 20 à 50 microlitres d’anticorps primaires contre l’alpha E-R, la bêta E-R ou le G-P-E-R dilué. Incuber l’anticorps primaire pendant la nuit à quatre degrés Celsius dans l’obscurité.Retirez la solution anticorps. Lavez la lame trois fois dans la solution de lavage pendant cinq minutes à chaque fois. Ensuite, ajoutez des anticorps secondaires dilués.Incuber la lame avec un anticorps secondaire conjugué à du colorant pendant une heure à température ambiante dans l’obscurité. Retirez la solution d’anticorps secondaire de la lame. Lavez la lame trois fois dans la solution de lavage pendant cinq minutes à chaque fois.Ajouter le fluorochrome dilué pour la visualisation membranaire et incuber pendant 10 minutes à température ambiante dans l’obscurité. Retirez la solution et lavez la lame trois fois dans la solution de lavage pendant cinq minutes à chaque fois. Ajoutez quelques gouttes de DAPI liquide à base de glycérol, un fluorochrome pour la visualisation des noyaux cellulaires, directement sur la section du côlon.Couvrez-le soigneusement avec une diapositive de couverture. Incuber la section du côlon pendant au moins 24 heures à quatre degrés Celsius. Analyser la section du côlon au microscope confocal avec des objectifs 20x ou 63x et immersion d’huile.La spécificité des anticorps utilisés dans l’étude a été validée à l’aide de cellules MCF-7. Les anticorps de récepteur d’oestrogène ont permis la détection des récepteurs nucléaires d’oestrogène E-R alpha et bêta d’E-R aussi bien que le récepteur membrane-lié d’oestrogène G-P-E-R. Un contrôle négatif a également été exécuté dans lequel les cellules de MCF-7 ont été souillées seulement avec l’anticorps secondaire conjugué avec le fluorochrome et un liquide glycérol-basé avec DAPI.Un signal cytoplasmique fort de l’alpha d’E-R a été trouvé dans les sections de deux points obtenues des souris témoins et des souris avec TNBS-induits Crohn' la maladie de s. Cependant, seuls les colons obtenus à partir de souris témoins avaient E-R alpha localisé dans le cytoplasme des cellules gobelet. La microscopie confoccale a également indiqué la localisation cytoplasmique de la bêta d’E-R dans les sections de deux points des souris témoins et des souris TNBS-traitées.De même, la localisation cytoplasmique de G-P-E-R a été documentée dans les sections du côlon obtenues à partir de souris témoins et de souris traitées au TNBS. Le positionnement correct du côlon dans le moule est essentiel pour générer la section transversale correcte. Fluorochrome doit être sélectionné par son propre spectre d’excitation et d’émission.Cette méthode peut également être appliquée à d’autres protéines qui peuvent être impliquées dans le développement de la colite. La détection de l’immunohistochimie par immunofluorescence peut être étendue pour tacher d’autres protéines dans l’état de direction protéine-protéine.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Automated acoustique de distribution pour la Dilution série de Peptide Agonistes dans Potency Détermination Assays

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

Recherche

Biochimie

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Détection et visualisation des complexes protéiques induits par endommagement de l&#39;ADN dans des cultures cellulaires en suspension utilisant l&#39;essai de ligature de proximité

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Simple Elimination of Background Fluorescence in Formalin-Fixed Human Brain Tissue for Immunofluorescence Microscopy

Simple élimination de Fluorescence de fond dans les tissus cérébraux humains fixés au formol pour la microscopie en Immunofluorescence

Immunofluorescence is a common method used to visualize subcellular compartments and to determine the localization of specific proteins within a tissue ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Caractérisation des glycoprotéines dont le pli d’immunoglobuline par cristallographie aux rayons x et Techniques biophysiques

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Identification of Orexin and Endocannabinoid Receptors in Adult Zebrafish Using Immunoperoxidase and Immunofluorescence Methods

Identification des récepteurs d'orexine et d'endocannabinoïdes chez le poisson zèbre adulte à l'aide de méthodes d'immunoperoxidase et d'immunofluorescence

Immunohistochemistry (IHC) is a highly sensitive and specific technique involved in the detection of target antigens in tissue sections with labeled ...

An In Vivo Estrogen Deficiency Mouse Model for Screening Exogenous Estrogen Treatments of Cardiovascular Dysfunction After Menopause

Un modèle in vivo de souris d'insuffisance d'oestrogène pour le criblage des traitements exogènes exogènes de la dysfonction cardio-vasculaire après ménopause

Postmenopausal women are at greater risk of developing cardiovascular diseases than premenopausal women. Female mice ovariectomized (OVX) at weaning ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Interactions avec et perméabilisation des membranes des mitochondries cérébrales par amyloïde Fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  ÃƒÅ½Ã‚Â² Reporter Assay

Dépistage des phytoestrogènes à l’aide d’un récepteur d’œstrogènes à base β de Reporter Assay

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...

Transplantation of Neonatal Mouse Cardiac Macrophages into Adult Mice

Transplantation de macrophages cardiaques néonatals de souris chez des souris adultes

In an injured neonatal myocardium, macrophages facilitate cardiomyocyte proliferation and angiogenesis and promote heart regeneration. The present study ...