Name: visualization of estrogen receptors in colons of mice with tnbs-induced crohn's disease using immunofluorescence
Uploaded: 2020-03-12T12:30:00
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Die Arbeit wurde dank der finanziellen Unterstützung der Behörden der Universität Lodz veröffentlicht: Vizerektor für wissenschaftliche Forschung, Vizerektor für nationale und internationale Zusammenarbeit und Dekan der Fakultät für Biologie und Umweltschutz. Damian Jacenik wurde durch Stipendien (2017/24/T/NZ5/00045 und 2015/17/N/NZ5/00336) vom National Science Centre, Polen, unterstützt.

Tierexperimentelle Studien wurden mit Zustimmung des Lokalen Ethikausschusses (28/B29/2016) gemäß der Richtlinie 2010/63/EU des Europäischen Parlaments und des Rates vom 22. September 2010 und institutionellen Empfehlungen durchgeführt.
1. TNBS-induziertes murines Modell der Morbus Crohn
HINWEIS: Dieses Protokoll verwendet männliche BALB/C-Mäuse mit einem Gewicht von 25-28 g. Tiere werden bei einer konstanten Temperatur (22-24 °C) und, relative Luftfeuchtigkeit...

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	<li>Zhang, Y. Z., Li, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+bowel+disease:+pathogenesis.">Inflammatory bowel disease: pathogenesis.</a> World Journal of Gastroenterology. 20 (1), 91-99 (2014).</li><li>Morris, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hapten-induced+model+of+chronic+inflammation+and+ulceration+in+the+rat+colon.">Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon.</a> Gastroenterology. 96 (3), 795-803 (1989).</li><li>Okayasu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+in+the+induction+of+reliable+experimental+acute+and+chronic+ulcerative+colitis+in+mice.">A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice.</a> Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).</li><li>Boirivant, M., Fuss, I. J., Chu, A., Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxazolone+colitis:+a+murine+model+of+T+helper+cell+type+2+colitis+treatable+with+antibodies+to+interleukin+4.">Oxazolone colitis: a murine model of T helper cell type 2 colitis treatable with antibodies to interleukin 4.</a> Journal of Experimental Medicine. 188 (10), 1929-1939 (1998).</li><li>Morrissey, P. J., Charrier, K., Braddy, S., Liggitt, D., Watson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4++T+cells+that+express+high+levels+of+CD45RB+induce+wasting+disease+when+transferred+into+congenic+severe+combined+immunodeficient+mice.+Disease+development+is+prevented+by+cotransfer+of+purified+CD4++T+cells.">CD4+ T cells that express high levels of CD45RB induce wasting disease when transferred into congenic severe combined immunodeficient mice. Disease development is prevented by cotransfer of purified CD4+ T cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 178 (1), 237-244 (1993).</li><li>K&#252;hn, R., L&#246;hler, J., Rennick, D., Rajewsky, K., M&#252;ller, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-10-deficient+mice+develop+chronic+enterocolitis.">Interleukin-10-deficient mice develop chronic enterocolitis.</a> Cell. 75 (2), 263-274 (1993).</li><li>Sundberg, J. P., Elson, C. O., Bedigian, H., Birkenmeier, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous,+heritable+colitis+in+a+new+substrain+of+C3H/HeJ+mice.">Spontaneous, heritable colitis in a new substrain of C3H/HeJ mice.</a> Gastroenterology. 107 (6), 1726-1735 (1994).</li><li>Harnish, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beneficial+effects+of+estrogen+treatment+in+the+HLA-B27+transgenic+rat+model+of+inflammatory+bowel+disease.">Beneficial effects of estrogen treatment in the HLA-B27 transgenic rat model of inflammatory bowel disease.</a> American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 286 (1), 118-125 (2004).</li><li>Pierdominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+estrogen+receptor+&#946;+expression+with+inflammatory+bowel+disease+activity.">Linking estrogen receptor &#946; expression with inflammatory bowel disease activity.</a> Oncotarget. 6 (38), 40443-40451 (2015).</li><li>W&#322;odarczyk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-coupled+receptor+30+(GPR30)+expression+pattern+in+inflammatory+bowel+disease+patients+suggests+its+key+role+in+the+inflammatory+process.+A+preliminary+study.">G protein-coupled receptor 30 (GPR30) expression pattern in inflammatory bowel disease patients suggests its key role in the inflammatory process. A preliminary study.</a> Journal of Gastrointestinal and Liver Diseases. 26 (1), 29-35 (2017).</li><li>Mohammad, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+receptor+&#945;+contributes+to+T+cell-mediated+autoimmune+inflammation+by+promoting+T+cell+activation+and+proliferation.">Estrogen receptor &#945; contributes to T cell-mediated autoimmune inflammation by promoting T cell activation and proliferation.</a> Science Signaling. 11 (526), eaap9415 (2018).</li><li>Jacenik, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-coupled+estrogen+receptor+mediates+anti-inflammatory+action+in+Crohn's+disease.">G protein-coupled estrogen receptor mediates anti-inflammatory action in Crohn's disease.</a> Scientific Reports. 9 (1), 6749 (2019).</li><li>Prossnitz, E. R., Barton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+G+protein-coupled+estrogen+receptor+GPER+in+health+and+disease.">The G protein-coupled estrogen receptor GPER in health and disease.</a> Nature Review Endocrinology. 7 (12), 715-726 (2011).</li><li>Ya&#351;ar, P., Ayaz, G., User, S. D., G&#252;p&#252;r, G., Muyan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+estrogen-estrogen+receptor+signaling.">Molecular mechanisms of estrogen-estrogen receptor signaling.</a> Reproductive Medicine and Biology. 16 (1), 4-20 (2016).</li><li>Pizarro, T. T., Arseneau, K. O., Bamias, G., Cominelli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+the+study+of+Crohn's+disease.">Mouse models for the study of Crohn's disease.</a> Trends in Molecular Medicine. 9 (5), 218-222 (2003).</li><li>Neurath, M. F., Fuss, I., Kelsall, B. L., St&#252;ber, E., Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+interleukin+12+abrogate+established+experimental+colitis+in+mice.">Antibodies to interleukin 12 abrogate established experimental colitis in mice.</a> Journal of Experimental Medicine. 182 (5), 1281-1290 (1995).</li><li>Ikeda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simvastatin+attenuates+trinitrobenzene+sulfonic+acid-induced+colitis,+but+not+oxazalone-induced+colitis.">Simvastatin attenuates trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis, but not oxazalone-induced colitis.</a> Digestive Diseases and Sciences. 53 (7), 1869-1875 (2007).</li><li>Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Elizabeth, J., Rao, U. K., Ranganathan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+physical+basics+of+routine+formaldehyde+fixation.">Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation.</a> Journal of Oral Maxillofacial Pathology. 16 (3), 400-405 (2012).</li></ol>

Es gibt zahlreiche Tiermodelle für die IBD-Pathophysiologie-Untersuchung, einschließlich genetischer, immunologischer oder spontaner Modelle, sowie chemisch induzierte Modelle15. Unter den verschiedenen Arten von Tiermodellen von Colitis sind chemisch induzierte Modelle wie das in diesem Protokoll beschriebene TNBS-induzierte Modell relativ kostengünstig und leicht zu erhalten. Das TNBS-induzierte murine Modell der Kolitis hat mehrere klinische Symptome im Zusammenhang mit der pathologischen Ba...

Morbus Crohn (CD) ist eine entzündliche Darmerkrankung (IBD), die sich als chronische Darmentzündung manifestiert. Die Ätiologie von CD ist schlecht verstanden, aber es gibt ein paar wichtige Faktoren, die für die CD-Entwicklung verantwortlich zu sein scheinen, einschließlich Darmmikrobiota, und genetische und Umweltfaktoren, wie Ernährung oder Stress1. Für ein besseres Verständnis der Pathogenese der Morbus Crohn wurden mehrere Modelle der Darmentzündung verwendet2,3,4,5,6,7. In diesem Artikel stellen wir Ergebnisse aus einem 2,4,6-Trinitrobenzol-Sulfonsäure (TNBS)-induzierten murinen Modell von CD.
Es wurde dokumentiert, dass Östrogene in der Lage sind, chronischeDarmentzündungen 8,9,10,11,12zu modulieren. Die biologische Aktivität von Östrogenen wird durch Cogat-Rezeptoren vermittelt, darunter kernnukleare Östrogenrezeptoren (ERs), d.h. ER (Gen ESR1) und ER (Gen ESR2), sowie G-Protein-gekoppelte Östrogenrezeptor, d.h. GPER (Gen GPER1), genannt als membrangebundener ER13,14. Es gibt mehrere Methoden zur Bestimmung des Niveaus der Östrogen-Rezeptoren, aber nur wenige können verwendet werden, um sie im Darm zu visualisieren.
Immunhistochemie (IHC) ist eine weit verbreitete Methode in klinischen und grundlegenden Studien zum Nachweis bestimmter Antigene in Zellen oder Geweben mit fluorchromkonjugierten Antikörpern. IHC scheint eine wichtige Methode in der Gewebestrukturvisualisierung zu sein, sowie bei der Identifizierung und Lokalisierung spezifischer Proteine, die für das Verständnis der Entwicklung von Kolitis entscheidend sein können. Hier stellen wir ein vollständiges und validiertes Protokoll zur immunhistochemischen Visualisierung von Östrogenrezeptoren im Darm unter Verwendung von Immunfluoreszenz vor.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Animals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/C mice</td>
			<td>University of Lodz</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62379-531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardboard block</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope - TCS SP8</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fully automated rotary microtome - RM2255</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J1800BMNT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated Paraffin Embedding Module - EG1150 H</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histological box</td>
			<td>Marfour</td>
			<td>LN.138747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic pen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z377821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory balance</td>
			<td>Radwag</td>
			<td>WL-104-0048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X software</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal mold</td>
			<td>Marfour</td>
			<td>CP.5105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile gauze</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile scissor</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile tweezer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue processor - TP1020</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2, 4, 6-trinitrobenzene sulfonic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>92822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiOC6 (3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>318426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DyLight 650 secondary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab96886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ER&#945; primary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab75635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ER&#946; primary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab3576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>396480111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>432173111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GPER primary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab39742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>575283421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxidase</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>885193111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane (forane)</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>1001936040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16210064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>39602012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petrie dish</td>
			<td>Nest Scientific</td>
			<td>705001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Physiological saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin (antibiotic)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifage Mountant with DAPI (glycerol-based liquid with DAPI)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Chempur</td>
			<td>WE/231-598-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>795780429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>853470115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>BA0860119</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of estrogen receptors in colons of mice with tnbs-induced crohn's disease using immunofluorescence

Morbus Crohn ist die am häufigsten diagnostizierte Art von entzündlicher Darmerkrankung. Chronische Entzündungen, die sich im Darm entwickeln, führen zu Peristalsienstörungen und Schäden an Darmschleimhaut und scheinen mit einem erhöhten Risiko einer neoplastischen Umwandlung des Dickdarms verbunden zu sein. Akkumulierende Beweise deuten darauf hin, dass Östrogene und Östrogen-Rezeptoren nicht nur hormonempfindliche Gewebe beeinflussen, sondern auch andere Gewebe, die nicht direkt mit Östrogenen verwandt sind, wie die Lunge oder dickdarm. Hier beschreiben wir das Protokoll für die erfolgreiche Immunfluoreszenzfärbung von Östrogenrezeptoren im Dickdarm, das aus einem murinen Modell der TNBS-induzierten Morbus Crohn gewonnen wurde. Ein detailliertes Protokoll zur Induktion der Morbus Crohn bei Mäusen und Darmpräparation ist sowie ein schrittweises immunhistochemisches Verfahren mit formalinfixierten Paraffin-eingebetteten Darmabschnitten vorgesehen. Die beschriebenen Methoden sind nicht nur nützlich für Östrogen-Rezeptor-Detektion und Östrogen-Signalisierung Untersuchung in vivo, sondern kann auch auf andere Proteine angewendet werden, die an der Entwicklung von Colitis beteiligt sein können.

Makroskopische Merkmale von Dickdarmerkrankungen bei Mäusen mit TNBS-induzierter Morbus Crohn Repräsentative Bilder von Dickdarmen, die von der Kontrolle genommen wurden, und TNBS-behandelten Mäusen sind in Abbildung 2dargestellt. Bei Mäusen mit einem TNBS-induzierten Modell der Morbus Crohn wird die Länge des Dickdarms reduziert, während die Breite des Dickdarms erhöht wird.
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Visualization of Estrogen Receptors in Colons of Mice with TNBS-Induced Crohn's Disease using Immunofluorescence

Das Protokoll stellt ein vollständig validiertes TNBS-induziertes murines Modell der Morbus Crohn und Methoden zur Visualisierung von Östrogenrezeptoren durch Immunhistochemie unter Verwendung der Immunfluoreszenz formalinfixierter Dickdarmabschnitte dar, die in Paraffin eingebettet sind.

Visualisierung von Östrogenrezeptoren bei Mäusen mit TNBS-induzierter Morbus Crohn mit Immunfluoreszenz

Crohn&#39;s disease is the most diagnosed type of inflammatory bowel disease. Chronic inflammation developing in the intestine leads to peristalsis ...

Zunehmende Beweise deuten darauf hin, dass die Auswirkungen der Östrogen-Signalisierung auf den kolonischen Teil der Physiologie, Immunhistochemie ist eine vielversprechende Technik zur Identifizierung von Östrogen-Rezeptoren im Dickdarm und sie entwickeln sich zu Kolitis. Wir präsentieren ein vollständiges und validiertes Protokoll zur immunhistochemischen Visualisierung von Östrogenrezeptoren im Dickdarm unter Verwendung von Immunfluoreszenz. Gemeinsam mit Dr.Sylwia Michlewska vom Labor für Mikroskopische Bildgebung der Universität Lodz werden wir das Verfahren demonstrieren.Legen Sie den Doppelpunkt in eine Petrischale. Schneiden Sie den Doppelpunkt in ein bis zwei Zentimeter Fragmente. Legen Sie jedes Fragment auf einen Schwamm in einer entsprechend beschrifteten histologischen Kassette.Legen Sie eine Kassette mit einem Dickdarmfragment in 4%Paraformaldehyd. Mindestens 24 Stunden bei vier Grad Celsius inkubieren. Bereiten Und programmieren Sie den Gewebeprozessor nur für eine Stunde Inkubation in 50%70%90%95% und 100%ethanol, Xylol 100% Ethanol und Xylol sowie für mindestens drei Stunden Inkubation in flüssigem Paraffin.Übertragen Sie das Doppelpunktfragment in eine histologische Box. Legen Sie die Box in den vorprogrammierten Tissueprozessor und führen Sie den Prozessor aus. Nach der Inkubation im Gewebeprozessor entfernen Sie den Dickdarm aus der histologischen Box und legen Sie das Doppelpunktfragment in eine Metallform, so dass sich die beiden Enden des Dickdarms in einer aufrechten Position befinden.Füllen Sie ein Drittel der Form mit flüssigem Paraffin. Legen Sie die Form im Kühlbereich bei minus fünf Grad Celsius für ein paar Sekunden und bewegen Sie die Form dann in den Wärmebereich bei 70 Grad Celsius. Legen Sie dann die Form in den unteren Teil der histologischen Box und bedecken Sie das gesamte Dickdarmfragment mit flüssigem Paraffin.Legen Sie die Metallform mit dem Dickdarmfragment und Paraffin für ein paar Minuten in den Kühlbereich. Dann entfernen Sie die Metallform aus dem Doppelpunkt und Paraffinblock. Inkubieren Sie den Dickdarm- und Paraffinblock für mindestens 24 Stunden bei vier Grad Celsius.Entfernen Sie nach der Inkubation überschüssiges Paraffin aus dem Block. Setzen Sie den Dickdarm- und Paraffinblock in ein vollautomatisches Rotationsmikrotom ein. Schneiden Sie das Doppelpunktfragment in fünf Mikrometerabschnitte.Übertragen Sie einen Dickdarmabschnitt in ein Wasserbad, vorgewärmt auf 40 Grad Celsius. Verwenden Sie die beschriftete Glasrutsche, um den Doppelpunktabschnitt aus dem Wasserbad zu entfernen und die Glasrutsche 24 Stunden lang bei Raumtemperatur zu bebrüten. Entfernen Sie zunächst das Paraffin, indem Sie die Glasrutsche fünf Minuten lang in Xylol brüten.Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal. Dann die Glasrutsche fünf Minuten lang in eine Eins-zu-Eins-Mischung aus Xylol und 100%Ethanol geben. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal.Verwenden Sie eine Reihe von abnehmenden Ethanolkonzentrationen, um den Dickdarmabschnitt zu rehydrieren. Tauchen Sie die Rutsche für fünf Minuten in das Ethanol ein. Wiederholen Sie dies dreimal bei jeder Konzentration, bevor Sie zur nächsten Konzentration übergehen.Spülen Sie die Glasrutsche fünf Minuten lang unter fließendem Wasser. Den Antigen-Abrufpuffer auf 95 bis 98 Grad Celsius aufheizen. Dann erhitzen Sie die Glasrutsche in kochender Antigen-Retrieval-Lösung für 10 Minuten.Um die Verschwendung von Reagenzien zu vermeiden, verwenden Sie einen hydrophoben Stift, um einen Kreis um den Dickdarmabschnitt zu ziehen. Dann inkubieren Sie die Rutsche für 10 Minuten in einer 3%-Lösung von Wasserstoffperoxidase und Wasser. Waschen Sie die Rutsche in Waschlösung für fünf Minuten.Dann inkubieren Sie die Rutsche in Blockierlösung für eine Stunde bei Raumtemperatur. Entfernen Sie die Blockierlösung und fügen Sie 20 bis 50 Mikroliter Primärantikörper gegen E-R alpha, E-R beta oder G-P-E-R verdünnt hinzu. Inkubieren Sie den primären Antikörper über Nacht bei vier Grad Celsius in der Dunkelheit.Entfernen Sie die Antikörperlösung. Waschen Sie die Rutsche dreimal in Waschlösung für jeweils fünf Minuten. Als Nächstes fügen Sie verdünnten sekundären Antikörper hinzu.Inkubieren Sie die Rutsche mit sekundärem Antikörper, der bei Raumtemperatur bei Dunkelheit eine Stunde lang mit Farbstoff konjugiert ist. Entfernen Sie die sekundäre Antikörperlösung aus der Folie. Waschen Sie die Rutsche dreimal in Waschlösung für jeweils fünf Minuten.Fügen Sie verdünntes Fluorchrom zur Membranvisualisierung hinzu und brüten Sie 10 Minuten bei Raumtemperatur bei Dunkelheit. Entfernen Sie die Lösung und waschen Sie die Rutsche dreimal in Waschlösung für jeweils fünf Minuten. Fügen Sie ein paar Tropfen Glyzerin-basierte flüssige DAPI, ein Fluorchrom für die Visualisierung von Zellkernen, direkt auf dem Doppelpunktabschnitt hinzu.Bedecken Sie es sorgfältig mit einem Deckelschlitten. Inkubieren Sie den Dickdarmabschnitt für mindestens 24 Stunden bei vier Grad Celsius. Analysieren Sie den Dickdarmbereich unter einem konfokalen Mikroskop mit 20x oder 63x Objektiven und Öleintauchen.Die Spezifität der in der Studie verwendeten Antikörper wurde mit MCF-7-Zellen validiert. Die Östrogen-Rezeptor-Antikörper ermöglichten den Nachweis von kernnuklearen Östrogen-Rezeptoren E-R alpha und E-R Beta sowie der membrangebundene Östrogen-Rezeptor G-P-E-R. Eine negative Kontrolle wurde auch durchgeführt, bei der MCF-7-Zellen nur mit sekundären Antikörpern, die mit Fluorchrom konjugiert waren, und einer Flüssigflüssigkeit auf Glycerinbasis mit DAPI gefärbt wurden.Ein starkes zytoplasmatisches Signal von E-R alpha wurde in den Dickdarmabschnitten gefunden, die von Kontrollmäusen und von Mäusen mit TNBS-induzierter Morbus Crohn gewonnen wurden. Allerdings hatten nur die Doppelpunkte, die von Kontrollmäusen erhalten wurden, E-R alpha lokalisiert im Kelchenzellzytoplasma. Die konfokale Mikroskopie zeigte auch die zytoplasmatische Lokalisation von E-R Beta in den Dickdarmabschnitten sowohl der Kontrolle als auch der MittBS behandelten Mäuse.In ähnlicher Weise wurde die zytoplasmatische Lokalisation von G-P-E-R in den Dickdarmabschnitten dokumentiert, die von Kontrollmäusen und den mit TNBS behandelten Mäusen gewonnen wurden. Die korrekte Positionierung des Doppelpunkts in der Form ist wichtig, um den richtigen Querschnitt zu erzeugen. Fluorchrom sollte durch sein eigenes Anregungs- und Emissionsspektrum ausgewählt werden.Diese Methode kann auch auf andere Proteine angewendet werden, die an der Entwicklung von Kolitis beteiligt sein können. Der Immunhistochemie-Nachweis durch Immunfluoreszenz kann erweitert werden, um andere Proteine im Protein-Protein-Richtungsstatus zu färben.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Automatische Acoustic Verzicht für die serielle Verdünnung von Peptid-Agonisten im Potency Bestimmung Assays

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

Forschung

Biochemie

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Nachweis und Visualisierung von DNA-schadeninduzierten Proteinkomplexen in Suspensionszellkulturen unter Verwendung des Proximity Ligation Assays

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Simple Elimination of Background Fluorescence in Formalin-Fixed Human Brain Tissue for Immunofluorescence Microscopy

Einfache Beseitigung von Hintergrundfluoreszenz in Formalin fixiert menschliche Gehirngewebe für die Immunfluoreszenz-Mikroskopie

Immunofluorescence is a common method used to visualize subcellular compartments and to determine the localization of specific proteins within a tissue ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Charakterisierung von Glykoproteinen mit dem Immunglobulin-Falz durch Röntgen-Kristallographie und biophysikalischen Techniken

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Identification of Orexin and Endocannabinoid Receptors in Adult Zebrafish Using Immunoperoxidase and Immunofluorescence Methods

Identifizierung von Orexin- und Endocannabinoidrezeptoren bei erwachsenen Zebrafischen mit Immunoperoxidase und Immunfluoreszenzmethoden

Immunohistochemistry (IHC) is a highly sensitive and specific technique involved in the detection of target antigens in tissue sections with labeled ...

An In Vivo Estrogen Deficiency Mouse Model for Screening Exogenous Estrogen Treatments of Cardiovascular Dysfunction After Menopause

Ein In Vivo Östrogen-Mangel-Maus-Modell zum Screening exogener Östrogen-Behandlungen von Kardiovaskulärer Dysfunktion nach den Wechseljahren

Postmenopausal women are at greater risk of developing cardiovascular diseases than premenopausal women. Female mice ovariectomized (OVX) at weaning ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Wechselwirkungen mit und Membranpermeabilisierung des Gehirns Mitochondrien durch Amyloid Fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  ÃƒÅ½Ã‚Â² Reporter Assay

Screening auf Phytoöstrogene mit einem Zell-basierten Östrogen-Rezeptor β Reporter Assay

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...

Transplantation of Neonatal Mouse Cardiac Macrophages into Adult Mice

Transplantation von neonatalen Maus-Herzmakrophagen in erwachsene Mäuse

In an injured neonatal myocardium, macrophages facilitate cardiomyocyte proliferation and angiogenesis and promote heart regeneration. The present study ...