Name: visualization of estrogen receptors in colons of mice with tnbs-induced crohn's disease using immunofluorescence
Uploaded: 2020-03-12T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Estrogen Receptors in Colons of Mice with TNBS-Induced Crohn's Disease using Immunofluorescence at JoVE.com

העבודה פורסמה בזכות התמיכה הכספית של הרשויות באוניברסיטת לודז ': סגן הרקטור למחקר מדעי, סגן הרקטור לשיתוף פעולה לאומי ובינלאומי ודיקן הפקולטה לביולוגיה והגנת הסביבה. דמיאן ז'זניק נתמך על ידי מענקים (2017/24/T/NZ5/00045 ו-2015/17/N/NZ5/00336) מהמרכז הלאומי למדעים, פולין.

מחקרי בעלי חיים נערכו בהסכמת הוועדה האתית המקומית (28/ל2016) בהתאם לצו 2010/63/האיחוד האירופי של הפרלמנט האירופי ולמועצת ספטמבר 22, 2010 והמלצות מוסדיים.
1. TNBS המושרה מודל מורטין של מחלת קרוהן
הערה: פרוטוקול זה משתמש בעכברים מסוג BALB/C ששוקל 25-28 g. בעלי חיים שוכנו בטמפרטורה ?...

<ol>
	<li>Zhang, Y. Z., Li, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+bowel+disease:+pathogenesis.">Inflammatory bowel disease: pathogenesis.</a> World Journal of Gastroenterology. 20 (1), 91-99 (2014).</li><li>Morris, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hapten-induced+model+of+chronic+inflammation+and+ulceration+in+the+rat+colon.">Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon.</a> Gastroenterology. 96 (3), 795-803 (1989).</li><li>Okayasu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+in+the+induction+of+reliable+experimental+acute+and+chronic+ulcerative+colitis+in+mice.">A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice.</a> Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).</li><li>Boirivant, M., Fuss, I. J., Chu, A., Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxazolone+colitis:+a+murine+model+of+T+helper+cell+type+2+colitis+treatable+with+antibodies+to+interleukin+4.">Oxazolone colitis: a murine model of T helper cell type 2 colitis treatable with antibodies to interleukin 4.</a> Journal of Experimental Medicine. 188 (10), 1929-1939 (1998).</li><li>Morrissey, P. J., Charrier, K., Braddy, S., Liggitt, D., Watson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4++T+cells+that+express+high+levels+of+CD45RB+induce+wasting+disease+when+transferred+into+congenic+severe+combined+immunodeficient+mice.+Disease+development+is+prevented+by+cotransfer+of+purified+CD4++T+cells.">CD4+ T cells that express high levels of CD45RB induce wasting disease when transferred into congenic severe combined immunodeficient mice. Disease development is prevented by cotransfer of purified CD4+ T cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 178 (1), 237-244 (1993).</li><li>K&#252;hn, R., L&#246;hler, J., Rennick, D., Rajewsky, K., M&#252;ller, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-10-deficient+mice+develop+chronic+enterocolitis.">Interleukin-10-deficient mice develop chronic enterocolitis.</a> Cell. 75 (2), 263-274 (1993).</li><li>Sundberg, J. P., Elson, C. O., Bedigian, H., Birkenmeier, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous,+heritable+colitis+in+a+new+substrain+of+C3H/HeJ+mice.">Spontaneous, heritable colitis in a new substrain of C3H/HeJ mice.</a> Gastroenterology. 107 (6), 1726-1735 (1994).</li><li>Harnish, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beneficial+effects+of+estrogen+treatment+in+the+HLA-B27+transgenic+rat+model+of+inflammatory+bowel+disease.">Beneficial effects of estrogen treatment in the HLA-B27 transgenic rat model of inflammatory bowel disease.</a> American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 286 (1), 118-125 (2004).</li><li>Pierdominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+estrogen+receptor+&#946;+expression+with+inflammatory+bowel+disease+activity.">Linking estrogen receptor &#946; expression with inflammatory bowel disease activity.</a> Oncotarget. 6 (38), 40443-40451 (2015).</li><li>W&#322;odarczyk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-coupled+receptor+30+(GPR30)+expression+pattern+in+inflammatory+bowel+disease+patients+suggests+its+key+role+in+the+inflammatory+process.+A+preliminary+study.">G protein-coupled receptor 30 (GPR30) expression pattern in inflammatory bowel disease patients suggests its key role in the inflammatory process. A preliminary study.</a> Journal of Gastrointestinal and Liver Diseases. 26 (1), 29-35 (2017).</li><li>Mohammad, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+receptor+&#945;+contributes+to+T+cell-mediated+autoimmune+inflammation+by+promoting+T+cell+activation+and+proliferation.">Estrogen receptor &#945; contributes to T cell-mediated autoimmune inflammation by promoting T cell activation and proliferation.</a> Science Signaling. 11 (526), eaap9415 (2018).</li><li>Jacenik, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-coupled+estrogen+receptor+mediates+anti-inflammatory+action+in+Crohn's+disease.">G protein-coupled estrogen receptor mediates anti-inflammatory action in Crohn's disease.</a> Scientific Reports. 9 (1), 6749 (2019).</li><li>Prossnitz, E. R., Barton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+G+protein-coupled+estrogen+receptor+GPER+in+health+and+disease.">The G protein-coupled estrogen receptor GPER in health and disease.</a> Nature Review Endocrinology. 7 (12), 715-726 (2011).</li><li>Ya&#351;ar, P., Ayaz, G., User, S. D., G&#252;p&#252;r, G., Muyan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+estrogen-estrogen+receptor+signaling.">Molecular mechanisms of estrogen-estrogen receptor signaling.</a> Reproductive Medicine and Biology. 16 (1), 4-20 (2016).</li><li>Pizarro, T. T., Arseneau, K. O., Bamias, G., Cominelli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+the+study+of+Crohn's+disease.">Mouse models for the study of Crohn's disease.</a> Trends in Molecular Medicine. 9 (5), 218-222 (2003).</li><li>Neurath, M. F., Fuss, I., Kelsall, B. L., St&#252;ber, E., Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+interleukin+12+abrogate+established+experimental+colitis+in+mice.">Antibodies to interleukin 12 abrogate established experimental colitis in mice.</a> Journal of Experimental Medicine. 182 (5), 1281-1290 (1995).</li><li>Ikeda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simvastatin+attenuates+trinitrobenzene+sulfonic+acid-induced+colitis,+but+not+oxazalone-induced+colitis.">Simvastatin attenuates trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis, but not oxazalone-induced colitis.</a> Digestive Diseases and Sciences. 53 (7), 1869-1875 (2007).</li><li>Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Elizabeth, J., Rao, U. K., Ranganathan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+physical+basics+of+routine+formaldehyde+fixation.">Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation.</a> Journal of Oral Maxillofacial Pathology. 16 (3), 400-405 (2012).</li></ol>

ישנם מודלים רבים של בעלי חיים עבור בדיקה פתופסולוגיה IBD, כולל גנטי, מודלים אימונולוגיים או ספונטנית, כמו גם דגמים המושרה כימית15. בין מספר סוגים של מודלים בעלי חיים של קוליטיס, כימית המושרה מודלים כגון מודל TNBS המושרה המתואר בפרוטוקול זה, הם זולים יחסית וקל להשיג. המודל המושרה TNBS ...

קרוהן (CD) היא מחלת מעיים דלקתית (IBD) הנראית כמו דלקת המעי כרונית. האטיולוגיה של תקליטור הוא הבין בצורה גרועה, אבל יש כמה גורמים עיקריים שנראים להיות אחראי על פיתוח תקליטורים, כולל microbiota המעי, וגורמים גנטיים וסביבתיים, כגון דיאטה או מתח1. להבנה טובה יותר של הפתוגנזה של מחלת קרוהן, מודלים שונים של דלקת במעיים שימשו2,3,4,5,6,7. במאמר זה, אנו מציגים את התוצאות שהתקבלו מ 2, 4, 6-trinitrobenzene נזן חומצה sulfonic (TNBS)-מודל murine המושרה של תקליטור.
זה תועד כי אסטרוגנים מסוגלים למודולט דלקת מעיים כרונית8,9,10,11,12. הפעילות הביולוגית של אסטרוגנים מתווכת על ידי קולטנים קנצוני, ביניהם הם קולטני אסטרוגן גרעיני (ERs), כלומר, erα (ג ' ין ESR1) ו ERβ (גנים ESR2), כמו גם G חלבון מצמידים קולטן אסטרוגן, כלומר, gper (גנים GPER1), המכונה ממברנה מאוגד ER13,14. ישנן מספר שיטות לקביעת רמת קולטני אסטרוגן, אבל רק מעטים יכולים לשמש כדי להמחיש אותם במעי.
אימונוהיסטוכימיה (IHC) היא שיטה נפוצה במחקרים קליניים ובסיסיים לאיתור אנטיגנים מסוימים בתאים או ברקמות עם נוגדנים מצוונים fluorochrome. IHC נראה שיטה חשובה הדמיית מבנה רקמות, כמו גם זיהוי ולוקליזציה של חלבונים ספציפיים, אשר עשוי להיות קריטי להבנת ההתפתחות של קוליטיס. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מלא ומאומת עבור הדמיה אימונוהיסטוכימיה של קולטני אסטרוגן במעי באמצעות immunofluorescence.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Animals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/C mice</td>
			<td>University of Lodz</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62379-531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardboard block</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope - TCS SP8</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fully automated rotary microtome - RM2255</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J1800BMNT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated Paraffin Embedding Module - EG1150 H</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histological box</td>
			<td>Marfour</td>
			<td>LN.138747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic pen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z377821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory balance</td>
			<td>Radwag</td>
			<td>WL-104-0048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X software</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal mold</td>
			<td>Marfour</td>
			<td>CP.5105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile gauze</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile scissor</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile tweezer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue processor - TP1020</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2, 4, 6-trinitrobenzene sulfonic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>92822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiOC6 (3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>318426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DyLight 650 secondary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab96886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ER&#945; primary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab75635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ER&#946; primary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab3576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>396480111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>432173111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GPER primary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab39742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>575283421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxidase</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>885193111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane (forane)</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>1001936040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16210064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>39602012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petrie dish</td>
			<td>Nest Scientific</td>
			<td>705001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Physiological saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin (antibiotic)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifage Mountant with DAPI (glycerol-based liquid with DAPI)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Chempur</td>
			<td>WE/231-598-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>795780429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>853470115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>BA0860119</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of estrogen receptors in colons of mice with tnbs-induced crohn's disease using immunofluorescence

קרוהן היא הסוג האובחן ביותר של מחלת המעי הדלקתית. דלקת כרונית המתפתחת במעי מוביל להפרעה הפריסטלזיס ולנזק של רירית המעי ונראה להיות משויך לסיכון מוגבר של שינוי המעי הגס הנאופלסטי. צבירת ראיות עולה כי אסטרוגנים וקולטנים אסטרוגן להשפיע לא רק רקמות הורמונלי רגיש, אלא גם רקמות אחרות לא קשור ישירות אסטרוגנים, כגון הריאות או המעי הגס. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול לצביעת החיסונית מוצלחת של קולטני אסטרוגן במעי הגס המתקבל ממודל murine של מחלת קרוהן המושרה. פרוטוקול מפורט אינדוקציה של מחלת קרוהן בעכברים והכנה למעיים מסופק, כמו גם צעד אחר צעד אימונוהיסטוכימיקלים הליך באמצעות formalin קבוע-מקטעים המעי מוטבע. השיטות שתוארו הם לא רק שימושי לזיהוי קולטן אסטרוגן החקירה איתות אסטרוגן ב vivo אבל יכול גם להיות מיושם על חלבונים אחרים אשר עשויים להיות מעורבים בפיתוח של קוליטיס.

המאפיינים המקסקופיים של נקודתיים בעכברים עם מחלת קרוהן הנגרמת על ידי TNBS תמונות מייצגות של נקודתיים שנלקחו מהפקד ועכברים שטופלו ב-TNBS מוצגים באיור 2. בעכברים עם מודל TNBS המושרה של מחלת קרוהן, אורך המעי הגס מופחת בעוד רוחב המעי הגס הוא גדל.
<p class="jo...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Estrogen Receptors in Colons of Mice with TNBS-Induced Crohn's Disease using Immunofluorescence at JoVE.com

Visualization of Estrogen Receptors in Colons of Mice with TNBS-Induced Crohn's Disease using Immunofluorescence

הפרוטוקול מציג מודל מאומת TNBS המושרה מלאה של מחלת קרוהן ושיטות עבור ויזואליזציה של קולטני אסטרוגן על ידי אימונוהיסטוכימיה באמצעות immunofluorescence מקטעים נקודתיים קבוע מוטבע פרפין.

ויזואליזציה של קולטני אסטרוגן נקודותיים של עכברים עם TNBS המושרה מחלת קרוהן באמצעות Immunofluorescence

Crohn&#39;s disease is the most diagnosed type of inflammatory bowel disease. Chronic inflammation developing in the intestine leads to peristalsis ...

הגדלת הראיות מרמזת על ההשפעה של איתות אסטרוגן על החלק המעי הגס של הפיזיולוגיה, אימונוהיסטוכימיה היא טכניקה מבטיחה לזיהוי קולטני אסטרוגן במעי הגס והם מתפתחים קוליטיס. אנו מציגים פרוטוקול מלא מאומת עבור הדמיה אימונוהיסטוכימית של קולטני אסטרוגן במעי הגס, באמצעות immunofluorescence. יחד עם ד"ר סילביה מיכלווסקה מהמעבדה להדמיה מיקרוסקופית של אוניברסיטת לודז', נדגים את ההליך.מניחים את המעי הגס בצלחת פטרי. חותכים את המעי הגס לרסיס אחד עד שני סנטימטרים. מניחים כל שבר על ספוג בקלטת היסטולוגית המסומנות כראוי.מקם קלטת המכילה שבר נקודתיים ב- 4%paraformaldehyde. דגירה לפחות 24 שעות בארבע מעלות צלזיוס. הכן ותכנת את מעבד הרקמה לשעה אחת של דגירה ב- 50%70%90%95%ו- 100%אתנול, קסילן 100% אתנול וקצילן בלבד, וכן למשך שלוש שעות לפחות של דגירה בפרפין נוזלי.העבר את שבר המעי הגס לקופסה היסטולוגית. מקם את התיבה במעבד הרקמות המתוכנת מראש והפעל את המעבד. לאחר הדגירה במעבד הרקמות מוציאים את המעי הגס מהתיבה ההיסטולוגית וממקם את שבר המעי הגס בתבנית מתכת, כך ששני קצות המעי הגס נמצאים במצב זקוף.ממלאים שליש מהתבנית בפרפין נוזלי. מניחים את התבנית באזור הקירור במינוס חמש מעלות צלזיוס לכמה שניות ולאחר מכן להעביר את התבנית לאזור ההתחממות ב 70 מעלות צלזיוס. לאחר מכן מניחים את התבנית בחלק התחתון של התיבה ההיסטולוגית ומכסים את כל שבר המעי הגס בפרפין נוזלי.מניחים את תבנית המתכת המכילה את שבר המעי הגס ופרפין באזור הקירור במשך כמה דקות. לאחר מכן להסיר את עובש המתכת מן המעי הגס ואת בלוק פרפין. דגירה קולון וגוש פרפין לפחות 24 שעות בארבע מעלות צלזיוס.לאחר הדגירה, להסיר פרפין עודף מהבלוק. הכנס את המעי הגס וגוש הפרפין למיקרוטום סיבובי אוטומטי לחלוטין. חותכים את שבר המעי הגס לחמישה מקטעי מיקרומטר.מעבירים חלק מעי גס אחד לאמבט מים, שחומם מראש ל-40 מעלות צלזיוס. השתמש במגלשת הזכוכית המסוויגת כדי להסיר את קטע המעי הגס מהאמבטיה ולהדגר את מגלשת הזכוכית בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות. ראשית, להסיר את הפרפין על ידי דגירה שקופית הזכוכית ב xylene במשך חמש דקות.חזור על שלב זה שלוש פעמים. לאחר מכן מניחים את החלקת הזכוכית בתערובת של אחד לאחד של קסילן ו 100% אתנול במשך חמש דקות. חזור על שלב זה שלוש פעמים.השתמש בסדרה של ריכוזי אתנול יורדים כדי rehydrate סעיף המעי הגס. לטבול את השקופית באתנול במשך חמש דקות. יש לחזור שלוש פעמים על כל ריכוז לפני שתמשיך לריכוז הבא.יש לשטוף את מגלשת הזכוכית מתחת למים זורמים למשך חמש דקות. מחממים את מאגר אחזור האנטיגן ל-95 עד 98 מעלות צלזיוס. ואז לחמם את החלקת הזכוכית בתסכול אחזור אנטיגן רותח במשך 10 דקות.כדי למנוע בזבוז של רייגנטים, השתמש בעט הידרופובי כדי לצייר עיגול סביב החלק המעי הגס. לאחר מכן, הדגירה את המגלשה במשך 10 דקות בתווית 3%של מימן peroxidase ומים. לשטוף את השקופית בתסתר כביסה במשך חמש דקות.לאחר מכן הדגירה את השקופית בתת פתרון חסימה במשך שעה בטמפרטורת החדר. הסר את פתרון החסימה והוסף 20 עד 50 מיקרוליטר של נוגדן ראשוני נגד אלפא E-R, E-R בטא או G-P-E-R מדולל. דגירה הנוגדן העיקרי לילה בארבע מעלות צלזיוס בחושך.הסר את פתרון הנוגדנים. לשטוף את השקופית שלוש פעמים בתסתר כביסה במשך חמש דקות בכל פעם. לאחר מכן, מוסיפים נוגדן משני מדולל.הדגירה את המגלשה עם נוגדן משני גדומה צבע במשך שעה בטמפרטורת החדר בחושך. הסר את פתרון הנוגדנים המשני מהמגלשה. לשטוף את השקופית שלוש פעמים בתסתר כביסה במשך חמש דקות בכל פעם.מוסיפים פלואורוכרום מדולל להדמיית קרום ומדגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. הסר את הפתרון ולשטוף את השקופית שלוש פעמים בתסתר כביסה במשך חמש דקות בכל פעם. הוסף כמה טיפות של DAPI נוזלי מבוסס גליצרול, פלואורוכרום עבור הדמיה גרעיני התא, ישירות על החלק המעי הגס.כסו אותו בזהירות באמצעות שקופית כיסוי. דגירה סעיף המעי הגס לפחות 24 שעות בארבע מעלות צלזיוס. נתח את קטע המעי הגס תחת מיקרוסקופ קונפוקל הכולל מטרות 20x או 63x וטבילת שמן.הספציפיות של הנוגדנים המשמשים במחקר אומתה באמצעות תאי MCF-7. נוגדני קולטן האסטרוגן אפשרו זיהוי של קולטני אסטרוגן גרעיניים E-R אלפא ו- E-R בטא, כמו גם קולטן אסטרוגן כרוך קרום G-P-E-R. כמו כן בוצעה שליטה שלילית שבה תאי MCF-7 הוכתמו רק בנוגדנים משניים עם פלואורוכרום ונוזל מבוסס גליצרול עם DAPI.אות ציטופלסמי חזק של אלפא E-R נמצא בחלקי המעי הגס המתקבל מעכברי בקרה ומעכברים עם מחלת קרוהן הנגרמת על ידי TNBS. עם זאת, רק המעי הגס המתקבל מעכברי בקרה היה E-R אלפא מקומי בציטופלסמה תא הזבל. מיקרוסקופ קונפוקל חשף גם לוקליזציה ציטופלסמית של בטא E-R בחלקי המעי הגס של שני הבקרה והעכברים שטופלו ב- TNBS.באופן דומה, לוקליזציה ציטופלסמית של G-P-E-R תועדה בחלקי המעי הגס שהתקבלו מעכברי בקרה ועכברים שטופלו ב- TNBS. המיקום הנכון של המעי הגס בתבנית חיוני ליצירת חתך רוחב נכון. פלואורוכרום צריך להיבחר על ידי ספקטרום גירוש ו הפליטה משלו.שיטה זו יכולה להיות מיושמת גם על חלבונים אחרים שעשויים להיות מעורבים בפיתוח של קוליטיס. זיהוי אימונוהיסטוכימיה על ידי שפעת חיסונית ניתן להאריך כדי להכתים חלבונים אחרים במצב כיוון חלבון חלבון.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

אקוסטית אוטומטית מחלק עבור דילול סדרה של אגוניסטים פפטיד ב מבחני קביעת און

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

איתור ויזואליזציה של DNA הנזק- Induced חלבון קומפלקסים ההשעיה תא תרבויות באמצעות Assay קשירת הקרבה

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Simple Elimination of Background Fluorescence in Formalin-Fixed Human Brain Tissue for Immunofluorescence Microscopy

פשוט חיסול רקע זריחה ברקמת המוח האנושי פורמלין-קבוע עבור מיקרוסקופ Immunofluorescence

Immunofluorescence is a common method used to visualize subcellular compartments and to determine the localization of specific proteins within a tissue ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

אפיון של Glycoproteins עם הקיפול בנוגדנים על ידי קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן וטכניקות ביופיזיקלי

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Identification of Orexin and Endocannabinoid Receptors in Adult Zebrafish Using Immunoperoxidase and Immunofluorescence Methods

זיהוי של הקולטנים Orexin ו אנדוקאנאיאיד ב בוגרים Zebrafish באמצעות פרוקסידאז ואימונוofloroiסנס שיטות

Immunohistochemistry (IHC) is a highly sensitive and specific technique involved in the detection of target antigens in tissue sections with labeled ...

An In Vivo Estrogen Deficiency Mouse Model for Screening Exogenous Estrogen Treatments of Cardiovascular Dysfunction After Menopause

A In Vivo אסטרוגן מחסור בעכבר מודל עבור ההקרנה הטיפולים האסטרוגן אקסודוגני של בעיות לב וכלי דם אחרי גיל המעבר

Postmenopausal women are at greater risk of developing cardiovascular diseases than premenopausal women. Female mice ovariectomized (OVX) at weaning ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

אינטראקציות עם חדירות ממברנה של המיטותית המוח על ידי עמילואיד Fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  ÃƒÅ½Ã‚Â² Reporter Assay

הקרנה לפיטואסטרוגנים באמצעות קולטן אסטרוגן מבוסס תאים β הכתב Assay

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...

Transplantation of Neonatal Mouse Cardiac Macrophages into Adult Mice

השתלת מקרופאגים לב של עכבר יילודים בעכברים בוגרים

In an injured neonatal myocardium, macrophages facilitate cardiomyocyte proliferation and angiogenesis and promote heart regeneration. The present study ...