Name: visualization of estrogen receptors in colons of mice with tnbs-induced crohn's disease using immunofluorescence
Uploaded: 2020-03-12T12:30:00
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작품은 로츠 당국의 재정 지원 덕분에 출판되었다: 과학 연구를위한 부총장, 국가 및 국제 협력을위한 부총장과 생물학 및 환경 보호 학부의 학장. 다미안 제이스닉은 폴란드 국립과학센터의 보조금(2017/24/T/NZ5/00045 및 2015/17/Nz5/00336)을 지원받았습니다.

동물 연구는 유럽 의회 및 2010년 9월 22일 이사회의 지침 2010/63/EU 및 제도적 권고에 따라 지역 윤리위원회(28/ŁB29/2016)의 동의하에 수행되었습니다.
1. 크론병의 TNBS 유도 뮤린 모델
참고 : 이 프로토콜은 25-28 g의 수컷 BALB / C 마우스를 사용합니다. 동물은 일정한 온도 (22-24 ° C)에 보관되고, 상대 습도 55 ± 5 %, 표준 차우 펠릿 및 수돗물 ad libitum에무료로 ?...

<ol>
	<li>Zhang, Y. Z., Li, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+bowel+disease:+pathogenesis.">Inflammatory bowel disease: pathogenesis.</a> World Journal of Gastroenterology. 20 (1), 91-99 (2014).</li><li>Morris, G. 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Disease development is prevented by cotransfer of purified CD4+ T cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 178 (1), 237-244 (1993).</li><li>K&#252;hn, R., L&#246;hler, J., Rennick, D., Rajewsky, K., M&#252;ller, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-10-deficient+mice+develop+chronic+enterocolitis.">Interleukin-10-deficient mice develop chronic enterocolitis.</a> Cell. 75 (2), 263-274 (1993).</li><li>Sundberg, J. P., Elson, C. O., Bedigian, H., Birkenmeier, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous,+heritable+colitis+in+a+new+substrain+of+C3H/HeJ+mice.">Spontaneous, heritable colitis in a new substrain of C3H/HeJ mice.</a> Gastroenterology. 107 (6), 1726-1735 (1994).</li><li>Harnish, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beneficial+effects+of+estrogen+treatment+in+the+HLA-B27+transgenic+rat+model+of+inflammatory+bowel+disease.">Beneficial effects of estrogen treatment in the HLA-B27 transgenic rat model of inflammatory bowel disease.</a> American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 286 (1), 118-125 (2004).</li><li>Pierdominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+estrogen+receptor+&#946;+expression+with+inflammatory+bowel+disease+activity.">Linking estrogen receptor &#946; expression with inflammatory bowel disease activity.</a> Oncotarget. 6 (38), 40443-40451 (2015).</li><li>W&#322;odarczyk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-coupled+receptor+30+(GPR30)+expression+pattern+in+inflammatory+bowel+disease+patients+suggests+its+key+role+in+the+inflammatory+process.+A+preliminary+study.">G protein-coupled receptor 30 (GPR30) expression pattern in inflammatory bowel disease patients suggests its key role in the inflammatory process. A preliminary study.</a> Journal of Gastrointestinal and Liver Diseases. 26 (1), 29-35 (2017).</li><li>Mohammad, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+receptor+&#945;+contributes+to+T+cell-mediated+autoimmune+inflammation+by+promoting+T+cell+activation+and+proliferation.">Estrogen receptor &#945; contributes to T cell-mediated autoimmune inflammation by promoting T cell activation and proliferation.</a> Science Signaling. 11 (526), eaap9415 (2018).</li><li>Jacenik, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-coupled+estrogen+receptor+mediates+anti-inflammatory+action+in+Crohn's+disease.">G protein-coupled estrogen receptor mediates anti-inflammatory action in Crohn's disease.</a> Scientific Reports. 9 (1), 6749 (2019).</li><li>Prossnitz, E. R., Barton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+G+protein-coupled+estrogen+receptor+GPER+in+health+and+disease.">The G protein-coupled estrogen receptor GPER in health and disease.</a> Nature Review Endocrinology. 7 (12), 715-726 (2011).</li><li>Ya&#351;ar, P., Ayaz, G., User, S. D., G&#252;p&#252;r, G., Muyan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+estrogen-estrogen+receptor+signaling.">Molecular mechanisms of estrogen-estrogen receptor signaling.</a> Reproductive Medicine and Biology. 16 (1), 4-20 (2016).</li><li>Pizarro, T. T., Arseneau, K. O., Bamias, G., Cominelli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+the+study+of+Crohn's+disease.">Mouse models for the study of Crohn's disease.</a> Trends in Molecular Medicine. 9 (5), 218-222 (2003).</li><li>Neurath, M. F., Fuss, I., Kelsall, B. L., St&#252;ber, E., Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+interleukin+12+abrogate+established+experimental+colitis+in+mice.">Antibodies to interleukin 12 abrogate established experimental colitis in mice.</a> Journal of Experimental Medicine. 182 (5), 1281-1290 (1995).</li><li>Ikeda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simvastatin+attenuates+trinitrobenzene+sulfonic+acid-induced+colitis,+but+not+oxazalone-induced+colitis.">Simvastatin attenuates trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis, but not oxazalone-induced colitis.</a> Digestive Diseases and Sciences. 53 (7), 1869-1875 (2007).</li><li>Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Elizabeth, J., Rao, U. K., Ranganathan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+physical+basics+of+routine+formaldehyde+fixation.">Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation.</a> Journal of Oral Maxillofacial Pathology. 16 (3), 400-405 (2012).</li></ol>

IBD 병리생리학 검사를 위한 수많은 동물 모델들이 있는데, 여기에는 유전적, 면역학적 또는 자발적인 모델뿐만 아니라 화학적으로 유도된모델(15)을포함한다. 대장염의 여러 동물 모델 중에서, 이 프로토콜에 기재된 TNBS 유도 모델과 같은 화학적으로 유도된 모델은 비교적 저렴하고 쉽게 얻을 수 있다. 대장염의 TNBS 유도 뮤린 모델은 CD의 병리학적 기초와 관련된 몇 가지 임상 증?...

크론병(CD)은 만성 장염증으로 나타나는 염증성 장질환(IBD)입니다. CD의 병인은 제대로 이해되지 않지만, 장내 미생물, 식이 또는 스트레스와 같은 유전적 및 환경적 요인을 포함하여 CD 발달을 담당하는 것으로 보이는 몇 가지 주요 요인이있다 1. 크론 병의 병인을 더 잘 이해하기 위해,장 염증의 여러 모델이2,3,43,5,56,7을사용했습니다. 본 문서에서, 우리는 CD의 2,4,6-트리니트로벤젠 설포닉산(TNBS)-유도 된 뮤린 모델으로부터 얻은 결과를 제시한다.
에스트로겐은 만성 장 염증8,,9,10,,11,,12를변조 할 수 있다는 것이 문서화되었습니다.9 에스트로겐의 생물학적 활성은 핵 에스트로겐 수용체(ER), 즉 ERα(유전자 ESR1)및 ERβ(유전자 ESR2),G 단백질 결합 에스트로겐 수용체, 즉 GPER(유전자 GPER1)로지칭되는 핵 에스트로겐 수용체(ER)에 의해 매개된다.13,14 에스트로겐 수용체의 수준을 결정하는 몇 가지 방법이 있습니다, 하지만 몇 가지만 장에서 시각화하는 데 사용할 수 있습니다.
면역 조직화학(IHC)은 불소-컨쥬게이트 항체를 가진 세포 또는 조직에서 특정 항원검출을 위한 임상 및 기초 연구에서 널리 사용되는 방법이다. IHC는 대장염의 발달을 이해하는 것이 중요할 지도 모르다 특정 단백질의 식별 그리고 현지화에서 조직 구조 시각화에 있는 중요한 방법 일 것 같습니다. 여기에서, 우리는 면역형광을 사용하여 창자에 있는 에스트로겐 수용체의 면역성 화학적 시각화를 위한 완전하고 검증된 프로토콜을 제시합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Animals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/C mice</td>
			<td>University of Lodz</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62379-531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardboard block</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope - TCS SP8</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fully automated rotary microtome - RM2255</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J1800BMNT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated Paraffin Embedding Module - EG1150 H</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histological box</td>
			<td>Marfour</td>
			<td>LN.138747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic pen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z377821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory balance</td>
			<td>Radwag</td>
			<td>WL-104-0048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X software</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal mold</td>
			<td>Marfour</td>
			<td>CP.5105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile gauze</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile scissor</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile tweezer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue processor - TP1020</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2, 4, 6-trinitrobenzene sulfonic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>92822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiOC6 (3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>318426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DyLight 650 secondary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab96886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ER&#945; primary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab75635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ER&#946; primary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab3576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>396480111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>432173111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GPER primary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab39742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>575283421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxidase</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>885193111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane (forane)</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>1001936040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16210064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>39602012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petrie dish</td>
			<td>Nest Scientific</td>
			<td>705001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Physiological saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin (antibiotic)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifage Mountant with DAPI (glycerol-based liquid with DAPI)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Chempur</td>
			<td>WE/231-598-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>795780429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>853470115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>BA0860119</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of estrogen receptors in colons of mice with tnbs-induced crohn's disease using immunofluorescence

크론병은 가장 진단된 염증성 장 질환입니다. 장에서 발전하는 만성 염증은 연동 무질서 및 장 점막의 손상으로 이끌어 내고 결장 신생물 변환의 증가한 리스크와 연관되는 것처럼 보입니다. 축적 된 증거는 에스트로겐과 에스트로겐 수용체가 호르몬에 민감한 조직뿐만 아니라 폐 또는 결장과 같은 에스트로겐과 직접 관련이없는 다른 조직에도 영향을 미친다는 것을 나타냅니다. 여기서, 우리는 TNBS 유도 크론병의 뮤린 모델로부터 수득된 결장에서 에스트로겐 수용체의 성공적인 면역형광 염색에 대한 프로토콜을 기술한다. 마우스와 장 제제에서 크론 병의 유도에 대한 상세한 프로토콜뿐만 아니라 포르말린 고정 파라핀 내장 장 절편을 사용하여 단계별 면역 히스토미칼 절차가 제공됩니다. 기술된 방법은 생체 내에서 에스트로겐 수용체 검출 및 에스트로겐 신호 조사뿐만 아니라 대장염의 발달에 관여할 수 있는 다른 단백질에도 적용될 수 있다.

TNBS 유도 된 크론 병을 가진 마우스에 있는 결장의 거시적 특성 대조군 및 TNBS 처리 마우스로부터 채취한 결장의 대표적인 이미지는 도 2에나타내고 있다. 크론병의 TNBS 유도 모델을 가진 마우스에서, 결장의 길이는 결장의 폭이 증가하는 동안 감소된다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/...

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Visualization of Estrogen Receptors in Colons of Mice with TNBS-Induced Crohn's Disease using Immunofluorescence

이 프로토콜은 파라핀에 내장된 포르말린 고정 결장 섹션의 면역형광을 이용한 면역성 화학에 의한 에스트로겐 수용체의 시각화 방법 및 크론병의 완전한 검증된 TNBS 유도 뮤린 모델을 제시한다.

면역 형광을 사용하여 TNBS 유도 크론 병을 가진 마우스의 결장에서 에스트로겐 수용체의 가시화

Crohn&#39;s disease is the most diagnosed type of inflammatory bowel disease. Chronic inflammation developing in the intestine leads to peristalsis ...

증가 증거는 생리학의 식민지 부분에 에스트로겐 신호의 영향을 제안, 면역 집중 화학결에 에스트로겐 수용체를 식별하기위한 유망한 기술이며 대장염으로 진화. 우리는 면역 형광을 사용하여 결장의 에스트로겐 수용체의 면역 히스토케토화학 시각화를위한 완전하고 검증 된 프로토콜을 제시합니다. 로츠 대학의 현미경 이미징 연구소의 실위아 Michlewska 박사와 함께, 우리는 절차를 시연 할 것입니다.결장은 페트리 접시에 놓습니다. 결장들을 1~2센티미터 의 조각으로 자른다. 적절하게 표시된 조직학적 카세트에 각 조각을 스폰지에 놓습니다.4%의 파라포름알데히드에 결장 파편이 들어 있는 카세트를 놓습니다. 섭씨 4도에서 최소 24시간 동안 배양하세요. 50%70%90%95%와 100%에탄올, 자일렌 100%에탄올, 자일렌만으로 1시간 동안 티슈 프로세서를 준비하고 프로그래밍할 뿐만 아니라 액체 파라핀에서 적어도 3시간 동안 배양할 수 있다.결장 조각을 조직상자로 옮는다. 미리 프로그래밍된 티슈 프로세서에 상자를 배치하고 프로세서를 실행합니다. 조직 프로세서에서 의배복 후 조직 상자에서 결장 제거 하 고 금속 금형에 결장 조각을 배치, 결장의 두 끝이 똑바로 위치에 있도록.금형의 3분의 1을 액체 파라핀으로 채웁니다. 금형을 섭씨 영하 5도에서 몇 초 동안 그대로 두은 다음 금형을 섭씨 70도의 온난화 영역으로 옮습니다. 그런 다음 금형을 조직 상자의 하단 부분에 놓고 전체 결장 조각을 액체 파라핀으로 덮습니다.콜론 파편과 파라핀을 함유한 금속 금형을 냉각 부위에 몇 분 간 배치합니다. 그런 다음 결장 과 파라핀 블록에서 금속 금형을 제거합니다. 섭씨 4도에서 적어도 24시간 동안 결장과 파라핀 블록을 배양합니다.인큐베이션 후 블록에서 과도한 파라핀을 제거합니다. 결장과 파라핀 블록을 완전히 자동화된 로터리 마이크로토메에 삽입합니다. 결장 조각을 5 마이크로미터 섹션으로 자른다.1개의 결장 구간을 수조로 옮기고, 예열된 섭씨 40도. 라벨이 부착된 유리 슬라이드를 사용하여 수조에서 결장 섹션을 제거하고 실온에서 유리 슬라이드를 24시간 동안 배양합니다. 먼저, 5분 동안 자일렌에 유리 슬라이드를 배양하여 파라핀을 제거합니다.이 단계를 세 번 반복합니다. 그런 다음 유리 슬라이드를 자일렌과 100% 에탄올의 일대일 혼합물에 5분간 놓습니다. 이 단계를 세 번 반복합니다.결장 섹션을 재수화하기 위해 감소 에탄올 농도의 시리즈를 사용합니다. 에탄올에 슬라이드를 5분간 담그십시오. 다음 농도로 진행하기 전에 각 농도에서 세 번 반복하십시오.유리 슬라이드를 흐르는 물 아래5분간 헹구십시오. 항원 검색 버퍼를 섭씨 95~98도로 재가열합니다. 그런 다음 끓는 항원 검색 용액에서 유리 슬라이드를 10 분 동안 가열합니다.시약의 낭비를 방지하기 위해 소수성 펜을 사용하여 결장 섹션 주위에 원을 그립니다. 그런 다음, 과산화수소와 물의 3%용액에서 슬라이드를 10분 동안 배양합니다. 슬라이드를 세척 용액으로 5분간 세척합니다.그런 다음 실온에서 1 시간 동안 차단 용액의 슬라이드를 배양합니다. 차단 용액을 제거하고 E-R 알파, E-R 베타 또는 G-P-E-R 희석에 대한 1차 항체의 20~50마이크로리터를 추가한다. 어둠 속에서 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 1 차 항체를 배양하십시오.항체 용액을 제거합니다. 매번 5분간 세척용액으로 슬라이드를 세 번 씻습니다. 다음으로 희석된 이차 항체를 추가합니다.어둠 속에서 실온에서 1 시간 동안 염료로 컨쥬게이징된 이차 항체로 슬라이드를 배양합니다. 슬라이드에서 이차 항체 용액을 제거합니다. 매번 5분간 세척용액으로 슬라이드를 세 번 씻습니다.멤브레인 시각화를 위해 희석 된 플루오로크롬을 추가하고 어둠 속에서 실온에서 10 분 동안 배양하십시오. 용액을 제거하고 매번 5 분 동안 세척 용액으로 슬라이드를 세 번 씻습니다. 세포 핵 시각화를 위한 플루오로크롬인 글리세롤 계 액체 DAPI를 결장 섹션에 직접 추가합니다.커버 슬라이드로 조심스럽게 덮습니다. 섭씨 4도에서 적어도 24 시간 동안 결장 섹션을 배양하십시오. 20배 또는 63배 의 목표와 오일 침지를 특징으로 하는 공초점 현미경으로 결장 섹션을 분석합니다.이 연구에서 사용된 항체의 특이성은 MCF-7 세포를 사용하여 검증되었다. 에스트로겐 수용체 항체는 핵 에스트로겐 수용체 E-R 알파 및 E-R 베타뿐만 아니라 막 경계 에스트로겐 수용체 G-P-E-R의 검출을 가능하게 하였다. 또한 MCF-7 세포가 불소크롬과 DAPI를 가진 글리세롤 계액체로 컨쥬게이트된 이차 항체로만 염색된 음의 대조군도 수행하였다.E-R 알파의 강력한 세포질 신호는 대조마우스와 TNBS 유도 크론병을 가진 마우스로부터 얻은 결장 섹션에서 발견되었다. 그러나, 대조마우스로부터 얻은 결장만이 잔세포 세포질에서 국소화된 E-R 알파를 가졌다. 공초점 현미경 검사는 또한 대조군과 TNBS 처리마우스의 결장 단면도에 있는 E-R 베타의 세포질 국소화를 밝혔습니다.유사하게, G-P-E-R의 세포질 국소화는 대조군 마우스와 TNBS 처리된 마우스에게서 얻은 결장 섹션에서 문서화되었다. 금형에서 콜론의 올바른 위치는 올바른 단면을 생성하는 데 필수적입니다. 플루오로크롬은 자체 여기 및 방출 스펙트럼에 의해 선택되어야 합니다.이 방법은 또한 대장염의 발달에 관여할 수 있는 그밖 단백질에 적용될 수 있습니다. 면역형광에 의한 면역력 화학 검출은 단백질 단백질 방향 상태에서 다른 단백질을 얼룩지게 확장될 수 있다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

효능 판별 분석에서 펩타이드 작용제의 직렬 희석에 대한 분배 자동 음향

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

연구

생화학

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Proximity Ligation Assay를 이용한 현탁 세포 배양에서의 DNA 손상 유발 단백질 복합체의 검출 및 가시화

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Simple Elimination of Background Fluorescence in Formalin-Fixed Human Brain Tissue for Immunofluorescence Microscopy

면역 형광 검사 현미경 검사 법에 대 한 포 르 말린 고정 뇌 조직에 배경 형광의 간단한 제거

Immunofluorescence is a common method used to visualize subcellular compartments and to determine the localization of specific proteins within a tissue ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

X 선 결정학 및 생물 기술에 의해 면역 글로불린 겹와 Glycoproteins의 특성

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Identification of Orexin and Endocannabinoid Receptors in Adult Zebrafish Using Immunoperoxidase and Immunofluorescence Methods

면역페록시다아제 및 면역형광방법을 이용한 성인용 제브라피시의 오렉스신 및 엔도칸나비노이드 수용체 식별

Immunohistochemistry (IHC) is a highly sensitive and specific technique involved in the detection of target antigens in tissue sections with labeled ...

An In Vivo Estrogen Deficiency Mouse Model for Screening Exogenous Estrogen Treatments of Cardiovascular Dysfunction After Menopause

폐경 후 심장 혈관 기능 장애의 외인성 에스트로겐 치료를 선별하기위한 생체 내 에스트로겐 결핍 마우스 모델

Postmenopausal women are at greater risk of developing cardiovascular diseases than premenopausal women. Female mice ovariectomized (OVX) at weaning ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

아밀로이드 피브릴스뇌 미토콘드리아의 상호 작용 및 막 관과화

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  ÃƒÅ½Ã‚Â² Reporter Assay

세포 기반 에스트로겐 수용체를 사용하여 식물에스트로겐에 대한 검사 β 리포터 분석

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...

Transplantation of Neonatal Mouse Cardiac Macrophages into Adult Mice

신생아 마우스 심장 대식세포를 성인 마우스로 이식

In an injured neonatal myocardium, macrophages facilitate cardiomyocyte proliferation and angiogenesis and promote heart regeneration. The present study ...