Name: visualization of estrogen receptors in colons of mice with tnbs-induced crohn's disease using immunofluorescence
Uploaded: 2020-03-12T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Estrogen Receptors in Colons of Mice with TNBS-Induced Crohn's Disease using Immunofluorescence at JoVE.com

Arbeidet ble publisert takket være økonomisk støtte fra Universitetet i Lodz myndigheter: Vice-Rektor for vitenskapelig forskning, vice-rektor for nasjonalt og internasjonalt samarbeid og dekanved fakultet for biologi og miljøvern. Damian Jacenik ble støttet av tilskudd (2017/24/T/NZ5/00045 og 2015/17/N/NZ5/00336) fra National Science Centre, Polen.

Dyrestudier ble utført med samtykke fra den lokale etiske komiteen (28/ŁB29/2016) i samsvar med eu-parlamentets direktiv 2010/63/EU og rådet 22.
1. TNBS-indusert murine modell av Crohns sykdom
MERK: Denne protokollen bruker mannlige BALB/C-mus som veier 25-28 g. Dyr er plassert ved konstant temperatur (22-24 °C) og relativ fuktighet 55 ± 5%, og vedlikeholdes i en 12 timer lys /mørk syklus med fri tilgang til standard chow pellets og vannalibitumfra spri...

<ol>
	<li>Zhang, Y. Z., Li, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+bowel+disease:+pathogenesis.">Inflammatory bowel disease: pathogenesis.</a> World Journal of Gastroenterology. 20 (1), 91-99 (2014).</li><li>Morris, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hapten-induced+model+of+chronic+inflammation+and+ulceration+in+the+rat+colon.">Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon.</a> Gastroenterology. 96 (3), 795-803 (1989).</li><li>Okayasu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+in+the+induction+of+reliable+experimental+acute+and+chronic+ulcerative+colitis+in+mice.">A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice.</a> Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).</li><li>Boirivant, M., Fuss, I. J., Chu, A., Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxazolone+colitis:+a+murine+model+of+T+helper+cell+type+2+colitis+treatable+with+antibodies+to+interleukin+4.">Oxazolone colitis: a murine model of T helper cell type 2 colitis treatable with antibodies to interleukin 4.</a> Journal of Experimental Medicine. 188 (10), 1929-1939 (1998).</li><li>Morrissey, P. J., Charrier, K., Braddy, S., Liggitt, D., Watson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4++T+cells+that+express+high+levels+of+CD45RB+induce+wasting+disease+when+transferred+into+congenic+severe+combined+immunodeficient+mice.+Disease+development+is+prevented+by+cotransfer+of+purified+CD4++T+cells.">CD4+ T cells that express high levels of CD45RB induce wasting disease when transferred into congenic severe combined immunodeficient mice. Disease development is prevented by cotransfer of purified CD4+ T cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 178 (1), 237-244 (1993).</li><li>K&#252;hn, R., L&#246;hler, J., Rennick, D., Rajewsky, K., M&#252;ller, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-10-deficient+mice+develop+chronic+enterocolitis.">Interleukin-10-deficient mice develop chronic enterocolitis.</a> Cell. 75 (2), 263-274 (1993).</li><li>Sundberg, J. P., Elson, C. O., Bedigian, H., Birkenmeier, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous,+heritable+colitis+in+a+new+substrain+of+C3H/HeJ+mice.">Spontaneous, heritable colitis in a new substrain of C3H/HeJ mice.</a> Gastroenterology. 107 (6), 1726-1735 (1994).</li><li>Harnish, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beneficial+effects+of+estrogen+treatment+in+the+HLA-B27+transgenic+rat+model+of+inflammatory+bowel+disease.">Beneficial effects of estrogen treatment in the HLA-B27 transgenic rat model of inflammatory bowel disease.</a> American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 286 (1), 118-125 (2004).</li><li>Pierdominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+estrogen+receptor+&#946;+expression+with+inflammatory+bowel+disease+activity.">Linking estrogen receptor &#946; expression with inflammatory bowel disease activity.</a> Oncotarget. 6 (38), 40443-40451 (2015).</li><li>W&#322;odarczyk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-coupled+receptor+30+(GPR30)+expression+pattern+in+inflammatory+bowel+disease+patients+suggests+its+key+role+in+the+inflammatory+process.+A+preliminary+study.">G protein-coupled receptor 30 (GPR30) expression pattern in inflammatory bowel disease patients suggests its key role in the inflammatory process. A preliminary study.</a> Journal of Gastrointestinal and Liver Diseases. 26 (1), 29-35 (2017).</li><li>Mohammad, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+receptor+&#945;+contributes+to+T+cell-mediated+autoimmune+inflammation+by+promoting+T+cell+activation+and+proliferation.">Estrogen receptor &#945; contributes to T cell-mediated autoimmune inflammation by promoting T cell activation and proliferation.</a> Science Signaling. 11 (526), eaap9415 (2018).</li><li>Jacenik, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-coupled+estrogen+receptor+mediates+anti-inflammatory+action+in+Crohn's+disease.">G protein-coupled estrogen receptor mediates anti-inflammatory action in Crohn's disease.</a> Scientific Reports. 9 (1), 6749 (2019).</li><li>Prossnitz, E. R., Barton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+G+protein-coupled+estrogen+receptor+GPER+in+health+and+disease.">The G protein-coupled estrogen receptor GPER in health and disease.</a> Nature Review Endocrinology. 7 (12), 715-726 (2011).</li><li>Ya&#351;ar, P., Ayaz, G., User, S. D., G&#252;p&#252;r, G., Muyan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+estrogen-estrogen+receptor+signaling.">Molecular mechanisms of estrogen-estrogen receptor signaling.</a> Reproductive Medicine and Biology. 16 (1), 4-20 (2016).</li><li>Pizarro, T. T., Arseneau, K. O., Bamias, G., Cominelli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+the+study+of+Crohn's+disease.">Mouse models for the study of Crohn's disease.</a> Trends in Molecular Medicine. 9 (5), 218-222 (2003).</li><li>Neurath, M. F., Fuss, I., Kelsall, B. L., St&#252;ber, E., Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+interleukin+12+abrogate+established+experimental+colitis+in+mice.">Antibodies to interleukin 12 abrogate established experimental colitis in mice.</a> Journal of Experimental Medicine. 182 (5), 1281-1290 (1995).</li><li>Ikeda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simvastatin+attenuates+trinitrobenzene+sulfonic+acid-induced+colitis,+but+not+oxazalone-induced+colitis.">Simvastatin attenuates trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis, but not oxazalone-induced colitis.</a> Digestive Diseases and Sciences. 53 (7), 1869-1875 (2007).</li><li>Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Elizabeth, J., Rao, U. K., Ranganathan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+physical+basics+of+routine+formaldehyde+fixation.">Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation.</a> Journal of Oral Maxillofacial Pathology. 16 (3), 400-405 (2012).</li></ol>

Det finnes mange dyremodeller for IBD pathofphysiology undersøkelse, inkludert genetiske, immunologiske eller spontane modeller, samt kjemisk indusert modeller15. Blant de flere typer dyremodeller av kolitt er kjemisk induserte modeller som TNBS-indusert modell beskrevet i denne protokollen relativt billig og lett å få tak i. TNBS-indusert murinemodell av kolitt har flere kliniske symptomer relatert til den patologiske grunnlaget for CD. Dyr med indusert kolitt er preget av inkonsekvent avføri...

Crohns sykdom (CD) er en inflammatorisk tarmsykdom (IBD) manifestert som kronisk tarmbetennelse. Etiologien til CD er dårlig forstått, men det er noen viktige faktorer som synes å være ansvarlig for CD-utvikling, inkludert intestinal mikrobiota, og genetiske og miljømessige faktorer, som kosthold eller stress1. For en bedre forståelse av patogenesen av Crohns sykdom, har flere modeller av tarmbetennelse blitt brukt2,3,4,5,6,7. I denne artikkelen presenterer vi resultater hentet fra en 2,4,6-trinitrobenzen sulfonsyre (TNBS)-indusert murine modell av CD.
Det har blitt dokumentert at østrogener er i stand til å modulere kronisk tarmbetennelse8,9,10,11,12. Den biologiske aktiviteten til østrogener formidles av cognate reseptorer, blant annet er kjernefysiskøstrogen reseptorer (ERs),13,14dvs. ESR1 ESR2 GPER1 Det finnes flere metoder for å bestemme nivået av østrogenreseptorer, men bare noen få kan brukes til å visualisere dem i tarmen.
Immunohistochemistry (IHC) er en mye brukt metode i kliniske og grunnleggende studier for påvisning av visse antigener i celler eller vev med fluorokrom-konjugerte antistoffer. IHC synes å være en viktig metode i vevstruktur visualisering, samt i identifisering og lokalisering av spesifikke proteiner, som kan være avgjørende for å forstå utviklingen av kolitt. Her presenterer vi en komplett og validert protokoll for immunohistokjemisk visualisering av østrogenreseptorer i tarmen ved hjelp av immunofluorescens.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Animals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/C mice</td>
			<td>University of Lodz</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62379-531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardboard block</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope - TCS SP8</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fully automated rotary microtome - RM2255</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J1800BMNT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated Paraffin Embedding Module - EG1150 H</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histological box</td>
			<td>Marfour</td>
			<td>LN.138747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic pen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z377821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory balance</td>
			<td>Radwag</td>
			<td>WL-104-0048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X software</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal mold</td>
			<td>Marfour</td>
			<td>CP.5105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile gauze</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile scissor</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile tweezer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue processor - TP1020</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2, 4, 6-trinitrobenzene sulfonic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>92822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiOC6 (3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>318426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DyLight 650 secondary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab96886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ER&#945; primary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab75635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ER&#946; primary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab3576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>396480111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>432173111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GPER primary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab39742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>575283421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxidase</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>885193111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane (forane)</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>1001936040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16210064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>39602012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petrie dish</td>
			<td>Nest Scientific</td>
			<td>705001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Physiological saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin (antibiotic)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifage Mountant with DAPI (glycerol-based liquid with DAPI)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Chempur</td>
			<td>WE/231-598-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>795780429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>853470115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>BA0860119</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of estrogen receptors in colons of mice with tnbs-induced crohn's disease using immunofluorescence

Crohns sykdom er den mest diagnostiserte typen inflammatorisk tarmsykdom. Kronisk betennelse i tarmen fører til peristaltikklidelse og skade på tarmslimhinnen og synes å være forbundet med økt risiko for kolonneoplastisk transformasjon. Akkumulerende bevis indikerer at østrogener og østrogenreseptorer påvirker ikke bare hormonfølsomme vev, men også andre vev som ikke er direkte relatert til østrogener, som lungene eller tykktarmen. Her beskriver vi protokollen for vellykket immunfluorescensfarging av østrogenreseptorer i tykktarm hentet fra en murinemodell av TNBS-indusert Crohns sykdom. En detaljert protokoll for induksjon av Crohns sykdom hos mus og tarmforberedelse er gitt, samt en trinnvis immunohistokjemisk prosedyre ved hjelp av formalin-faste parafin-innebygde tarmseksjoner. De beskrevne metodene er ikke bare nyttige for østrogen reseptor deteksjon og østrogen signalering undersøkelse in vivo men kan også brukes på andre proteiner som kan være involvert i utviklingen av kolitt.

Makroskopiske egenskaper av kolon hos mus med TNBS-indusert Crohns sykdom Representative bilder av kolon tatt fra kontroll og TNBS-behandlede mus er vist i figur 2. Hos mus med en TNBS-indusert modell av Crohns sykdom reduseres lengden på tykktarmen mens tykktarmens bredde økes.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60813/60813fig2a.jpg"> Figur 2...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Estrogen Receptors in Colons of Mice with TNBS-Induced Crohn's Disease using Immunofluorescence at JoVE.com

Visualization of Estrogen Receptors in Colons of Mice with TNBS-Induced Crohn's Disease using Immunofluorescence

Protokollen presenterer en fullstendig validert TNBS-indusert murine modell av Crohns sykdom og metoder for visualisering av østrogenreseptorer ved immunhistokjemi ved hjelp av immunofluorescens av formalin-faste kolon seksjoner innebygd i parafin.

Visualisering av østrogenreseptorer i kolon av mus med TNBS-indusert Crohns sykdom ved hjelp av immunofluorescens

Crohn&#39;s disease is the most diagnosed type of inflammatory bowel disease. Chronic inflammation developing in the intestine leads to peristalsis ...

Økende bevis tyder på virkningen av østrogen signalering på den koloniske delen av fysiologi, immunohistochemistry er en lovende teknikk for å identifisere østrogen reseptorer i tykktarmen og de utvikler seg til kolitt. Vi presenterer en komplett og validert protokoll for immunohistokjemisk visualisering av østrogenreseptorer i tykktarmen, ved hjelp av immunofluorescence. Sammen med Dr.Sylwia Michlewska fra Laboratory of Microscopic Imaging ved Universitetet i Lodz, vil vi demonstrere prosedyren.Legg tykktarmen i en petriskål. Skjær tykktarmen i en til to centimeter fragmenter. Plasser hvert fragment på en svamp i en passende merket histologisk kassett.Plasser en kassett som inneholder et kolonfragment i 4 % paraformaldehyd. Inkuber i minst 24 timer ved fire grader celsius. Forbered og programmer vevsprosessoren i en time inkubasjon i 50% 70% 90% 95% og 100% etanol, xylen 100% etanol og xylen bare, samt i minst tre timer inkubasjon i flytende parafin.Overfør kolonfragmentet til en histologisk boks. Plasser boksen i den forhåndsprogrammerte vevsprosessoren og kjør prosessoren. Etter inkubasjon i vevsprosessoren fjerner tykktarmen fra den histologiske boksen og plasserer kolonfragmentet i en metallform, slik at de to endene av tykktarmen er i oppreist stilling.Fyll en tredjedel av formen med flytende parafin. Plasser formen i kjøleområdet på minus fem grader celsius i noen sekunder, og flytt deretter formen til oppvarmingsområdet ved 70 grader celsius. Plasser deretter formen i den nederste delen av histologisk boks og dekk hele kolonfragmentet med flytende parafin.Plasser metallformen som inneholder kolonfragmentet og parafinen i kjøleområdet i noen minutter. Fjern deretter metallformen fra tykktarmen og parafinblokken. Inkuber tykktarmen og parafinblokken i minst 24 timer ved fire grader celsius.Etter inkubasjon, fjern overflødig parafin fra blokken. Sett kolon- og parafinblokken inn i en helautomatisk roterende mikrotom. Skjær kolonfragmentet i fem mikrometerseksjoner.Overfør en kolonseksjon til et vannbad, forvarmet til 40 grader celsius. Bruk den merkede glasssklien til å fjerne kolondelen fra vannbadet og inkubere glasssklien ved romtemperatur i 24 timer. Fjern først parafinen ved å inkubere glasssklien i xylen i fem minutter.Gjenta dette trinnet tre ganger. Plasser deretter glasssklie i en en-til-en-blanding av xylen og 100% etanol i fem minutter. Gjenta dette trinnet tre ganger.Bruk en rekke avtagende etanolkonsentrasjoner for å rehydrere kolonseksjonen. Senk lysbildet i etanol i fem minutter. Gjenta tre ganger ved hver konsentrasjon før du går videre til neste konsentrasjon.Skyll glasset gli under rennende vann i fem minutter. Varm opp antigengjenfinningsbufferen til 95 til 98 grader celsius. Varm deretter glasset i kokende antigen gjenfinningsløsning i 10 minutter.For å unngå sløsing med reagenser, bruk en hydrofob penn til å tegne en sirkel rundt kolondelen. Deretter inkuber lysbildet i 10 minutter i en 3% løsning av hydrogenperoksidase og vann. Vask lysbildet i vaskeoppløsning i fem minutter.Deretter inkuber lysbildet i blokkeringsløsning i en time ved romtemperatur. Fjern blokkeringsløsningen og tilsett 20 til 50 mikroliter primært antistoff mot E-R alfa, E-R beta eller G-P-E-R fortynnet. Inkuber det primære antistoffet over natten ved fire grader celsius i mørket.Fjern antistoffoppløsningen. Vask lysbildet tre ganger i vaskeoppløsning i fem minutter hver gang. Deretter legger du til fortynnet sekundært antistoff.Inkuber lysbildet med sekundært antistoff konjugert med fargestoff i en time ved romtemperatur i mørket. Fjern den sekundære antistoffløsningen fra lysbildet. Vask lysbildet tre ganger i vaskeoppløsning i fem minutter hver gang.Tilsett fortynnet fluorokrom for membranvisualisering og inkuber i 10 minutter ved romtemperatur i mørket. Fjern løsningen og vask lysbildet tre ganger i vaskeløsning i fem minutter hver gang. Tilsett noen dråper glyserolbasert flytende DAPI, en fluorokrom for cellekjerner visualisering, direkte på kolondelen.Dekk det forsiktig med et deksel lysbilde. Inkuber kolonseksjonen i minst 24 timer ved fire grader celsius. Analyser kolonseksjonen under et konfokalt mikroskop med 20x eller 63x mål og oljenedsenking.Spesifisiteten til antistoffene som ble brukt i studien ble validert ved hjelp av MCF-7-celler. Østrogen reseptor antistoffer aktivert påvisning av kjernefysiske østrogen reseptorer E-R alfa og E-R beta samt membran-bundet østrogen reseptor G-P-E-R. En negativ kontroll ble også utført der MCF-7-celler bare ble farget med sekundært antistoff konjugert med fluorokrom og en glyserolbasert væske med DAPI.Et sterkt cytoplasmatisk signal av E-R alfa ble funnet i kolonseksjonene hentet fra kontrollmus og fra mus med TNBS-indusert Crohns sykdom. Imidlertid hadde bare kolonene hentet fra kontrollmus E-R alfa lokalisert i begercellecytoplasma. Konfokal mikroskopi avslørte også cytoplasmatisk lokalisering av E-R beta i kolondelene av både kontroll og TNBS-behandlede mus.På samme måte ble cytoplasmatisk lokalisering av G-P-E-R dokumentert i kolonseksjonene hentet fra kontrollmus og TNBS-behandlede mus. Riktig posisjonering av tykktarmen i formen er viktig for å generere riktig tverrsnitt. Fluorokrom bør velges av sin egen eksitasjon og utslippsspektrum.Denne metoden kan også brukes på andre proteiner som kan være involvert i utviklingen av kolitt. Immunohistochemistry deteksjon ved immunofluorescence kan utvides til å flekke andre proteiner i protein-protein retning status.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Automatisert Acoustic Doserings for serie Fortynning av Peptide agonister i Potens Fastsettelse Analyser

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Deteksjon og visualisering av DNA-skadeinducerte proteinkomplekser i suspensjoncellekulturer ved bruk av næringslysanalysen

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Simple Elimination of Background Fluorescence in Formalin-Fixed Human Brain Tissue for Immunofluorescence Microscopy

Enkel fjerning av bakgrunn fluorescens i Formalin-fast hjernevev for Immunofluorescence mikroskopi

Immunofluorescence is a common method used to visualize subcellular compartments and to determine the localization of specific proteins within a tissue ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Karakteristikk av glykoproteiner med immunglobulin Fold av Røntgenkrystallografi og Biofysiske teknikker

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Identification of Orexin and Endocannabinoid Receptors in Adult Zebrafish Using Immunoperoxidase and Immunofluorescence Methods

Identifisering av orexin og Endocannabinoid reseptorer i Adult sebrafisk bruke Immunoperoxidase og Immunofluorescence metoder

Immunohistochemistry (IHC) is a highly sensitive and specific technique involved in the detection of target antigens in tissue sections with labeled ...

An In Vivo Estrogen Deficiency Mouse Model for Screening Exogenous Estrogen Treatments of Cardiovascular Dysfunction After Menopause

An in vivo Østrogenmangel Mouse modell for screening eksogene østrogen behandlinger av kardiovaskulær dysfunksjon etter overgangsalder

Postmenopausal women are at greater risk of developing cardiovascular diseases than premenopausal women. Female mice ovariectomized (OVX) at weaning ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Interaksjoner med og membran Permeabilization av Brain mitokondrier av amyloid fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  ÃƒÅ½Ã‚Â² Reporter Assay

Screening for fytoøstrogener ved hjelp av en cellebasert østrogenreseptor β Reporter Analyse

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...

Transplantation of Neonatal Mouse Cardiac Macrophages into Adult Mice

Transplantasjon av neonatal mus hjertemakrofager til voksne mus

In an injured neonatal myocardium, macrophages facilitate cardiomyocyte proliferation and angiogenesis and promote heart regeneration. The present study ...