Name: visualization of estrogen receptors in colons of mice with tnbs-induced crohn's disease using immunofluorescence
Uploaded: 2020-03-12T12:30:00
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O trabalho foi publicado graças ao apoio financeiro das autoridades da Universidade de Lodz: Vice-Reitor de Pesquisa Científica, Vice-Reitor de Cooperação Nacional e Internacional e Reitor da Faculdade de Biologia e Proteção Ambiental. Damian Jacenik foi apoiado por subsídios (2017/24/T/NZ5/00045 e 2015/17/N/NZ5/00336) do National Science Centre, Polônia.

Os estudos em animais foram realizados com o consentimento do Comitê Deética Local (28/ŁB29/2016) em conformidade com a Diretiva 2010/63/UE do Parlamento Europeu e do Conselho de 22 de Setembro de 2010, e recomendações institucionais.
1. Modelo de murina induzida pelo TNBS da doença de Crohn
NOTA: Este protocolo utiliza camundongos machos BALB/C pesando 25-28 g. Os animais estão alojados a uma temperatura constante (22-24 °C) e, umidade relativa de 55 ± 5%, e...

<ol>
	<li>Zhang, Y. Z., Li, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+bowel+disease:+pathogenesis.">Inflammatory bowel disease: pathogenesis.</a> World Journal of Gastroenterology. 20 (1), 91-99 (2014).</li><li>Morris, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hapten-induced+model+of+chronic+inflammation+and+ulceration+in+the+rat+colon.">Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon.</a> Gastroenterology. 96 (3), 795-803 (1989).</li><li>Okayasu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+in+the+induction+of+reliable+experimental+acute+and+chronic+ulcerative+colitis+in+mice.">A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice.</a> Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).</li><li>Boirivant, M., Fuss, I. J., Chu, A., Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxazolone+colitis:+a+murine+model+of+T+helper+cell+type+2+colitis+treatable+with+antibodies+to+interleukin+4.">Oxazolone colitis: a murine model of T helper cell type 2 colitis treatable with antibodies to interleukin 4.</a> Journal of Experimental Medicine. 188 (10), 1929-1939 (1998).</li><li>Morrissey, P. J., Charrier, K., Braddy, S., Liggitt, D., Watson, J. 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Disease development is prevented by cotransfer of purified CD4+ T cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 178 (1), 237-244 (1993).</li><li>K&#252;hn, R., L&#246;hler, J., Rennick, D., Rajewsky, K., M&#252;ller, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-10-deficient+mice+develop+chronic+enterocolitis.">Interleukin-10-deficient mice develop chronic enterocolitis.</a> Cell. 75 (2), 263-274 (1993).</li><li>Sundberg, J. P., Elson, C. O., Bedigian, H., Birkenmeier, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous,+heritable+colitis+in+a+new+substrain+of+C3H/HeJ+mice.">Spontaneous, heritable colitis in a new substrain of C3H/HeJ mice.</a> Gastroenterology. 107 (6), 1726-1735 (1994).</li><li>Harnish, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beneficial+effects+of+estrogen+treatment+in+the+HLA-B27+transgenic+rat+model+of+inflammatory+bowel+disease.">Beneficial effects of estrogen treatment in the HLA-B27 transgenic rat model of inflammatory bowel disease.</a> American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 286 (1), 118-125 (2004).</li><li>Pierdominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+estrogen+receptor+&#946;+expression+with+inflammatory+bowel+disease+activity.">Linking estrogen receptor &#946; expression with inflammatory bowel disease activity.</a> Oncotarget. 6 (38), 40443-40451 (2015).</li><li>W&#322;odarczyk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-coupled+receptor+30+(GPR30)+expression+pattern+in+inflammatory+bowel+disease+patients+suggests+its+key+role+in+the+inflammatory+process.+A+preliminary+study.">G protein-coupled receptor 30 (GPR30) expression pattern in inflammatory bowel disease patients suggests its key role in the inflammatory process. A preliminary study.</a> Journal of Gastrointestinal and Liver Diseases. 26 (1), 29-35 (2017).</li><li>Mohammad, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+receptor+&#945;+contributes+to+T+cell-mediated+autoimmune+inflammation+by+promoting+T+cell+activation+and+proliferation.">Estrogen receptor &#945; contributes to T cell-mediated autoimmune inflammation by promoting T cell activation and proliferation.</a> Science Signaling. 11 (526), eaap9415 (2018).</li><li>Jacenik, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-coupled+estrogen+receptor+mediates+anti-inflammatory+action+in+Crohn's+disease.">G protein-coupled estrogen receptor mediates anti-inflammatory action in Crohn's disease.</a> Scientific Reports. 9 (1), 6749 (2019).</li><li>Prossnitz, E. R., Barton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+G+protein-coupled+estrogen+receptor+GPER+in+health+and+disease.">The G protein-coupled estrogen receptor GPER in health and disease.</a> Nature Review Endocrinology. 7 (12), 715-726 (2011).</li><li>Ya&#351;ar, P., Ayaz, G., User, S. D., G&#252;p&#252;r, G., Muyan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+estrogen-estrogen+receptor+signaling.">Molecular mechanisms of estrogen-estrogen receptor signaling.</a> Reproductive Medicine and Biology. 16 (1), 4-20 (2016).</li><li>Pizarro, T. T., Arseneau, K. O., Bamias, G., Cominelli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+the+study+of+Crohn's+disease.">Mouse models for the study of Crohn's disease.</a> Trends in Molecular Medicine. 9 (5), 218-222 (2003).</li><li>Neurath, M. F., Fuss, I., Kelsall, B. L., St&#252;ber, E., Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+interleukin+12+abrogate+established+experimental+colitis+in+mice.">Antibodies to interleukin 12 abrogate established experimental colitis in mice.</a> Journal of Experimental Medicine. 182 (5), 1281-1290 (1995).</li><li>Ikeda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simvastatin+attenuates+trinitrobenzene+sulfonic+acid-induced+colitis,+but+not+oxazalone-induced+colitis.">Simvastatin attenuates trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis, but not oxazalone-induced colitis.</a> Digestive Diseases and Sciences. 53 (7), 1869-1875 (2007).</li><li>Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Elizabeth, J., Rao, U. K., Ranganathan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+physical+basics+of+routine+formaldehyde+fixation.">Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation.</a> Journal of Oral Maxillofacial Pathology. 16 (3), 400-405 (2012).</li></ol>

Existem inúmeros modelos animais para o exame de fisiopatologia do IBD, incluindo modelos genéticos, imunológicos ou espontâneos, bem como modelos quimicamente induzidos15. Entre os vários tipos de modelos animais de colite, modelos quimicamente induzidos, como o modelo induzido pelo TNBS descrito neste protocolo, são relativamente baratos e fáceis de obter. O modelo de murina induzida pelo TNBS tem vários sintomas clínicos relacionados à base patológica do CD. Animais com colite induzi...

A doença de Crohn (CD) é uma doença inflamatória intestinal (DII) manifestada como inflamação crônica do intestino. A etiologia do CD é pouco compreendida, mas existem alguns fatores importantes que parecem ser responsáveis pelo desenvolvimento do CD, incluindo a microbiota intestinal, e fatores genéticos e ambientais, como dieta ou estresse1. Para uma melhor compreensão da patogênese da doença de Crohn, vários modelos de inflamação intestinal têm sido utilizados2,3,4,5,6,7. Neste artigo, apresentamos resultados obtidos a partir de um modelo de murina induzida por 2,4,6-trinitrobbenzeno (TNBS) do modelo de CD.
Foi documentado que os estrogênios são capazes de modular a inflamação intestinal crônica8,,9,10,11,12. A atividade biológica dos estrogênios é mediada por receptores cognatos, entre os quais estão receptores de estrogênio nuclear (ERs), ou seja, ERα (gene ESR1) e ERβ (gene ESR2),bem como receptor esgota do g acoplado à proteína, ou seja, GPER (gene GPER1),referido como ER13,14. Existem vários métodos para determinar o nível dos receptores de estrogênio, mas apenas alguns podem ser usados para visualizá-los no intestino.
A imunohistoquímica (IHC) é um método amplamente utilizado em estudos clínicos e básicos para a detecção de certos antígenos em células ou tecidos com anticorpos florocromos conjugados. O IHC parece ser um importante método na visualização da estrutura tecidual, bem como na identificação e localização de proteínas específicas, o que pode ser crucial para a compreensão do desenvolvimento da colite. Aqui, apresentamos um protocolo completo e validado para visualização imunohistoquímica de receptores de estrogênio no intestino usando imunofluorescência.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Animals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/C mice</td>
			<td>University of Lodz</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62379-531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardboard block</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope - TCS SP8</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fully automated rotary microtome - RM2255</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J1800BMNT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated Paraffin Embedding Module - EG1150 H</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histological box</td>
			<td>Marfour</td>
			<td>LN.138747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic pen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z377821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory balance</td>
			<td>Radwag</td>
			<td>WL-104-0048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X software</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal mold</td>
			<td>Marfour</td>
			<td>CP.5105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile gauze</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile scissor</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile tweezer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue processor - TP1020</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2, 4, 6-trinitrobenzene sulfonic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>92822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiOC6 (3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>318426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DyLight 650 secondary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab96886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ER&#945; primary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab75635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ER&#946; primary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab3576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>396480111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>432173111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GPER primary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab39742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>575283421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxidase</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>885193111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane (forane)</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>1001936040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16210064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>39602012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petrie dish</td>
			<td>Nest Scientific</td>
			<td>705001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Physiological saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin (antibiotic)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifage Mountant with DAPI (glycerol-based liquid with DAPI)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Chempur</td>
			<td>WE/231-598-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>795780429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>853470115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>BA0860119</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of estrogen receptors in colons of mice with tnbs-induced crohn's disease using immunofluorescence

A doença de Crohn é o tipo mais diagnosticado de doença inflamatória intestinal. A inflamação crônica que se desenvolve no intestino leva à desordem da peristalse e aos danos da mucosa intestinal e parece estar associada a um risco aumentado de transformação neoplásica do cólon. O acúmulo de evidências indica que os estrogênios e receptores de estrogênio afetam não apenas tecidos sensíveis a hormônios, mas também outros tecidos não diretamente relacionados a estrogênios, como os pulmões ou cólon. Aqui, descrevemos o protocolo para a bem sucedida coloração de imunofluorescência de receptores de estrogênio no cólon obtido susceptência de um modelo murina da doença de Crohn induzida pelo TNBS. Um protocolo detalhado para a indução da doença de Crohn em camundongos e preparação do intestino é fornecido, bem como um procedimento imunohistoquímico passo a passo usando seções de intestino parafina fixado formalina. Os métodos descritos não só são úteis para a detecção de receptores de estrogênio e a investigação de sinalização de estrogênio in vivo, mas também podem ser aplicados para outras proteínas que podem estar envolvidas no desenvolvimento de colite.

Características macroscópicas de cólons em camundongos com doença de Crohn induzida pelo TNBS Imagens representativas de cólons retirados do controle e camundongos tratados com TNBS são mostradas na Figura 2. Em camundongos com um modelo induzido por TNBS da doença de Crohn, o comprimento do cólon é reduzido enquanto a largura do cólon é aumentada.
<img alt="Figure 2" ...

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Visualization of Estrogen Receptors in Colons of Mice with TNBS-Induced Crohn's Disease using Immunofluorescence

O protocolo apresenta um modelo completo de murina induzida por TNBS da doença de Crohn e métodos para visualização de receptores de estrogênio por imunohistoquímica usando imunofluorescência de seções de cólon fixas de formalina embutidas em parafina.

Visualização de receptores de estrogênio em cólons de camundongos com doença de Crohn induzida pelo TNBS usando imunofluorescência

Crohn&#39;s disease is the most diagnosed type of inflammatory bowel disease. Chronic inflammation developing in the intestine leads to peristalsis ...

Evidências crescentes sugerem o impacto da sinalização de estrogênio na parte colonia da fisiologia, a imunohistoquímica é uma técnica promissora para identificar receptores de estrogênio no cólon e eles evoluem para colite. Apresentamos um protocolo completo e validado para visualização imunohistoquímica de receptores de estrogênio no cólon, utilizando imunofluorescência. Juntamente com a Dra.Coloque o cólon em uma placa de petri. Corte o cólon em fragmentos de um a dois centímetros. Coloque cada fragmento em uma esponja em um histológico apropriadamente rotulado.Coloque um contendo um fragmento de cólon em 4% de paraformaldeído. Incubar por pelo menos 24 horas a quatro graus celsius. Prepare e programe o processador de tecidos para uma hora de incubação em 50%70%90%95% e 100% etanol, xileno 100% etanol e apenas xileno, bem como por pelo menos três horas de incubação em parafina líquida.Transfira o fragmento do cólon para uma caixa histológica. Coloque a caixa no processador de tecido pré-programado e execute o processador. Após a incubação no processador de tecido, remova o cólon da caixa histológica e coloque o fragmento do cólon em um molde de metal, de tal forma que as duas extremidades do cólon estejam em uma posição vertical.Encha um terço do molde com parafina líquida. Coloque o molde na área de resfriamento a menos cinco graus celsius por alguns segundos e, em seguida, mova o molde para a área de aquecimento a 70 graus celsius. Em seguida, coloque o molde na parte inferior da caixa histológica e cubra todo o fragmento de cólon com parafina líquida.Coloque o molde metálico contendo o fragmento do cólon e a parafina na área de resfriamento por alguns minutos. Em seguida, remova o molde de metal do bloco de cólon e parafina. Incubar o bloco de cólon e parafina por pelo menos 24 horas a quatro graus celsius.Após a incubação, remova o excesso de parafina do bloco. Insira o bloco de cólon e parafina em um microtoma rotativo totalmente automatizado. Corte o fragmento do cólon em cinco seções de micrômetros.Transfira uma seção de cólon para um banho de água, pré-aquecido a 40 graus celsius. Use o slide de vidro rotulado para remover a seção do cólon do banho de água e incubar o escorregador de vidro à temperatura ambiente por 24 horas. Primeiro, remova a parafina incubando o deslizamento de vidro no xileno por cinco minutos.Repita este passo três vezes. Em seguida, coloque o deslizamento de vidro em uma mistura de xileno e 100% etanol por cinco minutos. Repita este passo três vezes.Use uma série de concentrações de etanol diminuindo para reidratar a seção do cólon. Mergulhe o deslizamento no etanol por cinco minutos. Repita três vezes em cada concentração antes de prosseguir para a próxima concentração.Enxágüe o deslizamento de vidro em água corrente por cinco minutos. Reaqueça o tampão de recuperação de antígeno a 95 a 98 graus celsius. Em seguida, aqueça o deslizamento de vidro na solução de recuperação de antígeno fervente por 10 minutos.Para evitar desperdícios de reagentes, use uma caneta hidrofóbica para desenhar um círculo ao redor da seção de cólon. Em seguida, incubar o slide por 10 minutos em uma solução de 3% de peroxidase de hidrogênio e água. Lave o slide na solução de lavagem por cinco minutos.Em seguida, incubar o slide na solução de bloqueio por uma hora à temperatura ambiente. Remova a solução de bloqueio e adicione 20 a 50 microliters de anticorpo primário contra E-R alfa, E-R beta ou G-P-E-R diluídos. Incubar o anticorpo primário durante a noite a quatro graus celsius na escuridão.Remova a solução de anticorpos. Lave o slide três vezes na solução de lavagem por cinco minutos cada vez. Em seguida, adicione anticorpo secundário diluído.Incubar o slide com anticorpo secundário conjugado com corante por uma hora à temperatura ambiente na escuridão. Remova a solução de anticorpos secundários do slide. Lave o slide três vezes na solução de lavagem por cinco minutos cada vez.Adicione fluorocromo diluído para visualização de membrana e incubar por 10 minutos à temperatura ambiente na escuridão. Remova a solução e lave o slide três vezes na solução de lavagem por cinco minutos cada vez. Adicione algumas gotas de DAPI líquido à base de glicerol, um fluorocromo para visualização de núcleos celulares, diretamente na seção de cólon.Cubra-o cuidadosamente com um slide de cobertura. Incubar a seção de cólon por pelo menos 24 horas a quatro graus celsius. Analise a seção de cólon sob um microscópio confocal com objetivos de 20x ou 63x e imersão em óleo.A especificidade dos anticorpos utilizados no estudo foi validada utilizando células MCF-7. Os anticorpos do receptor de estrogênio permitiram a detecção dos receptores nucleares de estrogênio E-R alfa e E-R beta, bem como o receptor de estrogênio ligado à membrana G-P-E-R. Também foi realizado um controle negativo no qual as células MCF-7 foram manchadas apenas com anticorpo secundário conjugado com fluorocromo e líquido à base de glicerol com DAPI.Um forte sinal citoplasmado de E-R alfa foi encontrado nas seções de cólon obtidas a partir de ratos de controle e de camundongos com doença de Crohn induzida pelo TNBS. No entanto, apenas os cólons obtidos a partir de camundongos de controle tinham E-R alfa localizado no citoplasma de células de cálice. A microscopia confocal também revelou a localização citoplasmática do beta E-R nas seções de cólon tanto do controle quanto dos camundongos tratados com TNBS.Da mesma forma, a localização citoplasmática do G-P-E-R foi documentada nas seções de cólon obtidas a partir de camundongos de controle e camundongos tratados com TNBS. O posicionamento correto do cólon no molde é essencial para gerar a seção transversal correta. Fluorocromo deve ser selecionado por seu próprio espectro de excitação e emissão.Este método também pode ser aplicado a outras proteínas que possam estar envolvidas no desenvolvimento de colites. A detecção de imunohistoquímica por imunofluorescência pode ser estendida para manchar outras proteínas no status de direção proteína-proteína.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Automated acústico de distribuição para a diluição de série do Peptide agonistas em potência Determinação Ensaios

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

Bioquímica

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Detecção e visualização de complexos de proteína induzidos por dano do DNA em culturas de células de suspensão usando o Ensaio de Ligação de Proximidade

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Simple Elimination of Background Fluorescence in Formalin-Fixed Human Brain Tissue for Immunofluorescence Microscopy

Simples eliminação da fluorescência de fundo no tecido do cérebro humano fixada em formol para microscopia de imunofluorescência

Immunofluorescence is a common method used to visualize subcellular compartments and to determine the localization of specific proteins within a tissue ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Caracterização de Glicoproteínas com Dobra da Imunoglobulina por Cristalografia de Raios-X e Técnicas Biofísicas

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Identification of Orexin and Endocannabinoid Receptors in Adult Zebrafish Using Immunoperoxidase and Immunofluorescence Methods

Identificação de receptores de Orexin e endocanabinoides em zebrafish adulto usando métodos de imunoperoxidase e imunofluorescência

Immunohistochemistry (IHC) is a highly sensitive and specific technique involved in the detection of target antigens in tissue sections with labeled ...

An In Vivo Estrogen Deficiency Mouse Model for Screening Exogenous Estrogen Treatments of Cardiovascular Dysfunction After Menopause

Um modelo in vivo de deficiência de estrogênio mouse para triagem tratamentos de estrogênio exógeno de disfunção cardiovascular após a menopausa

Postmenopausal women are at greater risk of developing cardiovascular diseases than premenopausal women. Female mice ovariectomized (OVX) at weaning ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Interações com e permeabilização de membrana de mitocôndrias cerebrais por fibrilas amiloides

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  ÃƒÅ½Ã‚Â² Reporter Assay

Triagem para Fitoestrogênios usando um receptor de estrogênio baseado em células β Reporter Assay

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...

Transplantation of Neonatal Mouse Cardiac Macrophages into Adult Mice

Transplante de Macrófagos Cardíacos de Camundongos Neonatais em Camundongos Adultos

In an injured neonatal myocardium, macrophages facilitate cardiomyocyte proliferation and angiogenesis and promote heart regeneration. The present study ...