Name: visualization of estrogen receptors in colons of mice with tnbs-induced crohn's disease using immunofluorescence
Uploaded: 2020-03-12T12:30:00
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El trabajo fue publicado gracias al apoyo financiero de las autoridades de la Universidad de Lodz: Vicerrector de Investigación Científica, Vicerrector de Cooperación Nacional e Internacional y dedean de la Facultad de Biología y Protección Ambiental. Damian Jacenik fue apoyado por subvenciones (2017/24/T/NZ5/00045 y 2015/17/N/NZ5/00336) del Centro Nacional de Ciencias, Polonia.

Los estudios en animales se llevaron a cabo con el consentimiento del Comité ético local (28/B29/2016) de conformidad con la Directiva 2010/63/UE del Parlamento Europeo y del Consejo, de 22 de septiembre de 2010, y las recomendaciones institucionales.
1. Modelo murino inducido por TNBS de la enfermedad de Crohn
NOTA: Este protocolo utiliza ratones macho sABA/C con un peso de 25-28 g. Los animales se alojan a una temperatura constante (22-24 oC) y, humedad relativa d...

<ol>
	<li>Zhang, Y. Z., Li, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+bowel+disease:+pathogenesis.">Inflammatory bowel disease: pathogenesis.</a> World Journal of Gastroenterology. 20 (1), 91-99 (2014).</li><li>Morris, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hapten-induced+model+of+chronic+inflammation+and+ulceration+in+the+rat+colon.">Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon.</a> Gastroenterology. 96 (3), 795-803 (1989).</li><li>Okayasu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+in+the+induction+of+reliable+experimental+acute+and+chronic+ulcerative+colitis+in+mice.">A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice.</a> Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).</li><li>Boirivant, M., Fuss, I. J., Chu, A., Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxazolone+colitis:+a+murine+model+of+T+helper+cell+type+2+colitis+treatable+with+antibodies+to+interleukin+4.">Oxazolone colitis: a murine model of T helper cell type 2 colitis treatable with antibodies to interleukin 4.</a> Journal of Experimental Medicine. 188 (10), 1929-1939 (1998).</li><li>Morrissey, P. J., Charrier, K., Braddy, S., Liggitt, D., Watson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4++T+cells+that+express+high+levels+of+CD45RB+induce+wasting+disease+when+transferred+into+congenic+severe+combined+immunodeficient+mice.+Disease+development+is+prevented+by+cotransfer+of+purified+CD4++T+cells.">CD4+ T cells that express high levels of CD45RB induce wasting disease when transferred into congenic severe combined immunodeficient mice. Disease development is prevented by cotransfer of purified CD4+ T cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 178 (1), 237-244 (1993).</li><li>K&#252;hn, R., L&#246;hler, J., Rennick, D., Rajewsky, K., M&#252;ller, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-10-deficient+mice+develop+chronic+enterocolitis.">Interleukin-10-deficient mice develop chronic enterocolitis.</a> Cell. 75 (2), 263-274 (1993).</li><li>Sundberg, J. P., Elson, C. O., Bedigian, H., Birkenmeier, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous,+heritable+colitis+in+a+new+substrain+of+C3H/HeJ+mice.">Spontaneous, heritable colitis in a new substrain of C3H/HeJ mice.</a> Gastroenterology. 107 (6), 1726-1735 (1994).</li><li>Harnish, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beneficial+effects+of+estrogen+treatment+in+the+HLA-B27+transgenic+rat+model+of+inflammatory+bowel+disease.">Beneficial effects of estrogen treatment in the HLA-B27 transgenic rat model of inflammatory bowel disease.</a> American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 286 (1), 118-125 (2004).</li><li>Pierdominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+estrogen+receptor+&#946;+expression+with+inflammatory+bowel+disease+activity.">Linking estrogen receptor &#946; expression with inflammatory bowel disease activity.</a> Oncotarget. 6 (38), 40443-40451 (2015).</li><li>W&#322;odarczyk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-coupled+receptor+30+(GPR30)+expression+pattern+in+inflammatory+bowel+disease+patients+suggests+its+key+role+in+the+inflammatory+process.+A+preliminary+study.">G protein-coupled receptor 30 (GPR30) expression pattern in inflammatory bowel disease patients suggests its key role in the inflammatory process. A preliminary study.</a> Journal of Gastrointestinal and Liver Diseases. 26 (1), 29-35 (2017).</li><li>Mohammad, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+receptor+&#945;+contributes+to+T+cell-mediated+autoimmune+inflammation+by+promoting+T+cell+activation+and+proliferation.">Estrogen receptor &#945; contributes to T cell-mediated autoimmune inflammation by promoting T cell activation and proliferation.</a> Science Signaling. 11 (526), eaap9415 (2018).</li><li>Jacenik, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-coupled+estrogen+receptor+mediates+anti-inflammatory+action+in+Crohn's+disease.">G protein-coupled estrogen receptor mediates anti-inflammatory action in Crohn's disease.</a> Scientific Reports. 9 (1), 6749 (2019).</li><li>Prossnitz, E. R., Barton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+G+protein-coupled+estrogen+receptor+GPER+in+health+and+disease.">The G protein-coupled estrogen receptor GPER in health and disease.</a> Nature Review Endocrinology. 7 (12), 715-726 (2011).</li><li>Ya&#351;ar, P., Ayaz, G., User, S. D., G&#252;p&#252;r, G., Muyan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+estrogen-estrogen+receptor+signaling.">Molecular mechanisms of estrogen-estrogen receptor signaling.</a> Reproductive Medicine and Biology. 16 (1), 4-20 (2016).</li><li>Pizarro, T. T., Arseneau, K. O., Bamias, G., Cominelli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+the+study+of+Crohn's+disease.">Mouse models for the study of Crohn's disease.</a> Trends in Molecular Medicine. 9 (5), 218-222 (2003).</li><li>Neurath, M. F., Fuss, I., Kelsall, B. L., St&#252;ber, E., Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+interleukin+12+abrogate+established+experimental+colitis+in+mice.">Antibodies to interleukin 12 abrogate established experimental colitis in mice.</a> Journal of Experimental Medicine. 182 (5), 1281-1290 (1995).</li><li>Ikeda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simvastatin+attenuates+trinitrobenzene+sulfonic+acid-induced+colitis,+but+not+oxazalone-induced+colitis.">Simvastatin attenuates trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis, but not oxazalone-induced colitis.</a> Digestive Diseases and Sciences. 53 (7), 1869-1875 (2007).</li><li>Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Elizabeth, J., Rao, U. K., Ranganathan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+physical+basics+of+routine+formaldehyde+fixation.">Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation.</a> Journal of Oral Maxillofacial Pathology. 16 (3), 400-405 (2012).</li></ol>

Existen numerosos modelos animales para el examen de la fisiopatología de la EII, incluidos los modelos genéticos, inmunológicos o espontáneos, así como los modelos15inducidos químicamente. Entre los varios tipos de modelos animales de colitis, los modelos inducidos químicamente como el modelo inducido por TNBS descrito en este protocolo, son relativamente baratos y fáciles de obtener. El modelo murino inducido por TNBS de la colitis tiene varios síntomas clínicos relacionados con la bas...

La enfermedad de Crohn (CD) es una enfermedad inflamatoria intestinal (EII) que se manifiesta como inflamación del intestino crónico. La etiología de la CD no se entiende bien, pero hay algunos factores importantes que parecen ser responsables del desarrollo de la CD, incluida la microbiota intestinal, y los factores genéticos y ambientales, como la dieta o el estrés1. Para una mejor comprensión de la patogénesis de la enfermedad de Crohn, se han utilizado varios modelos de inflamación intestinal2,3,4,5,6,7. En este artículo, presentamos resultados obtenidos de un modelo murino inducido por ácido sulfónico (TNBS) de 2,4,6-trinitrobenzeno(TNBS) de CD.
Se ha documentado que los estrógenos son capaces de modular la inflamación intestinal crónica8,9,10,11,12. La actividad biológica de los estrógenos está mediada por receptores cognados, entre los que se encuentran los receptores de estrógeno nuclear (ER), es decir, eRE (gen ESR1)y ER ( gen ESR2), así como el receptor de estrógeno acoplado a proteínas G, es decir, GPER (gen GPER1),denominado ER13,,14. Hay varios métodos para determinar el nivel de receptores de estrógeno, pero sólo unos pocos se pueden utilizar para visualizarlos en el intestino.
La inmunohistoquímica (IHC) es un método ampliamente utilizado en estudios clínicos y básicos para la detección de ciertos antígenos en células o tejidos con anticuerpos conjugados con fluorocromo. IHC parece ser un método importante en la visualización de la estructura tisular, así como en la identificación y localización de proteínas específicas, que pueden ser cruciales para entender el desarrollo de la colitis. Aquí, presentamos un protocolo completo y validado para la visualización inmunohistoquímica de receptores de estrógeno en el intestino utilizando inmunofluorescencia.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Animals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/C mice</td>
			<td>University of Lodz</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62379-531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardboard block</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope - TCS SP8</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fully automated rotary microtome - RM2255</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J1800BMNT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated Paraffin Embedding Module - EG1150 H</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histological box</td>
			<td>Marfour</td>
			<td>LN.138747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic pen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z377821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory balance</td>
			<td>Radwag</td>
			<td>WL-104-0048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X software</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal mold</td>
			<td>Marfour</td>
			<td>CP.5105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile gauze</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile scissor</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile tweezer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue processor - TP1020</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2, 4, 6-trinitrobenzene sulfonic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>92822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiOC6 (3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>318426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DyLight 650 secondary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab96886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ER&#945; primary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab75635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ER&#946; primary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab3576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>396480111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>432173111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GPER primary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab39742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>575283421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxidase</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>885193111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane (forane)</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>1001936040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16210064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>39602012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petrie dish</td>
			<td>Nest Scientific</td>
			<td>705001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Physiological saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin (antibiotic)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifage Mountant with DAPI (glycerol-based liquid with DAPI)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Chempur</td>
			<td>WE/231-598-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>795780429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>853470115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>BA0860119</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of estrogen receptors in colons of mice with tnbs-induced crohn's disease using immunofluorescence

La enfermedad de Crohn es el tipo más diagnosticado de enfermedad inflamatoria intestinal. La inflamación crónica que se desarrolla en el intestino conduce al trastorno de peristalsis y al daño de la mucosa intestinal y parece estar asociada con un mayor riesgo de transformación neoplásica del colon. La evidencia acumulada indica que los estrógenos y los receptores de estrógenos afectan no sólo los tejidos sensibles a las hormonas, sino también otros tejidos no directamente relacionados con los estrógenos, como los pulmones o el colon. Aquí, describimos el protocolo para la correcta tinción de inmunofluorescencia de receptores de estrógeno en el colon obtenido de un modelo murino de la enfermedad de Crohn inducida por TNBS. Se proporciona un protocolo detallado para la inducción de la enfermedad de Crohn en ratones y la preparación intestinal, así como un procedimiento inmunohistoquímico paso a paso utilizando secciones intestinales fijas en parafina fijas en formalina. Los métodos descritos no sólo son útiles para la detección de receptores de estrógeno y la investigación de señalización de estrógeno in vivo, sino que también se pueden aplicar a otras proteínas que pueden estar implicadas en el desarrollo de la colitis.

Características macroscópicas de los colones en ratones con enfermedad de Crohn inducida por TNBS En la Figura 2se muestran imágenes representativas de colones tomados del control y ratones tratados con TNBS. En ratones con un modelo inducido por TNBS de la enfermedad de Crohn, la longitud del colon se reduce mientras aumenta el ancho del colon.
<img alt="Figure 2" class="xfig...

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Visualization of Estrogen Receptors in Colons of Mice with TNBS-Induced Crohn's Disease using Immunofluorescence

El protocolo presenta un modelo murino completo validado inducido por TNBS de la enfermedad de Crohn y métodos para la visualización de receptores de estrógeno por inmunohistoquímica utilizando inmunofluorescencia de secciones de colon fijas en formalina incrustadas en parafina.

Visualización de receptores de estrógeno en colones de ratones con enfermedad de Crohn inducida por TNBS utilizando inmunofluorescencia

Crohn&#39;s disease is the most diagnosed type of inflammatory bowel disease. Chronic inflammation developing in the intestine leads to peristalsis ...

La creciente evidencia sugiere el impacto de la señalización de estrógeno en la parte colónica de la fisiología, la inmunohistoquímica es una técnica prometedora para identificar los receptores de estrógeno en el colon y evolucionan en colitis. Presentamos un protocolo completo y validado para la visualización inmunohistoquímica de receptores de estrógeno en el colon, utilizando inmunofluorescencia. Junto con la Dra. Sylwia Michlewska del Laboratorio de Imagen Microscópica de la Universidad de Lodz, demostraremos el procedimiento.Coloque el colon en un plato de petri. Corta los dos puntos en fragmentos de uno a dos centímetros. Coloque cada fragmento sobre una esponja en un casete histológico debidamente etiquetado.Coloque un cassette que contenga un fragmento de dos puntos en 4%paraformaldehído. Incubar durante al menos 24 horas a cuatro grados centígrados. Preparar y programar el procesador de tejidos durante una hora de incubación en 50%70%90%95%y 100%etanol, xileno 100%etanol, y xileno solamente, así como durante al menos tres horas de incubación en parafina líquida.Transfiera el fragmento de colon a una caja histológica. Coloque la caja en el procesador de tejidos preprogramado y ejecute el procesador. Después de la incubación en el procesador de tejido, retire el colon de la caja histológica y coloque el fragmento de colon en un molde metálico, de modo que los dos extremos del colon estén en posición vertical.Llene un tercio del molde con parafina líquida. Coloque el molde en el área de enfriamiento a menos cinco grados centígrados durante unos segundos y luego mueva el molde a la zona de calentamiento a 70 grados centígrados. A continuación, coloque el molde en la parte inferior de la caja histológica y cubra todo el fragmento de colon con parafina líquida.Coloque el molde metálico que contiene el fragmento de colon y la parafina en el área de enfriamiento durante unos minutos. A continuación, retire el molde metálico del bloque de colon y parafina. Incubar el bloque de colon y parafina durante al menos 24 horas a cuatro grados centígrados.Después de la incubación, eliminar el exceso de parafina del bloque. Inserte el bloque de colon y parafina en un microtomo rotativo totalmente automatizado. Corte el fragmento de colon en secciones de cinco micrómetros.Transfiera una sección de dos puntos a un baño de agua, precalentado a 40 grados centígrados. Utilice el portaobjetos de vidrio etiquetado para retirar la sección de colon del baño de agua e incubar el tobogán de vidrio a temperatura ambiente durante 24 horas. Primero, retire la parafina incubando el portaobjetos de vidrio en xileno durante cinco minutos.Repita este paso tres veces. A continuación, coloque el portaobjetos de vidrio en una mezcla uno a uno de xileno y 100% etanol durante cinco minutos. Repita este paso tres veces.Utilice una serie de concentraciones de etanol decrecientes para rehidratar la sección del colon. Sumerja el tobogán en etanol durante cinco minutos. Repita tres veces en cada concentración antes de pasar a la siguiente concentración.Enjuague el tobogán de vidrio con agua corriente durante cinco minutos. Recalentar el búfer de recuperación de antígenos a 95 a 98 grados centígrados. A continuación, caliente el portaobjetos de vidrio en solución de recuperación de antígenos hirviendo durante 10 minutos.Para evitar el desperdicio de reactivos, utilice una pluma hidrófoba para dibujar un círculo alrededor de la sección del colon. Luego, incubar el tobogán durante 10 minutos en una solución del 3% de hidrógeno peroxidasa y agua. Lave el portaobjetos en una solución de lavado durante cinco minutos.A continuación, incubar el portaobjetos en solución de bloqueo durante una hora a temperatura ambiente. Retire la solución de bloqueo y añada de 20 a 50 microlitros de anticuerpo primario contra E-R alfa, E-R beta o G-P-E-R diluidos. Incubar el anticuerpo primario durante la noche a cuatro grados centígrados en la oscuridad.Retire la solución de anticuerpos. Lave el portaobjetos tres veces en la solución de lavado durante cinco minutos cada vez. A continuación, agregue un anticuerpo secundario diluido.Incubar el portaobjetos con anticuerpos secundarios conjugados con tinte durante una hora a temperatura ambiente en la oscuridad. Retire la solución de anticuerpos secundaria de la diapositiva. Lave el portaobjetos tres veces en la solución de lavado durante cinco minutos cada vez.Añadir fluorocromo diluido para la visualización de la membrana e incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Retire la solución y lave el portaobjetos tres veces en la solución de lavado durante cinco minutos cada vez. Agregue unas gotas de DAPI líquido a base de glicerol, un fluorocromo para la visualización de núcleos celulares, directamente en la sección del colon.Cúbralo cuidadosamente con una corredera de cubierta. Incubar la sección del colon durante al menos 24 horas a cuatro grados centígrados. Analice la sección de colon bajo un microscopio confocal con objetivos 20x o 63x e inmersión en aceite.La especificidad de los anticuerpos utilizados en el estudio se validó utilizando células MCF-7. Los anticuerpos del receptor de estrógenos permitieron la detección de receptores de estrógeno nucleares E-R alfa y E-R beta, así como el receptor de estrógeno ligado a la membrana G-P-E-R. También se realizó un control negativo en el que las células MCF-7 se tiñeron sólo con anticuerpos secundarios conjugados con fluorocromo y un líquido a base de glicerol con DAPI.Se encontró una señal citoplasmático fuerte de E-R alfa en las secciones de colon obtenidas de ratones de control y de ratones con enfermedad de Crohn inducida por TNBS. Sin embargo, sólo los colones obtenidos de ratones de control tenían E-R alfa localizado en el citoplasma de células de copa. La microscopía confocal también reveló la localización citoplasmático de E-R beta en las secciones de colon tanto de control como en los ratones tratados con TNBS.Del mismo modo, se documentó la localización citoplasmático de G-P-E-R en las secciones de colon obtenidas a partir de ratones de control y ratones tratados con TNBS. El posicionamiento correcto de los dos puntos en el molde es esencial para generar la sección transversal correcta. El fluorocromo debe seleccionarse por su propio espectro de excitación y emisión.Este método también se puede aplicar a otras proteínas que pueden estar implicadas en el desarrollo de la colitis. La detección inmunohistoquímica por inmunofluorescencia se puede extender para manchar otras proteínas en estado de dirección proteína-proteína.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Automatizado de dispensación acústica para la dilución en serie del péptido Los agonistas de la potencia Ensayos de Determinación

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

Investigación

Bioquímica

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Detección y visualización de los complejos de proteínas inducidos por daño de ADN en cultivos de células en suspensión usando el ensayo de ligación de proximidad

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Simple Elimination of Background Fluorescence in Formalin-Fixed Human Brain Tissue for Immunofluorescence Microscopy

Simple eliminación de la fluorescencia del fondo en el tejido cerebral humano fijados con formol para microscopia de la inmunofluorescencia

Immunofluorescence is a common method used to visualize subcellular compartments and to determine the localization of specific proteins within a tissue ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Caracterización de las glicoproteínas con el doblez de la inmunoglobulina por cristalografía de rayos x y técnicas biofísicas

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Identification of Orexin and Endocannabinoid Receptors in Adult Zebrafish Using Immunoperoxidase and Immunofluorescence Methods

Identificación de receptores de orexina y endocannabinoides en peces cebra adultos mediante métodos de inmunoperoxidasa e inmunofluorescencia

Immunohistochemistry (IHC) is a highly sensitive and specific technique involved in the detection of target antigens in tissue sections with labeled ...

An In Vivo Estrogen Deficiency Mouse Model for Screening Exogenous Estrogen Treatments of Cardiovascular Dysfunction After Menopause

Un modelo de ratón con deficiencia de estrógeno In Vivo para la detección de tratamientos de estrógeno exógeno sorgénicos de la disfunción cardiovascular después de la menopausia

Postmenopausal women are at greater risk of developing cardiovascular diseases than premenopausal women. Female mice ovariectomized (OVX) at weaning ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Interacciones con y la permeabilización de membrana de las mitocondrias cerebrales por Amiloide Fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  ÃƒÅ½Ã‚Â² Reporter Assay

Detección de fitoestrógenos usando un ensayo de receptores de estrógeno a base de células β Reporter

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...

Transplantation of Neonatal Mouse Cardiac Macrophages into Adult Mice

Trasplante de macrófagos cardíacos neonatales de ratón en ratones adultos

In an injured neonatal myocardium, macrophages facilitate cardiomyocyte proliferation and angiogenesis and promote heart regeneration. The present study ...