Name: visualization of estrogen receptors in colons of mice with tnbs-induced crohn's disease using immunofluorescence
Uploaded: 2020-03-12T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Estrogen Receptors in Colons of Mice with TNBS-Induced Crohn's Disease using Immunofluorescence at JoVE.com

Arbetet publicerades tack vare det ekonomiska stödet från lodz universitet: vice rektor för vetenskaplig forskning, rektor för nationellt och internationellt samarbete och dekanus vid fakulteten för biologi och miljöskydd. Damian Jacenik stöddes av bidrag (2017/24/T/NZ5/00045 och 2015/17/N/NZ5/00336) från National Science Centre, Polen.

Djurstudier genomfördes med samtycke från den lokala etiska kommittén (28/ŁB29/2016) i enlighet med Europaparlamentets och rådets direktiv 2010/63/EU av den 22 september 2010 och institutionella rekommendationer.
1. TNBS-inducerad murine modell av Crohns sjukdom
OBS: Detta protokoll använder hane BALB/C möss som väger 25-28 g. Djuren hålls vid en konstant temperatur (22-24 °C) och, relativ fuktighet 55 ± 5%, och underhålls i en 12 h ljus/mörk cykel med fr...

<ol>
	<li>Zhang, Y. Z., Li, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+bowel+disease:+pathogenesis.">Inflammatory bowel disease: pathogenesis.</a> World Journal of Gastroenterology. 20 (1), 91-99 (2014).</li><li>Morris, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hapten-induced+model+of+chronic+inflammation+and+ulceration+in+the+rat+colon.">Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon.</a> Gastroenterology. 96 (3), 795-803 (1989).</li><li>Okayasu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+in+the+induction+of+reliable+experimental+acute+and+chronic+ulcerative+colitis+in+mice.">A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice.</a> Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).</li><li>Boirivant, M., Fuss, I. J., Chu, A., Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxazolone+colitis:+a+murine+model+of+T+helper+cell+type+2+colitis+treatable+with+antibodies+to+interleukin+4.">Oxazolone colitis: a murine model of T helper cell type 2 colitis treatable with antibodies to interleukin 4.</a> Journal of Experimental Medicine. 188 (10), 1929-1939 (1998).</li><li>Morrissey, P. J., Charrier, K., Braddy, S., Liggitt, D., Watson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4++T+cells+that+express+high+levels+of+CD45RB+induce+wasting+disease+when+transferred+into+congenic+severe+combined+immunodeficient+mice.+Disease+development+is+prevented+by+cotransfer+of+purified+CD4++T+cells.">CD4+ T cells that express high levels of CD45RB induce wasting disease when transferred into congenic severe combined immunodeficient mice. Disease development is prevented by cotransfer of purified CD4+ T cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 178 (1), 237-244 (1993).</li><li>K&#252;hn, R., L&#246;hler, J., Rennick, D., Rajewsky, K., M&#252;ller, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-10-deficient+mice+develop+chronic+enterocolitis.">Interleukin-10-deficient mice develop chronic enterocolitis.</a> Cell. 75 (2), 263-274 (1993).</li><li>Sundberg, J. P., Elson, C. O., Bedigian, H., Birkenmeier, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous,+heritable+colitis+in+a+new+substrain+of+C3H/HeJ+mice.">Spontaneous, heritable colitis in a new substrain of C3H/HeJ mice.</a> Gastroenterology. 107 (6), 1726-1735 (1994).</li><li>Harnish, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beneficial+effects+of+estrogen+treatment+in+the+HLA-B27+transgenic+rat+model+of+inflammatory+bowel+disease.">Beneficial effects of estrogen treatment in the HLA-B27 transgenic rat model of inflammatory bowel disease.</a> American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 286 (1), 118-125 (2004).</li><li>Pierdominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+estrogen+receptor+&#946;+expression+with+inflammatory+bowel+disease+activity.">Linking estrogen receptor &#946; expression with inflammatory bowel disease activity.</a> Oncotarget. 6 (38), 40443-40451 (2015).</li><li>W&#322;odarczyk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-coupled+receptor+30+(GPR30)+expression+pattern+in+inflammatory+bowel+disease+patients+suggests+its+key+role+in+the+inflammatory+process.+A+preliminary+study.">G protein-coupled receptor 30 (GPR30) expression pattern in inflammatory bowel disease patients suggests its key role in the inflammatory process. A preliminary study.</a> Journal of Gastrointestinal and Liver Diseases. 26 (1), 29-35 (2017).</li><li>Mohammad, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+receptor+&#945;+contributes+to+T+cell-mediated+autoimmune+inflammation+by+promoting+T+cell+activation+and+proliferation.">Estrogen receptor &#945; contributes to T cell-mediated autoimmune inflammation by promoting T cell activation and proliferation.</a> Science Signaling. 11 (526), eaap9415 (2018).</li><li>Jacenik, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-coupled+estrogen+receptor+mediates+anti-inflammatory+action+in+Crohn's+disease.">G protein-coupled estrogen receptor mediates anti-inflammatory action in Crohn's disease.</a> Scientific Reports. 9 (1), 6749 (2019).</li><li>Prossnitz, E. R., Barton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+G+protein-coupled+estrogen+receptor+GPER+in+health+and+disease.">The G protein-coupled estrogen receptor GPER in health and disease.</a> Nature Review Endocrinology. 7 (12), 715-726 (2011).</li><li>Ya&#351;ar, P., Ayaz, G., User, S. D., G&#252;p&#252;r, G., Muyan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+estrogen-estrogen+receptor+signaling.">Molecular mechanisms of estrogen-estrogen receptor signaling.</a> Reproductive Medicine and Biology. 16 (1), 4-20 (2016).</li><li>Pizarro, T. T., Arseneau, K. O., Bamias, G., Cominelli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+the+study+of+Crohn's+disease.">Mouse models for the study of Crohn's disease.</a> Trends in Molecular Medicine. 9 (5), 218-222 (2003).</li><li>Neurath, M. F., Fuss, I., Kelsall, B. L., St&#252;ber, E., Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+interleukin+12+abrogate+established+experimental+colitis+in+mice.">Antibodies to interleukin 12 abrogate established experimental colitis in mice.</a> Journal of Experimental Medicine. 182 (5), 1281-1290 (1995).</li><li>Ikeda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simvastatin+attenuates+trinitrobenzene+sulfonic+acid-induced+colitis,+but+not+oxazalone-induced+colitis.">Simvastatin attenuates trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis, but not oxazalone-induced colitis.</a> Digestive Diseases and Sciences. 53 (7), 1869-1875 (2007).</li><li>Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Elizabeth, J., Rao, U. K., Ranganathan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+physical+basics+of+routine+formaldehyde+fixation.">Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation.</a> Journal of Oral Maxillofacial Pathology. 16 (3), 400-405 (2012).</li></ol>

Det finns många djurmodeller för IBD patofysiologi undersökning, inklusive genetiska, immunologiska eller spontana modeller, samt kemiskt inducerade modeller15. Bland de flera typer av djurmodeller av kolit, kemiskt inducerade modeller såsom TNBS-inducerad modell som beskrivs i detta protokoll, är relativt billiga och lätta att få. Den TNBS-induceradmurine modell av kolit har flera kliniska symtom relaterade till den patologiska grunden för CD. Djur med inducerad kolit kännetecknas av ink...

Crohns sjukdom (CD) är en inflammatorisk tarmsjukdom (IBD) manifesteras som kronisk tarminflammation. Etiologin av CD är dåligt förstås, men det finns några viktiga faktorer som verkar vara ansvarig för CD utveckling, inklusive intestinala mikrobiota, och genetiska och miljömässiga faktorer, såsom kost eller stress1. För en bättre förståelse av patogenesen vid Crohns sjukdom har flera modeller av tarminflammation använts2,3,44,5,6,7. I den här artikeln presenterar vi resultat från en 2,4,6-trinitrobensen sulfonsyra (TNBS)-inducerad murine modell av CD.
Det har dokumenterats att östrogener kan modulera kronisk tarminflammation8,9,10,11,12. Den biologiska aktiviteten hos östrogener medieras av cognate receptorer, bland vilka är nukleära östrogenreceptorer (ERs), dvs ERα (gen ESR1)och ERβ (gen ESR2), samt G protein-kopplade östrogenreceptorn, dvs GPER (gen GPER1), kallad membran-bundna ER13,14. Det finns flera metoder för att bestämma nivån av östrogenreceptorer, men endast ett fåtal kan användas för att visualisera dem i tarmen.
Immunohistochemistry (IHC) är en allmänt använd metod i kliniska och grundläggande studier för påvisande av vissa antigener i celler eller vävnader med fluorokromekonjugerade antikroppar. IHC verkar vara en viktig metod i vävnadsstruktur visualisering, liksom i identifiering och lokalisering av specifika proteiner, vilket kan vara avgörande för att förstå utvecklingen av kolit. Här presenterar vi ett komplett och validerat protokoll för immunohistochemical visualisering av östrogenreceptorer i tarmen med hjälp av immunfluorescens.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Animals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/C mice</td>
			<td>University of Lodz</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62379-531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardboard block</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope - TCS SP8</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fully automated rotary microtome - RM2255</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J1800BMNT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated Paraffin Embedding Module - EG1150 H</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histological box</td>
			<td>Marfour</td>
			<td>LN.138747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic pen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z377821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory balance</td>
			<td>Radwag</td>
			<td>WL-104-0048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X software</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal mold</td>
			<td>Marfour</td>
			<td>CP.5105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile gauze</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile scissor</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile tweezer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue processor - TP1020</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2, 4, 6-trinitrobenzene sulfonic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>92822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiOC6 (3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>318426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DyLight 650 secondary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab96886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ER&#945; primary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab75635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ER&#946; primary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab3576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>396480111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>432173111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GPER primary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab39742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>575283421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxidase</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>885193111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane (forane)</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>1001936040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16210064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>39602012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petrie dish</td>
			<td>Nest Scientific</td>
			<td>705001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Physiological saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin (antibiotic)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifage Mountant with DAPI (glycerol-based liquid with DAPI)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Chempur</td>
			<td>WE/231-598-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>795780429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>853470115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>BA0860119</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of estrogen receptors in colons of mice with tnbs-induced crohn's disease using immunofluorescence

Crohns sjukdom är den mest diagnostiserade typen av inflammatorisk tarmsjukdom. Kronisk inflammation utvecklas i tarmen leder till peristaltik sjukdom och skador på tarmslemhinnan och verkar vara associerad med en ökad risk för kolon neoplastisk omvandling. Ackumulerande bevis tyder på att östrogener och östrogenreceptorer påverkar inte bara hormonkänsliga vävnader, men också andra vävnader som inte är direkt relaterade till östrogener, såsom lungorna eller tjocktarmen. Här beskriver vi protokollet för framgångsrik immunofluorescens färgning av östrogenreceptorer i kolon som erhållits från en murine modell av TNBS-inducerad Crohns sjukdom. Ett detaljerat protokoll för induktion av Crohns sjukdom hos möss och tarmberedning tillhandahålls samt ett steg-för-steg immunohistochemical förfarande med hjälp av formalin-fast paraffin-inbäddade tarmar sektioner. De beskrivna metoderna är inte bara användbara för östrogenreceptordetektion och östrogensignaleringsundersökning in vivo men kan också tillämpas på för andra proteiner som kan vara involverade i utvecklingen av kolit.

Makroskopiska egenskaper hos kolon hos möss med TNBS-inducerad Crohns sjukdom Representativa bilder av kolon tagna från kontroll och TNBS-behandlade möss visas i figur 2. Hos möss med en TNBS-inducerad modell av Crohns sjukdom minskas kolons längd medan tjocktarmens bredd ökar.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60813/60813fig2a.jpg"> Figu...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Estrogen Receptors in Colons of Mice with TNBS-Induced Crohn's Disease using Immunofluorescence at JoVE.com

Visualization of Estrogen Receptors in Colons of Mice with TNBS-Induced Crohn's Disease using Immunofluorescence

Protokollet presenterar en komplett validerad TNBS-inducerad murine modell av Crohns sjukdom och metoder för visualisering av östrogenreceptorer av immunohistochemistry med immunofluorescens av formalin-fast kolon sektioner inbäddade i paraffin.

Visualisering av östrogenreceptorer i kolon av möss med TNBS-inducerad Crohns sjukdom med immunfluorescens

Crohn&#39;s disease is the most diagnosed type of inflammatory bowel disease. Chronic inflammation developing in the intestine leads to peristalsis ...

Ökande bevis tyder på effekterna av östrogen signalering på den colonic delen av fysiologi, immunohistokemi är en lovande teknik för att identifiera östrogenreceptorer i tjocktarmen och de utvecklas till kolit. Vi presenterar ett komplett och validerat protokoll för immunohistochemical visualisering av östrogen receptorer i kolon, med hjälp av immunofluorescens. Tillsammans med Dr.Sylwia Michlewska från Laboratory of Microscopic Imaging vid universitetet i Lodz kommer vi att demonstrera proceduren.Placera kolon i en petriskål. Skär tjocktarmen i ett till två centimeters fragment. Placera varje fragment på en svamp i en lämpligt märkt histologisk kassett.Placera en kassett som innehåller ett kolonfragment i 4%paraformaldehyd. Inkubera i minst 24 timmar vid fyra grader celsius. Förbered och programmera vävnadsbehandlaren för en timmes inkubation i 50%70%90%95%och 100%etanol, xylen 100%etanol, och endast xylen, samt under minst tre timmars inkubation i flytande paraffin.Överför kolonfragmentet till en histologisk låda. Placera lådan i den förprogrammerade vävnadsprocessorn och kör processorn. Efter inkubation i vävnadsbehandlaren ta bort tjocktarmen från histologiska rutan och placera kolon fragmentet i en metall mögel, så att de två ändarna av tjocktarmen är i upprätt läge.Fyll en tredjedel av formen med flytande paraffin. Placera formen i kylområdet på minus fem grader celsius i några sekunder och sedan flytta mögel till det värmande området vid 70 grader celsius. Placera sedan formen i bottendelen av den histologiska lådan och täck hela kolonfragmentet med flytande paraffin.Placera metallformen som innehåller kolonfragmentet och paraffin i kylområdet i några minuter. Ta sedan bort metallformen från kolon och paraffinblocket. Inkubera kolon och paraffin blocket i minst 24 timmar vid fyra grader celsius.Efter inkubation, avlägsna överskott paraffin från blocket. Sätt in kolon- och paraffinblocket i en helt automatiserad roterande mikrotom. Skär kolonfragmentet i fem mikrometersektioner.Överför en kolonsektion till ett vattenbad, förvärmt till 40 grader celsius. Använd den märkta glasglaset för att ta bort kolondelen från vattenbadet och inkubera glasrutschkanan i rumstemperatur i 24 timmar. Ta först bort paraffinet genom att inkubera glasglaset i xylen i fem minuter.Upprepa detta steg tre gånger. Placera sedan glasglaset i en en-till-en blandning av xylen och 100%etanol i fem minuter. Upprepa detta steg tre gånger.Använd en serie minskande etanol koncentrationer för att rehydrera kolon avsnittet. Sänk ned glidningen i etanolen i fem minuter. Upprepa tre gånger vid varje koncentration innan du fortsätter till nästa koncentration.Skölj glasrutschkanan under rinnande vatten i fem minuter. Värm upp antigenhämtningsbufferten till 95 till 98 grader celsius. Värm sedan glasglaset i kokande antigenhämtningslösning i 10 minuter.För att förhindra avfall av reagenser, använd en hydrofoba penna för att rita en cirkel runt kolonsektionen. Därefter, inkubera bilden i 10 minuter i en 3%lösning av väteperoxidas och vatten. Tvätta objektglaset i tvättlösning i fem minuter.Inkubera sedan glidningen i spärrlösning i en timme i rumstemperatur. Ta bort blockeringslösningen och tillsätt 20 till 50 mikroliter av primär antikropp mot E-R alfa, E-R beta eller G-P-E-R utspädd. Inkubera den primära antikroppen över natten vid fyra grader celsius i mörker.Ta bort antikroppslösningen. Tvätta objektglaset tre gånger i tvättlösning i fem minuter varje gång. Därefter lägger spädd sekundär antikropp.Inkubera objektglaset med sekundär antikropp konjugerad med färgämne i en timme i rumstemperatur i mörker. Ta bort den sekundära antikroppslösningen från objektglaset. Tvätta objektglaset tre gånger i tvättlösning i fem minuter varje gång.Tillsätt utspädd fluorokrom för membranvisualisering och inkubera i 10 minuter i rumstemperatur i mörker. Ta bort lösningen och tvätta objektglaset tre gånger i tvättlösning i fem minuter varje gång. Tillsätt några droppar glycerol-baserade flytande DAPI, en fluorokrom för cellkärnor visualisering, direkt på kolon avsnitt.Täck den försiktigt med en omslagsrutschbana. Inkubera kolonsektionen i minst 24 timmar vid fyra grader celsius. Analysera kolon avsnittet under en confocal mikroskop featuring 20x eller 63x mål och olja nedsänkning.Specificiteten hos de antikroppar som användes i studien validerades med hjälp av MCF- 7-celler. Östrogenreceptorantikropparna möjliggjorde detektion av nukleära östrogenreceptorer E-R alfa och E-R beta samt den membranbundna östrogenreceptorn G-P-E-R. En negativ kontroll utfördes också där MCF-7 celler var färgas endast med sekundära antikroppar konjugerat med fluorokrom och en glycerol-baserade vätska med DAPI.En stark cytoplasmatisk signal av E-R alfa hittades i kolon avsnitten erhållits från kontroll möss och från möss med TNBS-inducerad crohns sjukdom. Endast de kolon som erhållits från kontroll möss hade dock E-R alfa lokaliserade i bingecell cytoplasman. Confocal microscopy visade också cytoplasmatisk lokalisering av E-R beta i kolon avsnitten av både kontroll och de TNBS-behandlade möss.På samma sätt dokumenterades cytoplasmatisk lokalisering av G-P-E-R i de kolonsektioner som erhållits från kontrollmöss och de TNBS-behandlade mössen. Den korrekta positionering av tjocktarmen i formen är avgörande för att generera rätt tvärsnitt. Fluorokrom bör väljas ut genom sitt eget excitations- och emissionsspektrum.Denna metod kan också tillämpas på andra proteiner som kan vara inblandade i utvecklingen av kolit. Immunohistokemi detektering genom immunofluorescens kan utvidgas till att fläcka andra proteiner i protein-protein riktning status.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Automatiserad Acoustic Utlämning för serieutspädning av peptidagonister i Styrka Fastställande Analyser

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Detektion och visualisering av DNA-skada-inducerad proteinkomplex i suspensionscellkulturer med användning av Proximity Ligation Assay

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Simple Elimination of Background Fluorescence in Formalin-Fixed Human Brain Tissue for Immunofluorescence Microscopy

Enkel eliminering av bakgrunden fluorescens i Formalin-fast mänsklig hjärnvävnad för immunofluorescens mikroskopi

Immunofluorescence is a common method used to visualize subcellular compartments and to determine the localization of specific proteins within a tissue ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Karakterisering av glykoproteiner med immunglobulin luckan av röntgenkristallografi och biofysiska tekniker

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Identification of Orexin and Endocannabinoid Receptors in Adult Zebrafish Using Immunoperoxidase and Immunofluorescence Methods

Identifiering av Orexin och Endocannabinoid receptorer hos vuxna zebra fiskar med Immunoperoxidas och immunofluorescens metoder

Immunohistochemistry (IHC) is a highly sensitive and specific technique involved in the detection of target antigens in tissue sections with labeled ...

An In Vivo Estrogen Deficiency Mouse Model for Screening Exogenous Estrogen Treatments of Cardiovascular Dysfunction After Menopause

En in vivo östrogenbrist musmodell för screening exogena östrogen behandlingar av kardiovaskulär dysfunktion efter klimakteriet

Postmenopausal women are at greater risk of developing cardiovascular diseases than premenopausal women. Female mice ovariectomized (OVX) at weaning ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Interaktioner med och membran permeabilisering av hjärnans Mitokona av amyloid fibriller

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  ÃƒÅ½Ã‚Â² Reporter Assay

Screening för fytoöstrogener med hjälp av en cellbaserad östrogenreceptor β Reporter Assay

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...

Transplantation of Neonatal Mouse Cardiac Macrophages into Adult Mice

Transplantation av neonatalmus hjärtmakrofager till vuxna möss

In an injured neonatal myocardium, macrophages facilitate cardiomyocyte proliferation and angiogenesis and promote heart regeneration. The present study ...