Name: visualization of estrogen receptors in colons of mice with tnbs-induced crohn's disease using immunofluorescence
Uploaded: 2020-03-12T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Estrogen Receptors in Colons of Mice with TNBS-Induced Crohn's Disease using Immunofluorescence at JoVE.com

Çalışma, Lodz Üniversitesi yetkililerinin mali desteği sayesinde yayınlandı: Bilimsel Araştırmadan Sorumlu Rektör Yardımcısı, Ulusal ve Uluslararası İşbirliğinden Sorumlu Rektör Yardımcısı ve Biyoloji ve Çevre Koruma Fakültesi Dekanı. Damian Jacenik, Polonya Ulusal Bilim Merkezi'nden (2017/24/T/NZ5/00045 ve 2015/17/N/NZ5/00336) hibeler ile desteklenmiştir.

Hayvan çalışmaları, Avrupa Parlamentosu'nun 2010/63/AB Direktifi ve 22 Eylül 2010 Tarihli Konsey Direktifi ve kurumsal tavsiyeler doğrultusunda Yerel Etik Komitesi'nin (28/ŁB29/2016) onayı ile gerçekleştirilmiştir.
1. Crohn hastalığının TNBS kaynaklı ürinen üriner modeli
NOT: Bu protokol, 25-28 g. Ağırlığındaki erkek BALB/C farelerini kullanır. ad libitum
<ol><li>Fareyi indüksiyon odasına yerleştirin ve kapağı sıkıca kapatı...

<ol>
	<li>Zhang, Y. Z., Li, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+bowel+disease:+pathogenesis.">Inflammatory bowel disease: pathogenesis.</a> World Journal of Gastroenterology. 20 (1), 91-99 (2014).</li><li>Morris, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hapten-induced+model+of+chronic+inflammation+and+ulceration+in+the+rat+colon.">Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon.</a> Gastroenterology. 96 (3), 795-803 (1989).</li><li>Okayasu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+in+the+induction+of+reliable+experimental+acute+and+chronic+ulcerative+colitis+in+mice.">A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice.</a> Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).</li><li>Boirivant, M., Fuss, I. J., Chu, A., Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxazolone+colitis:+a+murine+model+of+T+helper+cell+type+2+colitis+treatable+with+antibodies+to+interleukin+4.">Oxazolone colitis: a murine model of T helper cell type 2 colitis treatable with antibodies to interleukin 4.</a> Journal of Experimental Medicine. 188 (10), 1929-1939 (1998).</li><li>Morrissey, P. J., Charrier, K., Braddy, S., Liggitt, D., Watson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4++T+cells+that+express+high+levels+of+CD45RB+induce+wasting+disease+when+transferred+into+congenic+severe+combined+immunodeficient+mice.+Disease+development+is+prevented+by+cotransfer+of+purified+CD4++T+cells.">CD4+ T cells that express high levels of CD45RB induce wasting disease when transferred into congenic severe combined immunodeficient mice. Disease development is prevented by cotransfer of purified CD4+ T cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 178 (1), 237-244 (1993).</li><li>K&#252;hn, R., L&#246;hler, J., Rennick, D., Rajewsky, K., M&#252;ller, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-10-deficient+mice+develop+chronic+enterocolitis.">Interleukin-10-deficient mice develop chronic enterocolitis.</a> Cell. 75 (2), 263-274 (1993).</li><li>Sundberg, J. P., Elson, C. O., Bedigian, H., Birkenmeier, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous,+heritable+colitis+in+a+new+substrain+of+C3H/HeJ+mice.">Spontaneous, heritable colitis in a new substrain of C3H/HeJ mice.</a> Gastroenterology. 107 (6), 1726-1735 (1994).</li><li>Harnish, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beneficial+effects+of+estrogen+treatment+in+the+HLA-B27+transgenic+rat+model+of+inflammatory+bowel+disease.">Beneficial effects of estrogen treatment in the HLA-B27 transgenic rat model of inflammatory bowel disease.</a> American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 286 (1), 118-125 (2004).</li><li>Pierdominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+estrogen+receptor+&#946;+expression+with+inflammatory+bowel+disease+activity.">Linking estrogen receptor &#946; expression with inflammatory bowel disease activity.</a> Oncotarget. 6 (38), 40443-40451 (2015).</li><li>W&#322;odarczyk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-coupled+receptor+30+(GPR30)+expression+pattern+in+inflammatory+bowel+disease+patients+suggests+its+key+role+in+the+inflammatory+process.+A+preliminary+study.">G protein-coupled receptor 30 (GPR30) expression pattern in inflammatory bowel disease patients suggests its key role in the inflammatory process. A preliminary study.</a> Journal of Gastrointestinal and Liver Diseases. 26 (1), 29-35 (2017).</li><li>Mohammad, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+receptor+&#945;+contributes+to+T+cell-mediated+autoimmune+inflammation+by+promoting+T+cell+activation+and+proliferation.">Estrogen receptor &#945; contributes to T cell-mediated autoimmune inflammation by promoting T cell activation and proliferation.</a> Science Signaling. 11 (526), eaap9415 (2018).</li><li>Jacenik, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-coupled+estrogen+receptor+mediates+anti-inflammatory+action+in+Crohn's+disease.">G protein-coupled estrogen receptor mediates anti-inflammatory action in Crohn's disease.</a> Scientific Reports. 9 (1), 6749 (2019).</li><li>Prossnitz, E. R., Barton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+G+protein-coupled+estrogen+receptor+GPER+in+health+and+disease.">The G protein-coupled estrogen receptor GPER in health and disease.</a> Nature Review Endocrinology. 7 (12), 715-726 (2011).</li><li>Ya&#351;ar, P., Ayaz, G., User, S. D., G&#252;p&#252;r, G., Muyan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+estrogen-estrogen+receptor+signaling.">Molecular mechanisms of estrogen-estrogen receptor signaling.</a> Reproductive Medicine and Biology. 16 (1), 4-20 (2016).</li><li>Pizarro, T. T., Arseneau, K. O., Bamias, G., Cominelli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+the+study+of+Crohn's+disease.">Mouse models for the study of Crohn's disease.</a> Trends in Molecular Medicine. 9 (5), 218-222 (2003).</li><li>Neurath, M. F., Fuss, I., Kelsall, B. L., St&#252;ber, E., Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+interleukin+12+abrogate+established+experimental+colitis+in+mice.">Antibodies to interleukin 12 abrogate established experimental colitis in mice.</a> Journal of Experimental Medicine. 182 (5), 1281-1290 (1995).</li><li>Ikeda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simvastatin+attenuates+trinitrobenzene+sulfonic+acid-induced+colitis,+but+not+oxazalone-induced+colitis.">Simvastatin attenuates trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis, but not oxazalone-induced colitis.</a> Digestive Diseases and Sciences. 53 (7), 1869-1875 (2007).</li><li>Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Elizabeth, J., Rao, U. K., Ranganathan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+physical+basics+of+routine+formaldehyde+fixation.">Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation.</a> Journal of Oral Maxillofacial Pathology. 16 (3), 400-405 (2012).</li></ol>

Genetik, immünolojik veya spontan modeller de dahil olmak üzere IBD patofizyolojisi muayenesi için çok sayıda hayvan modeli, yanı sıra kimyasal olarak indüklenen modeller15vardır. Kolitin çeşitli hayvan modelleri arasında, bu protokolde açıklanan TNBS kaynaklı model gibi kimyasal kaynaklı modeller nispeten ucuz ve elde edilmesi kolaydır. Kolitin TNBS'ye bağlı murine modelinde CD'nin patolojik temeli ile ilgili çeşitli klinik semptomlar vardır. İndüklenen kolit olan hayvanla...

Crohn hastalığı (CD) kronik bağırsak iltihabı olarak kendini gösteren inflamatuar bir barsak hastalığıdır (IBD). CD etiyolojisi kötü anlaşılmaktadır, ancak cd gelişimi için sorumlu gibi görünen birkaç önemli faktörler vardır, bağırsak mikrobiyota dahil, ve genetik ve çevresel faktörler, diyet veya stres gibi1. Crohn hastalığının patogenezinin daha iyi anlaşılması için, bağırsak iltihabının çeşitli modelleri,2,3,34,5,6,7olarak kullanılmaktadır. Bu makalede, CD'nin 2,4,6-trinitrobenzene sülfonik asit (TNBS) kaynaklı murine modelinden elde edilen sonuçları satıyoruz.
Bu östrojenler kronik bağırsak iltihabı8,9,,10,,11,12modüle yeteneğine sahip olduğu belgelenmiştir. Östrojenlerin biyolojik aktivitesi, aralarında nükleer östrojen reseptörleri (ER), yani ERα (ESR1geni) ve ERβ (ESR2geni) ve G proteinle birleşen östrojen reseptörü, yani GPER (gen GPER1),membrana bağlı ER13,14gibi konjenital reseptörler tarafından aracılık edilir. Östrojen reseptörlerinin düzeyini belirlemek için çeşitli yöntemler vardır, ama sadece birkaç bağırsakta onları görselleştirmek için kullanılabilir.
İmmünohistokimya (IHC), florokrom konjuge antikorları olan hücre veya dokularda bazı antijenlerin saptanması için klinik ve temel çalışmalarda yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. IHC doku yapısı görselleştirme önemli bir yöntem gibi görünüyor, yanı sıra belirlenmesi ve kolit gelişimini anlamak için çok önemli olabilir belirli proteinlerin lokalizasyonu. Burada, immünoresans kullanarak bağırsakta östrojen reseptörlerinin immünohistokimyasal görüntüleme için tam ve doğrulanmış bir protokol salıyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Animals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/C mice</td>
			<td>University of Lodz</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62379-531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardboard block</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope - TCS SP8</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fully automated rotary microtome - RM2255</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J1800BMNT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated Paraffin Embedding Module - EG1150 H</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histological box</td>
			<td>Marfour</td>
			<td>LN.138747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic pen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z377821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory balance</td>
			<td>Radwag</td>
			<td>WL-104-0048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X software</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal mold</td>
			<td>Marfour</td>
			<td>CP.5105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile gauze</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile scissor</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile tweezer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue processor - TP1020</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2, 4, 6-trinitrobenzene sulfonic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>92822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiOC6 (3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>318426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DyLight 650 secondary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab96886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ER&#945; primary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab75635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ER&#946; primary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab3576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>396480111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>432173111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GPER primary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab39742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>575283421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxidase</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>885193111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane (forane)</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>1001936040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16210064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>39602012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petrie dish</td>
			<td>Nest Scientific</td>
			<td>705001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Physiological saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin (antibiotic)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifage Mountant with DAPI (glycerol-based liquid with DAPI)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Chempur</td>
			<td>WE/231-598-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>795780429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>853470115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Avantor Performance Materials Poland</td>
			<td>BA0860119</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of estrogen receptors in colons of mice with tnbs-induced crohn's disease using immunofluorescence

Crohn hastalığı inflamatuar barsak hastalığının en çok tanı konulan tipidir. Bağırsakta gelişen kronik inflamasyon peristalsis bozukluğu ve bağırsak mukozası hasarına yol açar ve kolon neoplastik dönüşüm riski ile ilişkili gibi görünüyor. Kanıt birikmesi östrojen ler ve östrojen reseptörleri sadece hormona duyarlı dokuları etkiler gösterir, ama aynı zamanda diğer dokular doğrudan östrojen ile ilgili değil, akciğerler veya kolon gibi. Burada, tnbs kaynaklı Crohn hastalığının bir murine modelinden elde edilen kolonda östrojen reseptörlerinin başarılı immünororesans boyama protokolünü açıklıyoruz. Crohn hastalığının fare ve bağırsak preparatına indüksiyonu için ayrıntılı bir protokol ve formalin-sabit parafin gömülü bağırsak bölümleri kullanılarak adım adım immünohistokimyasal bir prosedür sağlanmaktadır. Açıklanan yöntemler sadece östrojen reseptör algılama ve in vivo östrojen sinyal araştırma için yararlı değil, aynı zamanda kolit gelişiminde rol olabilir diğer proteinler için uygulanabilir.

TNBS'ye bağlı Crohn hastalığı olan farelerde kolonların makroskopik özellikleri Kontrolden alınan kolonlar ve TNBS ile tedavi edilen farelerin temsili görüntüleri Şekil 2'degösterilmiştir. Crohn hastalığının TNBS kaynaklı modeli olan farelerde, kolon genişliği artarken kolon uzunluğu azalır.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60813/6...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Estrogen Receptors in Colons of Mice with TNBS-Induced Crohn's Disease using Immunofluorescence at JoVE.com

Visualization of Estrogen Receptors in Colons of Mice with TNBS-Induced Crohn's Disease using Immunofluorescence

Protokol, Crohn hastalığının tam doğrulanmış TNBS kaynaklı murine modelini ve parafine gömülü formalin-sabit kolon bölümlerinin immünororesansını kullanarak immünohistokimya ile östrojen reseptörlerinin görüntülenmesi için kullanılan yöntemleri sunar.

İmmünofluoresans kullanarak TNBS'ye Bağlı Crohn Hastalığı olan Farelerin Kolonlarında Östrojen Reseptörlerinin Görüntülenmesi

Crohn&#39;s disease is the most diagnosed type of inflammatory bowel disease. Chronic inflammation developing in the intestine leads to peristalsis ...

Artan kanıtlar fizyolojinin kolon parçası üzerinde östrojen sinyalin etkisini göstermektedir, immünohistokimya kolon östrojen reseptörlerini tanımlamak için umut verici bir tekniktir ve kolit haline gelişir. Biz kolon östrojen reseptörlerinin immünohistokimyasal görselleştirme için tam ve doğrulanmış bir protokol salıyoruz, immünoresans kullanarak. Lodz Üniversitesi Mikroskobik Görüntüleme Laboratuvarı'ndan Dr.Sylwia Michlewska ile birlikte prosedürü göstereceğiz.Bir petri kabına kolon yerleştirin. Bir ila iki santimetre parçalar halinde kolon kesin. Her parçayı uygun şekilde etiketlenmiş histolojik bir kasete süngerin üzerine yerleştirin.%4 paraformaldehit içinde kolon parçası içeren bir kaset yerleştirin. En az 24 saat 4 santigrat derecede kuluçkaya yat. 50%70%90%95 ve %100 etanol, ksilen %100 etanol ve sadece ksilen ve sıvı parafinde en az üç saatlik kuluçka için doku işlemcisini bir saatlik kuluçka için hazırlayın ve programlayın.Kolon parçasını histolojik bir kutuya aktarın. Kutuyu önceden programlanmış doku işlemcisine yerleştirin ve işlemciyi çalıştırın. Doku işlemci içinde kuluçka sonra histolojik kutusundan kolon kaldırmak ve bir metal kalıp kolon parçası yerleştirin, kolon iki ucu dik bir konumda olduğu gibi.Kalıbın üçte birini sıvı parafinle doldurun. Birkaç saniye için eksi beş derece santigrat de soğutma alanında kalıp yerleştirin ve sonra 70 santigrat derece De ısınma alanına kalıp hareket ettirin. Sonra histolojik kutunun alt kısmına kalıp yerleştirin ve sıvı parafin ile tüm kolon parçası kapağı.Birkaç dakika için soğutma alanında kolon parçası ve parafin içeren metal kalıp yerleştirin. Sonra kolon ve parafin blok metal kalıp kaldırın. Kolon ve parafin bloğunu en az 24 saat boyunca 4 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.Kuluçkadan sonra, bloktaki fazla parafini çıkarın. Kolon ve parafin bloğunu tam otomatik bir döner mikrotome yerleştirin. Kolon parçasını beş mikrometrekesite kesin.Bir kolon bölümünü önceden ısıtılmış 40 dereceye kadar su banyosuna aktarın. Su banyosundan kolon bölümünü kaldırmak ve 24 saat oda sıcaklığında cam slayt kuluçka yadamak için etiketli cam slayt kullanın. İlk olarak, beş dakika ksilen cam slayt kuluçka parafin çıkarın.Bu adımı üç kez tekrarlayın. Daha sonra cam kaydırağı beş dakika boyunca bire bir ksilen ve %100 etanol karışımına yerleştirin. Bu adımı üç kez tekrarlayın.Kolon bölümünü rehydrate için azalan etanol konsantrasyonları bir dizi kullanın. Beş dakika boyunca etanol slayt batırın. Bir sonraki konsantrasyona geçmeden önce her konsantrasyonda üç kez tekrarlayın.Cam kaydırağı akan suyun altında beş dakika durulayın. Antijen alma tamponu 95 ila 98 santigrat dereceye ısıtın. Sonra 10 dakika kaynar antijen alma çözeltisi cam slayt ısıtın.Reaktiflerin israfını önlemek için, kolon bölümü etrafında bir daire çizmek için bir hidrofobik kalem kullanın. Daha sonra, hidrojen peroksidaz ve su% 3 çözeltisi içinde 10 dakika boyunca slayt kuluçka. Beş dakika boyunca yıkama çözeltisi slayt yıkayın.Daha sonra oda sıcaklığında bir saat boyunca engelleme çözeltisi slayt kuluçka. Engelleme çözeltisini çıkarın ve E-R alfa, E-R beta veya seyreltilmiş G-P-E-R'a karşı 20 ila 50 mikrolitre primer antikor ekleyin. Ana antikorbir gecede karanlıkta dört derece yekpülatörde kuluçkaya yatırın.Antikor solüsyonunu çıkarın. Her seferinde beş dakika boyunca yıkama çözeltisinde kaydırağı üç kez yıkayın. Sonra, seyreltilmiş ikincil antikor ekleyin.Karanlıkta oda sıcaklığında bir saat boya ile konjuge ikincil antikor ile slayt kuluçka. İkincil antikor solüsyonu slayttan çıkarın. Her seferinde beş dakika boyunca yıkama çözeltisinde kaydırağı üç kez yıkayın.Membran görselleştirme silüasyon için seyreltilmiş florokrom ekleyin ve karanlıkta oda sıcaklığında 10 dakika kuluçka. Çözeltiyi çıkarın ve her seferinde beş dakika boyunca kaydırağı üç kez yıkayın. Gliserol bazlı sıvı DAPI birkaç damla ekleyin, hücre çekirdeği görselleştirme için bir florokrom, doğrudan kolon bölümünde.Bir kapak slayt ile dikkatlice kaplayın. Kolon kısmını en az 24 saat boyunca 4 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. 20x veya 63x hedefleri ve yağ daldırma içeren bir konfokal mikroskop altında kolon bölümü analiz edin.Çalışmada kullanılan antikorların özgüllüğü MCF-7 hücreleri kullanılarak doğrulandı. Östrojen reseptör antikorları nükleer östrojen reseptörlerinin E-R alfa ve E-R beta yanı sıra membranbağlı östrojen reseptörü G-P-E-R tespiti sağladı. Negatif kontrol de mcf-7 hücreleri sadece ikincil antikor florokrom ve DAPI ile gliserol bazlı sıvı ile boyanmış olduğu yapıldı.Kontrol farelerinden ve TNBS'ye bağlı Crohn hastalığına bağlı farelerden elde edilen kolon bölümlerinde güçlü bir E-R alfa sinyali bulundu. Ancak, sadece kontrol farelerinden elde edilen kolonlarda goblet hücresi sitoplazmasında E-R alfası lokalize edildi. Konfokal mikroskopide hem kontrol hem de TNBS ile tedavi edilen farelerin kolon kesitlerinde E-R betanın sitoplazmik lokalizasyonu saptandı.Benzer şekilde, kontrol farelerinden ve TNBS ile tedavi edilen farelerden elde edilen kolon bölümlerinde G-P-E-R'ın sitoplazmik lokalizasyonu belgelenmiştir. Kalıp içinde kolon doğru konumlandırma doğru kesit oluşturmak için esastır. Florokrom kendi uyarma ve emisyon spektrumu ile seçilmelidir.Bu yöntem kolit gelişiminde rol abilecek diğer proteinlere de uygulanabilir. İmmünofloresan ile immünohistokimya tespiti protein-protein yönü durumundaki diğer proteinleri lekelemek için uzatılabilir.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Etkili belirlenmesi tahlillerinde Peptit Agonistlerinin seri Seyreltme için Dağıtım Otomatik Akustik

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Proximity Ligation Testi ile Süspansiyon Hücre Kültürlerinde DNA Hasarına Bağlı Protein Komplekslerinin Saptanması ve Görselleştirilmesi

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Simple Elimination of Background Fluorescence in Formalin-Fixed Human Brain Tissue for Immunofluorescence Microscopy

İnsan beyninin Formalin sabit bir doku arka plan Floresans ayirt mikroskopi için basit ortadan kaldırılması

Immunofluorescence is a common method used to visualize subcellular compartments and to determine the localization of specific proteins within a tissue ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

X-ışını kristalografisi ve biyofiziksel teknikleri immünglobulin katlanmış glikoproteinlerin karakterizasyonu

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Identification of Orexin and Endocannabinoid Receptors in Adult Zebrafish Using Immunoperoxidase and Immunofluorescence Methods

Immunoperoksidan ve Immünofluoresesan yöntemlerini kullanarak yetişkin Zebrafisinde Orexin ve Endocannabinoid reseptörlerinin tanımlanması

Immunohistochemistry (IHC) is a highly sensitive and specific technique involved in the detection of target antigens in tissue sections with labeled ...

An In Vivo Estrogen Deficiency Mouse Model for Screening Exogenous Estrogen Treatments of Cardiovascular Dysfunction After Menopause

Menopoz Sonrası Kardiyovasküler Disfonksiyon Exogenous Östrojen Tedaviler Tarama için Bir In Vivo Östrojen Eksikliği Fare Modeli

Postmenopausal women are at greater risk of developing cardiovascular diseases than premenopausal women. Female mice ovariectomized (OVX) at weaning ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Amiloid Fibrils ile Beyin Mitokondrisi ile Etkileşimler ve Membran Permeabilizasyonu

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  ÃƒÅ½Ã‚Â² Reporter Assay

Hücre Tabanlı Östrojen Reseptörü Kullanarak Fitoöstrojen taraması β Reporter Assay

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...

Transplantation of Neonatal Mouse Cardiac Macrophages into Adult Mice

Yenidoğan Fare Kardiyak Makrofajların Yetişkin Farelere Nakli

In an injured neonatal myocardium, macrophages facilitate cardiomyocyte proliferation and angiogenesis and promote heart regeneration. The present study ...